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    大豆GmAGL8基因功能在擬南芥中的初步鑒定

    2020-11-21 05:37:42劉媛媛陸婉瑤秦雅菲楊翊暉
    關(guān)鍵詞:果莢角果突變體

    劉媛媛,陸婉瑤,劉 雙,秦雅菲,楊翊暉,丁 晨,郭 蓓,2**

    (1.北京農(nóng)學(xué)院 a.植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,b.北京農(nóng)學(xué)院生物與資源環(huán)境學(xué)院;2.中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室,北京 102206)

    大豆的豆莢是莢果的一種,大豆的成熟期,豆莢的背縫線與腹縫線開裂從而種子從豆莢散出的現(xiàn)象稱為炸莢(Pod-shattering)[1-2]。大豆的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,豆莢的炸裂會對產(chǎn)量造成嚴重的影響。易炸莢品種與中度炸莢的品種造成的減產(chǎn)可以達到57~175 和0~186 kg/hm2[3]。炸莢在其他油料作物和豆科作物中也有發(fā)現(xiàn)[4]。

    植物MADS-box基因家族在植物生長發(fā)育過程中起著非常重要的作用[5],控制許多發(fā)育過程,包括根、花還有果實的發(fā)育[6]。擬南芥中的FRUITFULL(FUL)基因?qū)儆贛ADS-box基因家族,研究表明該基因起到調(diào)控擬南芥開花時間、花分生組織的分化、莖生葉的發(fā)育以及心皮與果實的發(fā)育的作用。徐勇等研究了桃樹(Prunuspersica)中與擬南芥FUL同源的基因PpMADS6,過表達PpMADS6的擬南芥植株出現(xiàn)了花期提前,單花器官增多,成熟期的角果不易開裂等一系列性狀[7]。AGL8基因也被稱作AGAMOUS-like8,F(xiàn)RUITFULL,F(xiàn)UL等,前人的研究發(fā)現(xiàn),AGL8基因?qū)π钠さ陌l(fā)育和分裂組織的分化起到調(diào)控作用[8-9]。中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室李冉陽[10]通過同源擴增從大豆中克隆得到與擬南芥FUL基因相似的GmAGL8基因,同時對GmAGL8進行了生物信息學(xué)分析,比對了GmAGL8與桃PpMADS6和擬南芥FUL的核酸序列,相似度分別為 80% 和 77% ,三者的氨基酸序列同源性為74%。在GmAGL8中發(fā)現(xiàn)與MADS基因家族相似的MEF2,并找到可能與多聚體的形成有關(guān)的K-box基因。為了進一步驗證GmAGL8的功能,本試驗將構(gòu)建的過表達GmAGL8的載體(pCAMBIA1300∷GmAGL8)和反義抑制表達GmAGL8的載體(pCAMBIA1300∷antiGmAGL8)轉(zhuǎn)入擬南芥中,觀察轉(zhuǎn)基因后代的表型變化,以驗證大豆GmAGL8基因的功能。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    植物材料:擬南芥(Columbia),擬南芥agl8突變體(購自英國諾丁漢大學(xué));表達載體:中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室構(gòu)建的GmAGL8過表達載體pCAMBIA1300∷GmAGL8,GmAGL8反義抑制表達載體pCAMBIA1300∷antiGmAGL8;供試農(nóng)桿菌:LBA4404;抗生素:卡那霉素;購自北京擎科生物科技有限公司的T5 Direct PCR Kit(Plant)及遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)基礎(chǔ)試劑。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 擬南芥的室內(nèi)培養(yǎng) 將擬南芥種子置于4 ℃冰箱低溫春化48 h后播種,萌發(fā)兩周后移栽,培養(yǎng)土為泥炭土∶蛭石∶珍珠巖3∶3∶1的混合土。培養(yǎng)室內(nèi)溫度設(shè)置為26 ℃,每天16 h光照/8 h黑暗,光強1 500 lx,空氣相對濕度55%~65%。擬南芥喜濕,在培養(yǎng)過程中要注意保持空氣相對濕度,同時防止土壤染菌。

    1.2.2 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化(花浸法) 將含有陽性轉(zhuǎn)化子的農(nóng)桿菌菌液擴大培養(yǎng),收集菌體。配置1/2MS液體培養(yǎng)基100 mL,加入20 μL的silwetL-77,重懸菌體使OD600重新達到1.0左右,此重懸液即為侵染液。擬南芥種植大約6周后去其初生花序,初次侵染需將已開的花全部剪掉。將擬南芥的花序部分浸入侵染液1 min,期間晃動,避光培養(yǎng)24 h后恢復(fù)原培養(yǎng)條件。在初次轉(zhuǎn)化后可根據(jù)植株狀態(tài)進行重復(fù)侵染,侵染3次后可等待果莢成熟收獲種子[11-12]。

