外源NO對NaCl脅迫下冰葉日中花生理指標的影響

王文果，陳志新，石俊華，胡增輝

(1.北京農(nóng)學院 園林學院，北京102206；2.國家林業(yè)和草原局調查規(guī)劃設計院，北京 100714)

土壤鹽漬化已經(jīng)成為全球性的生態(tài)問題。中國農(nóng)林業(yè)土壤的鹽漬化程度嚴重，面積大、分布廣，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴重的威脅[1]。中國耕地面積約3 460萬hm2，發(fā)生鹽漬化的土壤近760萬hm2，約1/5耕地成為鹽堿地[2]。土壤鹽漬化已成為制約農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)的一個主要因素，提升農(nóng)林作物的耐鹽性，培育高耐鹽性的植物新品種是農(nóng)林業(yè)研究的重要方向。通過研究植物的耐鹽機理，能為篩選、改良、培育耐鹽植物新品種提供理論基礎。植物的耐鹽性是一個受多基因、多途徑調控的復雜網(wǎng)絡，當前已在各個水平開展了對植物耐鹽機理的研究，包括生長、生理、分子、蛋白等，而植物對鹽害感知機制及信號途徑的探索是目前的研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)，多種信號途徑參與了植物對鹽脅迫的響應。鹽脅迫誘導了植物細胞質中的Ca2+的含量迅速升高，脫落酸、茉莉酸等信號物質大量合成，誘導下游基因的表達、蛋白的合成、次生代謝物的積累等，從而提高耐鹽性[3]。一氧化氮(nitric oxide，NO)作為近年來發(fā)現(xiàn)的具有信號功能的氣態(tài)分子，廣泛存在于植物體內，參與植物生長發(fā)育及逆境適應等生理過程，是當前研究的熱點[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)，NO在植物對鹽脅迫的響應中也起著重要的信號作用[6,7]，但對其作用機理研究較少。

冰葉日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)為番杏科日中花屬植物，具有極強的耐鹽性，是研究耐鹽機理的模式植物。但冰葉日中花響應鹽脅迫并產(chǎn)生抗性的信號途徑研究較少，特別是對于NO的作用未見報道。本研究以冰葉日中花實生苗為材料，在鹽脅迫下結合硝普鈉(SNP，NO供體)的施用，檢測NO對NaCl脅迫下葉片生理指標的影響，初步揭示NO在冰葉日中花響應鹽脅迫中的作用，為探索提高農(nóng)林植物耐鹽性途徑和方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗以冰葉日中花實生苗為材料，在北京農(nóng)學院園林植物實踐基地溫室內進行培養(yǎng)。將種子播在50孔穴盤中，待幼苗長到5 cm后移苗到花盆(12 cm×12 cm)中，每盆種植1株。盆土基質配方為草炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1，每3 d澆1次水，每周澆1次1/4 Hoagland營養(yǎng)液。當冰葉日中花長出8片葉子后，選擇生長狀態(tài)一致且無病蟲害的植株進行實驗。

1.2 NaCl及SNP處理

使用400 mM NaCl進行鹽處理，以1/4 Hoagland營養(yǎng)液配置，以S0表示。硝普鈉(SNP)處理設置5個濃度梯度(50、100、300、500、800 μM，分別以S1、S2、S3、S4、S5表示)，處理時將SNP溶于400 mM NaCl的1/4 Hoagland營養(yǎng)液中。以1/4 Hoagland溶液為對照(CK)，每個處理3次重復。澆鹽量為500 mL，分3 d完成，第1天澆100 mL，第2、3天分別澆200 mL。于處理后第1、3、5、10、15天取葉片，立即放入液氮中，放入-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3 H2O2含量測定

稱取0.2 g葉片，加入1.5mL 4℃預冷的丙酮和少量石英砂于研缽中研磨成勻漿，3 000 r/min離心10 min。取1 mL上清液，加0.1 mL 5%(W/V)TiSO4和0.2 mL濃氨水，3 000 r/min離心10 min，將沉淀溶解于3 mL 2 mM H2SO4溶液中，于415 nm波長下測定吸光度。H2O2含量/(μmol/gFW)= (C×Vt)/(Vs×W)。C.標準曲線上查得樣品中的H2O2濃度；Vt.提取液總體積；Vs.測定時取樣量；W.樣品鮮質量。

