閃式提取法提取山藥中薯蕷皂素的工藝研究

趙明蕊 辛夢(mèng)雨 任相蓮

1.河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，河南新鄭 451191；2.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州 450000

薯蕷皂素，又稱為薯蕷皂苷元（diosgenin），可由薯蕷皂苷水解而來，分子結(jié)構(gòu)式見圖1，是合成甾體激素藥物的基礎(chǔ)原料和起始中間體[1-3]，而且有祛痰、降脂、抗炎、抗腫瘤等作用，具有較高的藥用價(jià)值[2-4]，山藥為薯蕷類作物[2]，從山藥中提取薯蕷皂素對(duì)綜合開發(fā)利用懷山藥，促進(jìn)農(nóng)民增收，幫助農(nóng)戶脫貧致富具有一定的指導(dǎo)作用。目前，薯蕷皂素提取方法很多，主要是傳統(tǒng)的先水解后提取法，先提取后水解法，以及超臨界CO2法，表面活性劑法及改進(jìn)的超聲波法等[1，4-6]，但大都在較高溫度或高壓下進(jìn)行，且耗時(shí)較長(zhǎng)，因此開發(fā)快速高效的提取方法具有較高的應(yīng)用價(jià)值。已有研究表明，相比于索式提取（0.26%）及超聲提?。?.32%）的提取率，閃式提取法提取山藥中的薯蕷皂素，提取率高達(dá)0.50%[7]，但該研究未提及提取溶劑，且未對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，在實(shí)踐中缺乏可操作性?；谇捌趯?duì)薯蕷皂素的溶解度[8]和超臨界提取方法的研究[9]，本實(shí)驗(yàn)先對(duì)薯蕷皂素閃式提取法的提取溶劑進(jìn)行選擇，再通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳工藝，以達(dá)到可實(shí)踐性強(qiáng)，且提取快速、高效、節(jié)能的目的，為山藥的進(jìn)一步綜合利用提供理論依據(jù)。

圖1 薯蕷皂素的分子結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山藥（焦作溫縣）；乙醇、碳酸鈉、80%乙醇、石油醚（60～90℃）、高氯酸，均為分析純（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；閃式提取器、刮膜閃蒸儀（北京金鼐科技發(fā)展有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠，RE-52AA）；紫外可見分光光度計(jì)（北京萊伯泰儀器有限公司）；電子分析天平（梅特勒-托利多）；電熱恒溫水?。ㄉ虾Ｑ畼穬x器有限公司）；TDL-5-A型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 薯蕷皂素的制備 取懷山藥，去皮，切片，干燥，加入含5%硫酸的提取溶劑后，用閃式提取器進(jìn)行提取后，離心分離后，取上清液，加熱水解至規(guī)定時(shí)間，回收有機(jī)溶劑，冷卻，使用飽和碳酸鈉溶液中和，離心分離得到濾渣，將濾渣置于干燥皿在80℃烘箱中干燥，即得到水解物。

將上述干燥的水解物加入石油醚，用閃式提取器提取后，轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，常壓回收石油醚至干，即得薯蕷皂素粗品。將上述粗品加20～30mL 95%乙醇加熱溶解。放置析出結(jié)晶，抽濾，移取結(jié)晶，烘干，即得薯蕷皂素精品[10]，計(jì)算得率。薯蕷皂素得率的測(cè)定：得率（mg/g）=提取的薯蕷皂素的質(zhì)量（mg）/原料的質(zhì)量（g）

1.2.2 薯蕷皂素含量的測(cè)定 根據(jù)參考文獻(xiàn)[11]稍加變化測(cè)定薯蕷皂素的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)品3.0mg，在105℃干燥至恒重，加石油醚于25mL容量瓶定容，混勻，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.12mg/mL）備用。精密吸取1、2、3、4、5、6mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL帶刻度小試管中，揮發(fā)溶劑，加高氯酸10mL，置于30℃水浴中保溫15min，取出冷卻至室溫，測(cè)定吸光度A。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，求得回歸方程為A=0.152 95C+0.0618，其中C為薯蕷皂素濃度（g/L），A為吸光度，由圖2可以看出，薯蕷皂素含量和吸光度在0.12～0.62g/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。

圖2 薯蕷皂素濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

按上述方法將制備的薯蕷皂素供試品配成溶液：準(zhǔn)確吸取一定量供試品溶液于10mL比色管中，待溶劑揮發(fā)后，加高氯酸10mL，置于30℃水浴中保溫15min，取出冷卻至室溫，在410nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)吸光度，稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍區(qū)間，并計(jì)算供試品中薯蕷皂素的濃度。

1.2.3 薯蕷皂苷提取溶劑的選擇 分別以乙醇+正丁醇（1∶1）[8]、80%乙醇[10]及70%甲醇[11]為提取溶劑對(duì)山藥中的薯蕷皂素進(jìn)行提取，考察薯蕷皂素的得率。