    1.2.3 種子的抗生素篩選 用70%乙醇、2%的次氯酸鈉(每50 mL加15 μL吐溫)依次對種子消毒。消毒后的種子與0.1%的瓊脂糖混合,播種于1/2MS固體培養(yǎng)基(含Kan=50 mg/L)進行轉(zhuǎn)基因植株的抗性篩選。1周左右即可初步篩選轉(zhuǎn)基因植株。

    1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定 一種方法為傳統(tǒng)的CTAB法提取DNA,進行PCR檢測;另一種方法無需提取DNA,利用T5 Direct PCR Kit(Plant)直接用植物組織進行PCR擴增。在植物的嫩葉或幼莖上,用直徑1.5 mm打孔器取樣后直接放入PCR反應(yīng)體系(2×T5 Direct PCR Mix 12.5 μL,EYFP F/R引物各1 μL,dd H2O 10.5 μL至總體積25 μL)中進行擴增,反應(yīng)程序為98 ℃預(yù)變性3 min; 98 ℃, 10 s/58 ℃, 10 s/72 ℃, 20 s,34個循環(huán); 72 ℃延伸4 min。使用的引物:GmAGL8-F 5’GGGGTACCATGGGGAGAGGAAGGGTGCAGT TG 3’;GmAGL8-R 5’CGGAATTCTTCATTTGTAGGACGAAGCATCCAAGG 3’;EYFP-F 5’ CTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGG GTG3’;EYFP-R 5’ TTACTTGTACAGCTCGT CCATGCCGAGAGTGATC 3’。

    1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株的表型觀察 在相同培養(yǎng)條件下,觀察過表達和反義抑制GmAGL8的轉(zhuǎn)基因植株與擬南芥野生型及agl8突變體在生長發(fā)育、開花時間、莢的形態(tài)、莢開裂等表型特征上的變化。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定結(jié)果

    2.1.1 過表達GmAGL8擬南芥的PCR鑒定結(jié)果 經(jīng)過抗卡那霉素篩選,獲得21棵抗性植株,采用傳統(tǒng)的CTAB法提取葉片DNA后,利用載體上帶有的EYFP基因片段設(shè)計引物以構(gòu)建好的pCAMBIA1300∷GmAGL8質(zhì)粒為陽性對照,ddH2O為陰性對照進行PCR驗證,結(jié)果見圖1。

    由電泳圖可見,在測定的21株中,有13株擴增出了720 bp的目標條帶,而野生型中沒有目標條帶出現(xiàn)。初步確定1、4、6、11、13~21號為陽性植株,回收種子,繼續(xù)培養(yǎng)T1代。

    2.2.2 anti-GmAGL8轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR鑒定結(jié)果 同樣通過抗生素篩選獲得轉(zhuǎn)化anti-GmAGL8的擬南芥30株。除了采用傳統(tǒng)方法檢測外,嘗試直接用葉片采用T5 Direct PCR Kit(Plant)進行直擴法PCR驗證,結(jié)果見圖2,可以看出有2株擴增出清晰可見的750 bp目標條帶。繼續(xù)培養(yǎng)陽性株獲得T1代植株。比較圖1與圖2的擴增結(jié)果顯示看出,與傳統(tǒng)的CTAB法提取DNA后進行PCR相比,直擴PCR的方法更加簡便,且條帶清晰,只需小面積葉片,特別適合于材料稀少的樣品。

    WT.野生型;+.陽性對照;-.陰性對照

    WT.野生型;+.陽性對照;-.陰性對照

    2.3 擬南芥的表型觀察結(jié)果

    將過表達AGL8轉(zhuǎn)基因植株T1代(12株),anti-GmAGL8轉(zhuǎn)基因植株T1代(10株),野生型植株(10株),agl8突變體植株(5株),在相同條件下進行培育,仔細觀察不同生育時期,不同類型的植株表型上的差異。

    2.3.1 葉片形態(tài) 如圖3顯示,在葉片形態(tài)方面,過表達GmAGL8植株(圖3-A)葉片相對較厚,呈圓形;野生型植株(圖 3-B)及anti-GmAGL8植株(圖3-C)葉片均較薄,但野生型葉柄長,葉片呈水滴形,而anti-GmAGL8植株葉柄較短葉片偏長,呈長圓形。agl8突變體植株(圖3-D)長勢很弱,葉片發(fā)黃且植株矮小。

    A.GmAGL8過表達植株;B.野生型;C.anti-GmAGL8植株;D.agl8突變體

    2.3.2 角果形態(tài) 在角果形態(tài)方面(圖4),與野生型(圖4-C)相比,anti-GmAGL8植株(圖4-A)角果短,長度在0.5 cm左右;agl8突變體植株(圖4-B)角果短小且瘦弱,多為畸形和敗育果莢;過表達GmAGL8植株(圖4-D)角果較長,與野生型相近,平均在1.20 cm,并且過表達植株果莢比同時期其他類型植株的果莢成熟更早。