1.4 丙二醛含量測定

參考陳志新等[8]和趙雪琦[9]的方法，稱取0.2 g葉片，取10 mL 10%三氯乙酸及少量石英砂于研缽中研磨成勻漿，3 000 r/min離心10 min。取2 mL上清液，加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸，混勻，沸水浴15 min，迅速冷卻，再于3 000 r/min離心10 min，將上清液在532、600、450 nm波長下測定吸光度。MDA含量/(μmol/g)=[6.452×(OD532-OD600)-0.559×D450]×Vt/(Vs×W)。Vt.提取液總體積；Vs.測定用提取液體積；W.樣品鮮質量。

1.5 脯氨酸含量測定

稱取0.5 g葉片，加5 mL 3%的磺基水楊酸，沸水浴20 min，冷卻后3 000 r/min離心10 min。取2 mL上清液，加入2 mL乙酸和2 mL酸性茚三酮，沸水浴30 min。冷卻后加入5 mL甲苯溶液萃取，充分搖蕩60 s，靜置后取上層溶液，再于3 000 r/min離心10 min，取上清液在520 nm波長下測定吸光度。脯氨酸含量/(μg/g )= (C×Vt)/(Vs×W)。C.提取液中脯氨酸的含量；Vt.提取液總體積；Vs.所吸取提取液體積；W.樣品鮮質量。

1.6 可溶性糖含量測定

參考陳志新等[8]的方法，稱取0.5 g葉片，置于5 mL蒸餾水中沸水浴30 min，過濾后定容至10 mL，即為粗提液。粗提液1 mL，加1.5 mL蒸餾水、0.5 mL蒽酮乙酸乙醋溶液和5 mL濃硫酸，充分振蕩，沸水浴1 min，冷卻至室溫，在630 nm波長下測定吸光度。

可溶性總糖的含量/(mg/g)= (C×Vt)/(Vs×W)。C.提取液中可溶性糖含量；Vt.提取液總體積；Vs.測定時所吸取提取液體積；W.樣品鮮質量。

1.7 超氧化物歧化酶活性測定

稱取0.5 g葉片，加入4 mL磷酸緩沖液(50 mM，pH7.8)冰浴研磨，4℃ 10 000 r/min離心20 min，上清液冷藏保存。取型號相同兩支試管，取50 μL上清液(2支對照試管中各加磷酸緩沖液50 μL)，加入3 mL反應液(由蒸餾水、甲硫氨酸、氮藍四唑、EDTA-Na2、核黃素按5∶30∶6∶6∶6∶6的濃度比配置)，其中1支對照試管置于暗處，其余各管于4 000 lx光下反應30 min。以不照光的對照管作空白，于560 nm波長下測定吸光度。

SOD活性/(U/g)=(Ack-AE) ×Vt/(0.5×Ack×W×Vs)。Ack.對照管的吸光度；AE.樣品管的吸光度；Vt.樣品液總體積；Vs.測定時用酶液體積；W.樣品鮮質量。

1.8 過氧化物酶活性測定

提取方法同SOD。取20 μL粗提液加入3 ml反應液，于470 nm波長下測定吸光度。每隔1 min讀一次，測定5 min。反應液：50 mL 100 mM pH6.0的磷酸緩沖液，加入28 μL愈創(chuàng)木酚，加入30%19 μL H2O2，存于冰箱中。

POD活性/[U/(min·gFW)]=(ΔA470×Vt)/(0.01Vs×W×t)。式中，ΔA470.吸光度的變化值；Vt.提取酶液的總體積；Vs.測定時取用酶液體積；t.反應時間；W.樣品鮮質量。

1.9 過氧化氫酶活性測定

稱取0.5 g葉片，加入5 mL 4 ℃預冷的50 mM磷酸緩沖液(pH=7.0，含1%PVP，0.1%巰基乙醇)及少量石英砂和CaCO3冰浴研磨，4℃ 10 000 r/min離心20 min，上清液即為粗提液。反應體系含2.5 mL磷酸緩沖液、0.1 mL 2% H2O2、0.1 mL粗提液，混勻后于240 nm波長下測定吸光度。每1 min讀1次數(shù)，測定5 min，以每分鐘變化0.01為一個活力單位。

