高產(chǎn)蝦青素紅法夫酵母的代謝工程育種研究進(jìn)展

王 軍，張晴龍，李曦月，倪孟祥

(中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 210000)

20世紀(jì)30年代，在蝦、螃蟹等水生動物中萃取出一類淺紫紅色晶體物質(zhì)，后經(jīng)確認(rèn)為一類與蝦紅素有密切聯(lián)系的類胡蘿卜素，命名為蝦青素，又稱蝦黃素、蝦黃質(zhì)。蝦青素廣泛存在于蝦、蟹、魚、鳥以及多種微生物中，是一種雙環(huán)類胡蘿卜素，具有極強(qiáng)的抗氧化能力，其淬滅單線態(tài)氧和捕捉自由基的能力比β-胡蘿卜素高約10倍，比維生素E高500多倍，被稱為“超級維生素E”[1-2]。蝦青素還具有抗癌[3]、提高免疫力[4]、護(hù)肝[5]等作用以及良好的著色功效[6]。紅法夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)是美國科學(xué)家Phaff等在日本和北美發(fā)現(xiàn)的一種天然合成蝦青素的酵母，是目前報道的自然界中唯一天然合成3R,3′R右旋構(gòu)型蝦青素的酵母類菌株[7]。紅法夫酵母生命周期短，合成蝦青素速率較快，不要求強(qiáng)烈光線，可以使用各種葡萄糖作為碳源實現(xiàn)迅速異養(yǎng)新陳代謝，還可以在發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵，已成為目前工業(yè)化生產(chǎn)蝦青素的優(yōu)質(zhì)菌株。為提高蝦青素產(chǎn)量，研究人員通常采用隨機(jī)誘變方法選育高產(chǎn)蝦青素紅法夫酵母菌株；隨著分子生物學(xué)手段的不斷進(jìn)步，在分子水平對紅法夫酵母進(jìn)行基因改造以選育高產(chǎn)蝦青素菌株具有更大的應(yīng)用潛力。因此，作者在分析蝦青素結(jié)構(gòu)及代謝途徑的基礎(chǔ)上，對紅法夫酵母中蝦青素合成限速酶及高產(chǎn)蝦青素紅法夫酵母的代謝工程育種方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為天然蝦青素的產(chǎn)業(yè)化提供幫助。

1 蝦青素的結(jié)構(gòu)

從結(jié)構(gòu)上看，蝦青素是一種萜烯類化合物，也是類胡蘿卜素的一種。蝦青素的結(jié)構(gòu)比較特殊，除了具有類胡蘿卜素?fù)碛械挠啥鄠€共軛雙鍵組成的疏水性碳鏈外，其兩端還具有2個極性的β-紫羅酮環(huán)，每個紫羅酮環(huán)上都有1個羥基和1個羰基[8]，這種特殊的結(jié)構(gòu)使得蝦青素能橫跨細(xì)胞膜，在細(xì)胞膜內(nèi)外兩側(cè)起到傳遞氧自由基中高能電子的作用，使得蝦青素的抗氧化活性高于普通的類胡蘿卜素[9]。

蝦青素的天然構(gòu)型主要分為3R,3′R右旋構(gòu)型、3S,3′S左旋構(gòu)型、3R,3′S內(nèi)消旋構(gòu)型等3類旋光異構(gòu)體(圖1)。其中，3R,3′R右旋構(gòu)型和3S,3′S左旋構(gòu)型的抗氧化活性較高，而3R,3′S內(nèi)消旋構(gòu)型的抗氧化活性極低。一般來說，人工合成的蝦青素包括上述3種構(gòu)型[10]；天然蝦青素主要以單一的全反式構(gòu)型存在，主要來源于菌類、藻類以及一些浮游生物。如雨生紅球藻產(chǎn)蝦青素為3S,3′S左旋構(gòu)型，產(chǎn)量達(dá)到了細(xì)胞干重的4%；紅法夫酵母產(chǎn)蝦青素大多是3R,3′R右旋構(gòu)型，與南極磷蝦中蝦青素構(gòu)型基本相同，被認(rèn)為是最適于水生動物利用的蝦青素。

圖1 蝦青素的3類旋光異構(gòu)體Fig.1 Three kinds of optical isomers of astaxanthin

2 紅法夫酵母中蝦青素的代謝途徑

紅法夫酵母中蝦青素的合成主要依賴雙環(huán)途徑(圖2)。首先，乙酰輔酶A(AcCoA)在3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶(HMG-CoA synthase)的作用下合成HMG-CoA；接著，在HMG-CoA還原酶(HMG-CoA reductase)的催化下生成甲羥戊酸(MVA)；MVA通過一系列的酶催化反應(yīng)生成異戊二烯焦磷酸(IPP)；IPP是所有萜類化合物共同的前體，在異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶(IPP isomerase)的作用下生成二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)；3分子IPP和1分子DMAPP在牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶(GGPP synthase)的催化下生成GGPP；GGPP在八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase)和八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase)的作用下生成番茄紅素(lycopene)；然后，番茄紅素在番茄紅素環(huán)化酶(lycopene cyclase)的作用下生成β-胡蘿卜素；最后，在蝦青素合成酶作用下生成目標(biāo)產(chǎn)物蝦青素[11]。

