TDP-43、LC3在多發(fā)性肌炎及散發(fā)性包涵體肌炎中的表達及其作用

曾國勇 曾祥俊 葉 瑾

1.江西省贛州市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江西贛州 341000；2.江西省贛州市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，江西贛州 341000

散發(fā)性包涵體肌炎（IBM）是特發(fā)性炎性肌病的一種亞型，老年人下肢近端和手指的個別屈肌無力是其典型表現(xiàn)。IBM 疾病的臨床進展較慢，常規(guī)免疫抑制治療通常效果差，最終可導致嚴重的殘疾。IBM 的發(fā)病機理非常復雜，目前尚未完全了解[1-2]。臨床上，IBM 必須區(qū)別于多發(fā)性肌炎（PM），后者是另一種富含T 細胞的炎性肌病，表現(xiàn)為彌漫性主要組織相容性復合體（MHC）-Ⅰ表達上調(diào)[3]，因為兩種疾病對皮質(zhì)類固醇激素治療的反應(yīng)明顯不同，PM 通常效果良好，IBM 則幾乎沒有反應(yīng)。臨床常出現(xiàn)一部分IBM 患者被誤診為慢性PM 的情況，并接受了不必要的類固醇治療[4]。鑒于當前診斷標準的局限性，研究者們做出了巨大的努力去發(fā)現(xiàn)具有更高靈敏度的IBM 免疫組織化學標志物。目前蛋白質(zhì)聚集被認為在IBM 發(fā)病機制中具有核心作用，因此人們認為尋找與去除異常聚集蛋白有關(guān)的標志物可能用于鑒別IBM 和PM[5]。研究顯示，鑲邊空泡（RVs）的形成都與自噬的損害存在一定相關(guān)性，自噬障礙導致自噬體積累積，這可能與自噬蛋白LC3、TDP-43 有關(guān)[6]。因此，本研究通過免疫組化法、Western blot 法等分析PM 組和IBM 組骨骼肌中TDP-43、LC3 陽性表達率及蛋白含量的差異性，進而探究TDP-43、LC3 在PM 及IBM 中的表達及其作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年3月～2019年9月我院收治的PM（26 例）、IBM（26 例）患者的中等受累肌肉進行活檢，并避開肌電圖穿刺點，同時保證動作輕柔未過度牽拉或擠壓所取的肌肉組織，大小約0.5 cm×1.0 cm×0.5 cm，并快速冷凍。將PM 患者取出肌肉組織作為PM 組，將IBM 患者取出肌肉組織作為IBM 組。PM 組和IBM組患者性別、肌肉組織選取部位、年齡、病程等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準，參與研究的患者均簽署知情同意書。

表1 兩組一般資料的比較

1.2 實驗儀器與試劑

臺式低速離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司，型號：TD4K）；萊卡冰凍切片機（北京海天友誠科技有限公司，型號：CM1850）；全自動免疫組化儀（上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司，型號：MY-2300）。

1.3 免疫組化法檢測PM 組和IBM 組TDP-43、LC3的表達

將肌肉組織進行常規(guī)脫蠟及水化，加入2%甲醛溶液，固定，乙醇脫水，石蠟切片，切成長寬高為1.5 μm×1.5 μm×1.5 μm 的塊狀，沖洗，室溫封閉，滴加一抗，37℃放置30～40 min，沖洗，滴加生物素化二抗（二抗試劑盒）37℃放置40 min，沖洗，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，水洗終止反應(yīng)，蘇木精復染，分化，梯度酒精脫水干燥，中性樹膠封固。

1.4 Western blot 法檢測PM 組 和IBM 組TDP-43、LC3 蛋白的含量

洗凈烘干電泳槽及其他部件，制備12%分離膠，制作1 cm 的水層。將電泳裝置放置聚膠1 h，配制灌注成層膠。90 V 電泳，溴酚藍倒入分離膠，取出凝膠，放入聚偏二氟乙烯（PVDF）膜5～10 s。冰浴，雜交液稀釋一抗，β-actin：1∶1000。清洗3 次，把PVDF 膜放入對應(yīng)的二抗中常溫孵育1.5 h，輕輕晃動。加入加入電化學發(fā)光（ECL）溶液和B 混合液約1 min，PVDF 膜檢測采用自動化學發(fā)光成像分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間兩兩比較采用t 檢驗，計數(shù)資料采用頻數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組肌肉組織中TDP-43、LC3 陽性表達量