CAT活性/[U/(min·g)]=(ΔA240×Vt)/(0.01Vs×W×t)。式中，ΔA240.吸光度的變化值；Vt.提取酶液的總體積；Vs.測定時取用酶液體積；t.反應時間；W.樣品鮮質量。

1.10 抗壞血酸過氧化物酶活性測定

提取方法同CAT。反應體系含2.5 mL磷酸緩沖液、0.1 mL 0.1 mM EDTA-Na2、0.1 mL 0.3 mM 抗壞血酸(AsA)、0.1 mL 0.06 mM H2O2、0.l mL粗提液。加入H2O2后啟動反應，于290 nm波長測定吸光度。每1 min讀1次數(shù)，測定5 min，以每分鐘變化0.01為1個活力單位。

APX活性/[U/(min·g)]= (ΔA290×Vt)/(0.01Vs×W×t)。ΔA290.反應時間內吸光度的變化；Vt.提取酶液的總體積；Vs.測定時取用酶液體積；t.反應時間；W.樣品鮮質量。

使用Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用LSD法進行差異顯著性比較，統(tǒng)計P值為0.05水平上的差異(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同濃度SNP對鹽脅迫下冰葉日中花MDA和H2O2含量的影響

表1顯示了SNP對鹽脅迫下冰葉日中花葉片MDA和H2O2含量的影響。與對照相比，在鹽脅迫條件下，冰葉日中花葉片的MDA含量隨著處理時間不斷的升高，顯著高于對照(P<0.05)，第5天達到最高19.21 μmol/g，為對照的1.8倍。施用不同濃度SNP處理后，MDA的含量隨SNP濃度的增加表現(xiàn)出逐漸降低的趨勢。在800 μM的SNP處理后，MDA的含量遠低于S0(P<0.05)，僅為S0的57%，而且低于對照。H2O2含量表現(xiàn)出與MDA相似的變化規(guī)律，隨著SNP處理濃度的增加，鹽脅迫引起的H2O2的積累逐漸減少。

表1 SNP對鹽脅迫下冰葉日中花葉片MDA和H2O2含量的影響

2.2 不同濃度SNP對鹽脅迫下冰葉日中花滲透調節(jié)物質含量的影響

當冰葉日中花植株受到NaCl脅迫后，脯氨酸和可溶性糖含量均出增加的趨勢，均顯著高于對照(P<0.05，表2)。加入SNP后，這兩種滲透調節(jié)物質含量在低濃度下(50～300 μM)，呈現(xiàn)出先逐漸升高的趨勢，而超過300 μM后，隨著濃度的增加，脯氨酸和可溶性糖含量又逐漸降低。加入50 μM SNP后，脯氨酸和可溶性糖含量即表現(xiàn)出顯著升高(P<0.05)。在SNP處理第1天，葉片脯氨酸和可溶性糖含量分別較S0增加了57%和44%。而加入300 μM SNP后，葉片脯氨酸和可溶性糖含量在第1天就分別增加到了S0的3.5倍和2.2倍，經(jīng)過15 d處理后，仍然保持較高的水平，明顯比S0高2倍和0.9倍(P<0.05)。

表2 SNP對鹽脅迫下冰葉日中花葉片脯氨酸和可溶性糖含量的影響

2.3 不同濃度SNP對鹽脅迫下冰葉日中花抗氧化活性酶的影響

表3顯示了SNP對鹽脅迫下冰葉日中花葉片抗氧化酶活性的影響?？梢钥闯觯琋aCl脅迫下，SOD、POD、CAT、APX活性均高于對照(P<0.05)，而隨著處理時間的延長整體上呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢。加入SNP后，在低濃度下(50～300 μM)，各個酶活性逐漸升高，大于300 μM后，隨著濃度的增加，酶活又表現(xiàn)出降低的趨勢。4種酶活性在加入300 μM SNP后，均表現(xiàn)出最高的活性。300 μM SNP處理1 d后，葉片SOD活性迅速增加到S0的1.8倍，經(jīng)過15 d后，又增加到2.3倍。在300 μM SNP處理1 d后，POD活性顯著高于S0(P<0.05)，為S0的2.5倍，在處理15 d后活性有所降低，但也幾乎達到S0的2.0倍。CAT和APX活性在300 μM SNP處理1 d，也分別較S0升高了60%和80%，活性顯著增加(P<0.05)。