1.2.4 薯蕷皂苷提取料液比的選擇 準(zhǔn)確稱取山藥樣品25g置于閃式提取器中，分別控制提取溶劑體積與樣品的物料比1∶6、1∶8、1∶10、1：12、1∶14、1∶16，設(shè)定提取1次和提取時(shí)間2min，進(jìn)行閃式提取。然后按照“1.2.1”項(xiàng)方法制備得薯蕷皂素精品。取一定量溶解，按“1.2.2”項(xiàng)方法測(cè)定，計(jì)算薯蕷皂素得率。

1.2.5 薯蕷皂苷提取水解時(shí)間的選擇 準(zhǔn)確稱取樣品25g置于閃式提取器中，加入250mL提取溶劑，設(shè)定提取時(shí)間2min，進(jìn)行閃式提取。提取液加熱回流1、2、3、4、5h進(jìn)行水解。然后按照“1.2.1”項(xiàng)方法制備得薯蕷皂素精品。取一定量溶解，按“1.2.2”項(xiàng)方法測(cè)定，計(jì)算薯蕷皂素得率。

1.2.6 薯蕷皂苷提取次數(shù)的選擇 準(zhǔn)確稱取樣品25g置于閃式提取器中，加入250mL提取溶劑，設(shè)定提取時(shí)間2min，進(jìn)行閃式提取，提取次數(shù)為1、2、3次。每一次的提取液按照“1.2.1”項(xiàng)方法制備得薯蕷皂素精品。取一定量溶解，按“1.2.2”項(xiàng)方法測(cè)定，計(jì)算薯蕷皂素得率。

1.2.7 水解物薯蕷皂素提取條件的優(yōu)化 以石油醚（60～90℃）為溶劑，進(jìn)行閃式提取，根據(jù)初步試驗(yàn)結(jié)果，考察石油醚料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)3個(gè)因素（每個(gè)因素確定3個(gè)水平）對(duì)山藥中薯蕷皂素得率的影響。按照正交實(shí)驗(yàn)表L9（34）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，見表1，以薯蕷皂素得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行直觀法和方差分析法分析其結(jié)果，以獲得山藥中提取薯蕷皂素的最佳工藝條件。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素及水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 薯蕷皂苷提取溶劑的選擇

以乙醇+正丁醇（1∶1）、80%乙醇及70%甲醇為溶劑時(shí)，山藥中薯蕷皂素的得率分別為5.08、7.65、7.41mg/g?？赡苌剿幹兄T多共存的其他成分，影響薯蕷皂苷在各種溶劑中的溶解性，而且薯蕷皂苷屬于甾體皂苷，在植物體內(nèi)與糖結(jié)合成苷，極性較大，在80%乙醇及70%甲醇中溶解度較高，雖然經(jīng)水解得到的薯蕷皂素（薯蕷皂苷元）極性較小，可能在乙醇+正丁醇（1∶1）溶解度會(huì)增加，但首先需要把薯蕷皂苷提取出來，才能獲得薯蕷皂素，從而提高薯蕷皂素的得率，因此選擇含水醇為提取溶劑。此外，雖然80%乙醇及70%甲醇為提取溶劑，薯蕷皂素的得率相差不大，但考慮到溶劑的毒性程度，選擇了80%乙醇。

2.2 薯蕷皂苷提取料液比的選擇

在閃提2min條件下，80%乙醇體積用量增加對(duì)薯蕷皂素得率的影響見圖3，結(jié)果表明，80%乙醇用量增加可以在一定程度提高薯蕷皂素的得率，但當(dāng)體積增加超過250mL，80%乙醇體積用量的增加對(duì)薯蕷皂素得率的影響基本不會(huì)發(fā)生較大的變化，因此選擇料液比為1∶10。

圖3 薯蕷皂素得率隨80%乙醇體積用量的變化

2.3 薯蕷皂苷水解時(shí)間的選擇

在80%乙醇體積用量250mL，料液比1∶10情況下，閃提時(shí)間2min時(shí)，薯蕷皂素得率與閃提時(shí)間的關(guān)系見圖4，在2h時(shí)，得率已趨于穩(wěn)定，隨著時(shí)間的增加，薯蕷皂素的得率略有下降，因?yàn)?h后皂苷已水解完全，在3、4h皂苷元得率處于一種平穩(wěn)趨勢(shì)，也證明了反應(yīng)已經(jīng)基本完全，隨著水解時(shí)間的繼續(xù)增加，容易造成部分薯蕷皂苷元轉(zhuǎn)化成△3，5-雙烯的結(jié)構(gòu)[1]。所以薯蕷皂苷水解2h為最佳水解時(shí)間。

圖4 薯蕷皂素得率隨水解時(shí)間的變化

2.4 薯蕷皂苷提取次數(shù)的選擇

以5%硫酸的80%乙醇溶液，提取薯蕷皂苷1、2、3次，每次提取液水解2h后，繼續(xù)后續(xù)操作，提取薯蕷皂素，其提取率分別為7.62、0.03、0.01mg/g，說明雖然提取2、3次還能繼續(xù)提取出少量薯蕷皂素，但經(jīng)1次提取后，薯蕷皂苷已經(jīng)完全提取?？紤]到能耗，選擇薯蕷皂苷提取1次。