    A.anti-GmAGL8植株; B.agl8突變體; C.野生型;D.過表達GmAGL8植株

    2.3.3 角果開裂情況 通過觀察發(fā)現(xiàn),野生型擬南芥角果(圖5-A、5-B、5-C)在變黃成熟后一周正常開裂;而anti-GmAGL8轉(zhuǎn)基因擬南芥在角果成熟時果莢會完全炸開;過表達GmAGL8(圖5-D、5-E)轉(zhuǎn)基因擬南芥在角果成熟后兩周少有開裂;agl8突變體植株(圖5-F)雖然偶能結(jié)莢,但由于敗育和發(fā)育不全而干癟,幾乎得不到成熟的種子。通過隨機碰撞試驗計算得到過表達植株抗裂角指數(shù)平均為0.44,anti-GmAGL8轉(zhuǎn)基因植株抗裂角指數(shù)平均為0.35,野生型抗裂角指數(shù)為平均0.38。通過IBM SPSS Statistics19進行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果表明不同類型植株抗裂角指數(shù)差異顯著。

    另外還發(fā)現(xiàn),在開花時間方面,過表達GmAGL8植株出現(xiàn)早花現(xiàn)象,在發(fā)芽第20天左右開始開花;野生型植株一般在發(fā)芽第32天左右開花,而anti-GmAGL8與agl8突變體植株開花較遲,平均在發(fā)芽后40 d左右開花。

    3 討論與結(jié)論

    FUL基因作為受上游基因調(diào)控的基因,對控制擬南芥開花、葉片形態(tài)、果實發(fā)育起到調(diào)控作用。研究表明,F(xiàn)UL在蓮座葉、莖生葉維管束中表達,使葉片細胞排列緊密,擬南芥FUL基因的突變體會產(chǎn)生植株葉片變寬和葉肉細胞分布松散的現(xiàn)象,過表達IiFUL基因會使擬南芥出現(xiàn)莖生葉片的表型[11-13]。在本試驗中過表達和抑制表達GmAGL8的植株葉片與野生型相比在厚度和形狀上也產(chǎn)生了一些變化,說明GmAGL8基因在某種程度上參與了葉片的發(fā)育過程。Mciller 曾研究發(fā)現(xiàn),DEFH28是金魚草中FUL的直系同源基因,影響了轉(zhuǎn)基因擬南芥的花序分生組織的誘導(dǎo)和后期的花分生組織的形成[14]。對比本試驗中GmAGL8的過表達、抑制表達、及突變體和野生型擬南芥植株的開花時間,發(fā)現(xiàn)過表達GmAGL8植株出現(xiàn)早花現(xiàn)象,果莢成熟早,anti-GmAGL8與agl8突變體植株開花較遲,這說明GmAGL8的表達在一定程度上可以促進擬南芥開花轉(zhuǎn)變過程。Gu等[11]發(fā)現(xiàn)擬南芥ful突變體植株果莢短小,與本試驗anti-GmAGL8、agl8突變體植株果莢短小的現(xiàn)象相一致。 另外,過表達GmAGL8轉(zhuǎn)基因擬南芥在角果成熟時少有開裂,而anti-GmAGL8由于果莢變短種子數(shù)量不變,使得莢果隨著成熟期到來過早開裂。

    A、B、C.野生型;D、E.過表達GmAGL8植株;F.agl8突變體

    目前,有關(guān)大豆炸莢基因的報道相對較少,F(xiàn)unatsuki等利用炸莢栽培性狀差距大的兩個大豆品種圖位克隆了抗炸莢基因pdh1,董陽等也以抗炸莢品種黑農(nóng)44和炸莢的野生大豆ZYD00755為材料克隆了抗炸莢基因SHAT1-5,前者在大豆的炸莢過程中降低莢皮扭曲力起到負調(diào)控作用,后者提高腹縫線次生細胞壁厚度起到正調(diào)控作用[15-16]。過表達GmAGL8基因的擬南芥角果不易炸裂,暗示該基因在控制植物果莢開裂中起到負調(diào)控作用。

    GmAGL8基因作為FUL基因的同源基因,結(jié)合其他物種與FUL同源的基因在擬南芥中的研究,初步認為GmAGL8基因在擬南芥中行使著與FUL基因類似的功能,對擬南芥葉片發(fā)育、開花時間以及果莢長短與開裂均有影響,一定程度上促進開花及果莢成熟,提高果莢抗裂性。已有學(xué)者進行了油菜過表達FUL及其同源基因的研究,來控制油菜角果的開裂[17]。探尋GmAGL8基因?qū)Υ蠖构v開裂的影響,研究該基因與同樣作為控制大豆炸莢的pdh1、SHAT1-5基因作用模式的差異,對大豆品種的改良,提高大豆收獲效率與經(jīng)濟收益具有重要意義。

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