3 討 論

植物在高鹽、高溫、干旱、鹽堿等逆境下會發(fā)生活性氧增加[10,11]，造成膜質過氧化[11,12]，破壞蛋白結構，從而影響植物正常代謝[13]，導致植物受到傷害?？寡趸赶到y(tǒng)的活化，能有效的清除由于活性氧，提高葉片細胞的滲透調節(jié)能力和耐鹽性[14]。

冰葉日中花受到鹽脅迫后，葉片MDA和H2O2含量的增加，表明其生理生化代謝受到影響。脯氨酸和可溶性糖含量，以及SOD、POD、CAT、APX活性的升高，表明冰葉日中花通過增加滲透調節(jié)物含量、提升抗氧化系統(tǒng)活性，提高了耐鹽性。亞麻薺(Camelinasativa)經(jīng)鹽脅迫后，活性氧大量積累，引起抗氧化酶系統(tǒng)的迅速活化，劑滲透調節(jié)物的大量合成[15]。段吉鋒等發(fā)現(xiàn)，耐鹽性強的茄子(Solanummelongena)品種，在鹽脅迫后的脯氨酸等滲透調節(jié)物含量，以及SOD、POD等酶活性大幅度升高[16]。冰葉日中花在400 mM的高鹽濃度處理1 d后，滲透調節(jié)物含量和抗氧化酶活性即出現(xiàn)顯著升高，表明其能迅速響應鹽脅迫，啟動相應的生理生化反應，表現(xiàn)出較強耐鹽性。

表3 SNP對鹽脅迫下冰葉日中花葉片抗氧化酶活性的影響

植物抗逆反應的產(chǎn)生，須有信號物質參與和介導。NO是植物體內重要的抗逆信號分子[17]。NO參與了脅迫下黃瓜(Cucumissativus)幼苗鹽抗氧化反應的調控，緩解了膜質過氧化對葉片光合系統(tǒng)的損傷[18]。楊曉偉等研究發(fā)現(xiàn)，外源SNP可以顯著增加CAT、SOD、POD等抗氧化酶活性，提高臺灣榿木(Alnusformosana)的抗氧化能力[19]。在鹽脅迫下冰葉日中花經(jīng)SNP處理后，葉片MDA和H2O2含量的降低，說明膜脂過氧化保持較低水平。另外，脯氨酸和可溶性糖含量的升高，提高了對滲透脅迫的抗性，表明NO能促進冰葉日中花滲透調節(jié)物質的合成，提高其耐鹽性。裴樂樂等的研究也表明，適當濃度的外源SNP(0.2 mM)能明顯抑制由鹽脅迫造成的油松(Pinustabuliformis)葉片MDA和H2O2含量的積累，提高脯氨酸和可溶性蛋白的含量[20]。在本研究中，SNP處理同樣顯著提高了鹽脅迫后冰葉日中花葉片中POD、SOD、CAT和APX活性，表明NO激活了抗氧化酶系統(tǒng)，增強了活性氧的清除能力，減輕了膜脂過氧化程度。SNP的處理也提高了鹽脅迫下的蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)種子抗氧化酶活性，降低了MDA和活性氧含量，減輕了鹽脅迫對種子的傷害[21]。此外，隨著SNP濃度的升高，在MDA和H2O2含量下降的同時，抗氧化酶活性以及滲透調節(jié)物質含量也相應的呈現(xiàn)出下降的趨勢。邵瑞鑫研究表明，外源SNP能夠顯著提升逆境下植物光合電子傳遞鏈的效率，減少活性氧的產(chǎn)生，有效地提升植物葉片對逆境的耐受能力，表明NO對活性氧生產(chǎn)具有重要的調控作用[22]。因此，外源SNP除激活抗氧化酶系統(tǒng)、提高滲透調節(jié)物質含量外，還能直接調控減少了鹽脅迫后活性氧的產(chǎn)生?？傊庠碨NP能夠在生理水平上提升冰葉日中花的耐鹽性，但其中的機制有待進一步研究。