圖2 紅法夫酵母中蝦青素的代謝途徑Fig.2 Metabolic pathway of astaxanthin in Xanthophyllomyces dendrorhous

3 紅法夫酵母中蝦青素的合成限速酶

過去幾十年，科研工作者在菌種選育方面的手段比較單一，主要是隨機(jī)誘變、優(yōu)化發(fā)酵工藝等。隨著分子生物學(xué)手段的不斷進(jìn)步，研究人員更多地通過基因工程手段構(gòu)建基因工程菌株，通過改變基因的表達(dá)來控制相關(guān)代謝流的限速酶，從而提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。表1為紅法夫酵母中蝦青素的合成限速酶。

表1 紅法夫酵母中蝦青素的合成限速酶

3.1 HMG-CoA還原酶

HMG-CoA還原酶，由HMGR基因編碼。HMG-CoA還原酶是MVA途徑的一個限速酶。由于紅法夫酵母中蝦青素的合成主要來自于MVA途徑，因而HMG-CoA還原酶是蝦青素上游基因調(diào)控的第一個重要限速酶。研究人員通過表達(dá)HMGR基因，可以促進(jìn)MVA的合成，從而可以使碳流更多地流向蝦青素[12]。

3.2 IPP異構(gòu)酶

IPP異構(gòu)酶是MVA途徑中最后一個重要的限速酶，由idi基因編碼。IPP異構(gòu)酶的主要功能是催化IPP生成DMAPP，而DMAPP是GGPP的前體物質(zhì)。因而，通過控制IPP異構(gòu)酶的活性可以控制整個蝦青素的代謝。Wang等[13]將海洋細(xì)菌中的crt基因簇導(dǎo)入到大腸桿菌中，從而過表達(dá)蝦青素代謝途徑基因，蝦青素產(chǎn)量提高到1.25 mg·g-1，表明控制蝦青素代謝途徑基因表達(dá)的確可以控制蝦青素的合成，但是這些基因在原核與真核生物中的具體作用有待進(jìn)一步探究。

3.3 GGPP合成酶

GGPP合成酶是催化IPP和DMAPP合成GGPP的限速酶。研究顯示，大多數(shù)類胡蘿卜素都是通過異戊二烯化合物途徑合成，這個途徑的前體物質(zhì)是IPP。GGPP作為萜類化合物的前體，是很多萜類化合物以及類胡蘿卜素的骨架，而且GGPP是絕大多數(shù)代謝物的前體，因而GGPP可以在上游調(diào)節(jié)許多產(chǎn)物的碳流量。GGPP合成酶是原核與真核生物體內(nèi)最重要的限速酶之一[14]。

3.4 八氫番茄紅素合成酶和番茄紅素環(huán)化酶

八氫番茄紅素合成酶和番茄紅素環(huán)化酶均由crtYB基因編碼，其中，八氫番茄紅素合成酶可以催化GGPP合成八氫番茄紅素，番茄紅素環(huán)化酶可以催化番茄紅素環(huán)化合成β-胡蘿卜素。紅法夫酵母中的crtYB基因目前已經(jīng)得到分離。八氫番茄紅素合成酶被ATP(作為輔底物)和二價陽離子(Mn2+或Mg2+)激活，卻受無機(jī)磷酸的抑制。在類胡蘿卜素的代謝途徑中，八氫番茄紅素合成酶是最關(guān)鍵的限速酶，控制著整個類胡蘿卜素的代謝途徑[15]。研究顯示，僅僅提高番茄紅素環(huán)化酶的表達(dá)量，無法顯著提高蝦青素產(chǎn)量。因而可以推測，僅僅單一地過表達(dá)某一個相關(guān)的基因，雖然可以調(diào)節(jié)相關(guān)類胡蘿卜素產(chǎn)量，但對蝦青素產(chǎn)量的影響不大[16]。

3.5 八氫番茄紅素脫氫酶

在蝦青素代謝途徑中，八氫番茄紅素脫氫酶是由crtI基因編碼的一種重要的脫氫酶，也是催化八氫番茄紅素發(fā)生多步連續(xù)脫氫反應(yīng)依次生成不同碳碳雙鍵飽和度的脫氫產(chǎn)物的關(guān)鍵限速酶。有研究人員對八氫番茄紅素脫氫酶催化的多步連續(xù)脫氫反應(yīng)的脫氫步數(shù)進(jìn)行了探究。Arnold團(tuán)隊[17]采用序列比對的理性設(shè)計方法對發(fā)生四步脫氫反應(yīng)的歐文氏菌來源的crtI基因進(jìn)行單點突變改造，分別獲得了合成鏈孢紅素以及六步脫氫產(chǎn)物3,4-3′,4′-脫氫番茄紅素的突變體。