IBM組肌肉組織中TDP-43、LC3 陽性表達高，PM組肌肉組織中TDP-43、LC3 陽性表達量低，兩組比較，IBM 組肌肉組織中TDP-43、LC3 陽性表達明顯高于PM 組（圖1，封四）。

圖1 兩組肌肉組織中TDP-43、LC3 陽性表達（蘇木精染色，400×）

2.2 兩組肌肉組織中TDP-43、LC3 蛋白含量

Western blot 法結(jié)果顯示：IBM 組肌肉組織中TDP-43、LC3 蛋白含量高于PM 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2）。

圖2 兩組肌肉組織中TDP-43、LC3 蛋白含量

3 討論

IBM 與PM 由于對免疫抑制治療的效果明顯不同，且預后不同，因此病理診斷至關(guān)重要，特別是專家發(fā)現(xiàn)兩類患者臨床評估結(jié)果類似時。當然，IBM 與PM 存在明顯的組織學重疊導致病理上的鑒別也很困難[7-8]。本研究定量評估了兩種免疫組織化學標志物LC3、TDP-4 在區(qū)分IBM 和PM 診斷方面的價值，結(jié)果顯示IBM 組肌肉組織中TDP-43、LC3 陽性表達更高，PM 組肌肉組織中TDP-43、LC3 陽性表達量更低，IBM 組肌肉組織中TDP-43、LC3 陽性表達高于PM 組（P＜0.05）。Western blot 法檢測結(jié)果顯示，PM 組肌肉組織內(nèi)的TDP-43、LC3 蛋白含量最低，IBM 組肌肉組織內(nèi)的TDP-43、LC3 蛋白含量最高，IBM 組肌肉組織中TDP-43、LC3 蛋白含量高于PM 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。IBM 發(fā)病機制的一種模型表明，細胞質(zhì)蛋白的積累是逐步發(fā)生的，首先發(fā)生自噬通量受損（通過LC3 累積檢測到），隨后發(fā)生TDP-43 和其他錯誤折疊的蛋白質(zhì)的聚集，進而出現(xiàn)IBM，病情逐步加重[9]。研究發(fā)現(xiàn)，TDP-43、LC3 表達水平與IBM 的形成及增長有顯著相關(guān)性，在患者體內(nèi)TDP-43、LC3陽性數(shù)量越多則病情越嚴重[10-11]。實驗得出，IBM患者TDP-43、LC3 陽性表達率顯著高于健康人群，得出TDP-43、LC3 可能參與了IBM 的發(fā)生及發(fā)展[12]。研究顯示，在PM 患者體內(nèi)，TDP-43、LC3 表達水平均比健康人體高[13]。研究人員建議采用免疫組化法區(qū)分IBM、PM，在肌肉活檢中使用LC3 面板和TDP-43 抗體：LC3 臨界值＜14% FS 可以幫助排除IBM，而TDP-43＞7% FS 強烈支持IBM 診斷。由于TDP-43＞7%FS 對IBM 診斷具有很高的特異性，因此TDP-43 免疫組化可以在臨床病史無法區(qū)分或病情不典型的情況下使用[14]。同時，有學者研究得出，IBM 與PM 患者體內(nèi)TDP-43、LC3 表達水平不相同，且IBM患者體內(nèi)TDP-43、LC3 表達水平明顯較高，因此，臨床中可采用鑒別TDP-43、LC3 的方法來區(qū)分兩種疾病[15]，與本研究結(jié)論一致。

綜上所述，TDP-43、LC3 在IBM 骨骼肌標本中更易表達，可作為與PM 鑒別診斷的指標之一。