2.5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

選擇提取因素A（料液比）、B（提取次數(shù)）、C[提取時(shí)間（min）]、D（空白）四因素的三水平做正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)薯蕷皂素得率（mg/g）結(jié)果進(jìn)行分析，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表

由表2數(shù)據(jù)方差分析可知，料液比和閃提次數(shù)對(duì)得率的影響顯著，閃提時(shí)間對(duì)得率影響較小。從正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果極差分析可知，最佳提取工藝為A2B3C1D2，即最佳工藝條件為料液比為1∶10，提取3次，提取時(shí)間2min。雖然提取第2次，第3次還能繼續(xù)提取出少量薯蕷皂素，但經(jīng)1次提取后，薯蕷皂苷已經(jīng)基本提取完全?？紤]到能耗，選擇薯蕷皂苷提取1次。

由結(jié)果可知，可利用薯蕷皂素不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑的性質(zhì)，利用石油醚進(jìn)行提取，但單位質(zhì)量薯蕷皂苷水解產(chǎn)生的薯蕷皂素的量是一定的，所以提取溶劑石油醚的用量并非越多越好，而是存在最佳值，即1∶10。

2.6 閃式提取的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照選定的條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，得率分別為8.15、8.16、8.11mg/g，平均值為8.14mg/g，均高于表中其他組合的得率，說明優(yōu)化的薯蕷皂素提取工藝是合理的。

3 討論

薯蕷皂素的分光光度法測(cè)定，具有操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，且經(jīng)過較系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究表明，該法的測(cè)定結(jié)果與GC、HPLC測(cè)定結(jié)果基本一致[11-12]，因此本研究以高氯酸為顯色劑，用分光光度法測(cè)定其含量。

在中藥提取工藝中，與回流法、浸漬法、滲漉法、索氏提取法，超聲提取法相比，閃式提取法具有簡(jiǎn)便、安全、節(jié)能、污染小及收率高等優(yōu)勢(shì)[13-14]，被認(rèn)為是一種既能促進(jìn)中藥化學(xué)成分提取技術(shù)發(fā)展，又能加快中藥制劑的制取速度[15-16]，已被廣泛用于皂苷[16-17]、木脂素[18]、黃酮[19]、多糖[20]、油脂[21]等多種成分的提取。采用2次閃式提取法對(duì)山藥中的薯蕷皂素進(jìn)行提取，最佳工藝條件為：5%硫酸的80%乙醇溶液，料液比1∶10，閃式提取1次，提取時(shí)間2min后，加熱水解2h，離心分離，取上清液，回收溶劑，收集殘?jiān)?，冷卻，使用1%碳酸鈉溶液中和，離心分離得到濾渣，將濾渣置于干燥皿在80℃烘箱中干燥，所得水解物以石油醚進(jìn)行提取，此時(shí)的料液比為1∶10，再次閃式提取1次，提取時(shí)間2min，閃式提取器的主要理論依據(jù)是中藥組織內(nèi)部的各種有效成分在合適溶劑的存在下，隨著高速粉碎與攪拌的外力，細(xì)胞組織碎裂、有效分子解離、使組織外圍溶劑溶解，從而形成新的平衡體系，迅速實(shí)現(xiàn)藥材組織內(nèi)外有效分子濃度的均衡，進(jìn)而達(dá)到快速提取的目的。本實(shí)驗(yàn)使用2次閃式提取的優(yōu)化方法，使薯蕷皂苷和薯蕷皂素的提取在數(shù)分鐘內(nèi)即可完成，大大節(jié)約了能源；此外，本工藝的得率為0.814%，而未優(yōu)化的閃式提取法得率為0.50%，也說明了本工藝的可行性。

酸水解法進(jìn)行薯蕷皂素的提取的原理是通過強(qiáng)酸作用破壞植物細(xì)胞壁，從而破壞連接薯蕷皂素的皂苷鍵，水解生成苷元和糖類[22]。而直接酸水解時(shí)，因根莖中含量較高的纖維素和淀粉也被水解，硫酸消耗巨大，而且最后的酸水外排，造成環(huán)境污染。本研究的閃式提取，使用5%硫酸與80%乙醇溶液，在2min內(nèi)即可快速破壞細(xì)胞壁，使薯蕷皂苷釋放到溶液中，且以乙醇為溶劑，又較大程度避免了纖維素和淀粉進(jìn)入提取液，避免共存的雜質(zhì)成分對(duì)薯蕷皂苷水解的干擾。此外，加熱提取液進(jìn)行酸水解，使薯蕷皂苷在溶液狀態(tài)下水解，既可降低酸用量（從傳統(tǒng)的10%[10]降至5%），又可縮短水解時(shí)間（使薯蕷皂苷從文獻(xiàn)報(bào)道的最佳5.5h[1]，降低至本實(shí)驗(yàn)的2h），而且在回收有機(jī)溶劑后的水溶液中，使用飽和碳酸鈉溶液中和，減少了酸排放。因此，閃式提取法提取薯蕷皂素是一種快速、高效、環(huán)保的提取方法，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。