3.6 蝦青素合成酶

蝦青素合成酶是蝦青素代謝途徑中的最后一個重要的限速酶。在光合細(xì)菌中，β-胡蘿卜素到蝦青素的合成過程由β-胡蘿卜素羥化酶和β-胡蘿卜素酮化酶催化，但是在紅法夫酵母中沒有分離到相關(guān)的酶。研究表明，在紅法夫酵母中，催化合成蝦青素的酶是一種細(xì)胞色素P450單加氧酶，由crtS基因編碼。通過過表達(dá)crtS基因，可以提高β-胡蘿卜素向蝦青素的轉(zhuǎn)化率[16]。

4 紅法夫酵母代謝工程育種方法

4.1 過表達(dá)蝦青素內(nèi)源性基因

內(nèi)源性基因主要指蝦青素代謝途徑中表達(dá)相關(guān)限速酶的基因，通過增加這些基因的拷貝量來提高相關(guān)限速酶的表達(dá)，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)化率。Gassel等[18]通過游離表達(dá)紅法夫酵母中蝦青素代謝途徑相關(guān)基因，包括crtE、crtYB、crtS，使得蝦青素產(chǎn)量提高了20多倍。宋熙[19]向紅法夫酵母中導(dǎo)入質(zhì)粒，過表達(dá)crtE基因，使得自帶啟動子和帶有g(shù)pd強(qiáng)啟動子的菌株的蝦青素產(chǎn)量顯著提高。Ledetzky等[20]向紅法夫酵母中轉(zhuǎn)化了最多3個拷貝的crtYB基因，總類胡蘿卜含量測定結(jié)果表明，重組子中八氫番茄紅素合成酶已接近飽和；crtYB基因拷貝數(shù)的增加也影響了類胡蘿卜素的組成，細(xì)胞中積累了大量合成蝦青素的底物和中間體，通過與蝦青素合成酶基因的額外轉(zhuǎn)化，它們可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為蝦青素。Chi等[21]通過過表達(dá)蝦青素代謝途徑中的蝦青素合成酶，使得蝦青素產(chǎn)量提高了33.5%，與蝦青素合成相關(guān)的其它限速酶的表達(dá)量也得到了相應(yīng)提高。

4.2 異源表達(dá)外源性基因

研究人員以往大多是通過調(diào)控內(nèi)源性基因來控制代謝流，提高蝦青素產(chǎn)量，但由于紅法夫酵母中內(nèi)源性基因種類的局限性，導(dǎo)致能夠改變的代謝流有限。因此，研究人員轉(zhuǎn)為調(diào)控外源性基因，比如向紅法夫酵母中導(dǎo)入一些光合細(xì)菌或者藻類的蝦青素代謝途徑基因等。金超[22]將來源于雨生紅球藻的β-胡蘿卜素酮化酶編碼基因(bkt)和來源于歐文氏細(xì)菌的β-胡蘿卜素羥化酶編碼基因(crtZ)導(dǎo)入到產(chǎn)β-胡蘿卜素紅法夫酵母突變株內(nèi)，首次實現(xiàn)了在紅法夫酵母中合成3S,3′S左旋構(gòu)型的蝦青素。Breitenbach等[23]以經(jīng)過基因工程改造的僅積累β-胡蘿卜素的紅法夫酵母為底盤細(xì)胞，導(dǎo)入異源的crtZ基因，通過同源重組，將crtZ基因整合到核糖體DNA上去，最終生成5.2 mg·g-1的玉米黃素。

4.3 敲除旁支基因

除了過表達(dá)蝦青素代謝途徑中的限速酶外，還可以通過敲除蝦青素代謝途徑外的非致死基因使碳流更多地流向目標(biāo)產(chǎn)物。通常使用的基因敲除方法主要有同源重組敲除法、Cre/loxp系統(tǒng)以及近年比較熱門的CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因敲除。雖然CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)非常成熟，但是將其應(yīng)用到紅法夫酵母鮮有報道。Yamamoto等[24]通過敲除cyp61基因消除HmgS和HmgR的反饋抑制，蝦青素產(chǎn)量提高了數(shù)倍。張寧[25]成功建立了紅法夫酵母CRISPR/Cas9基因編輯平臺，利用同源重組敲除法對類胡蘿卜素合成的競爭途徑甾醇代謝途徑的erg27和cyp61基因進(jìn)行雙敲除，蝦青素產(chǎn)量明顯提高，為高產(chǎn)蝦青素紅法夫酵母的選育奠定了基礎(chǔ)。

5 展望

近幾十年來，科研工作者對紅法夫酵母發(fā)酵產(chǎn)蝦青素的研究取得了許多重要的成果，但仍有很多問題需要解決：產(chǎn)量較低、生產(chǎn)成本較高、無法工業(yè)化生產(chǎn)等。為提高蝦青素產(chǎn)量，科研人員采取多種方法改造菌株，基因編輯是目前研究的熱點，CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為基因編輯中比較熱門的手段被應(yīng)用到紅法夫酵母中以提高蝦青素產(chǎn)量，如何有效地應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)提高蝦青素產(chǎn)量是天然蝦青素工業(yè)化生產(chǎn)的一個重要突破口。相信，隨著發(fā)酵工藝的不斷優(yōu)化、優(yōu)勢菌株的不斷選育，天然蝦青素的高效工業(yè)化生產(chǎn)必將實現(xiàn)。