葉螨乙酰膽堿酯酶在pColdⅡ中的表達及活性分析

韋顯星，李 博，張翼鵬，丁 超，楊 金，彭 博，李夢怡，卜春亞

(北京農(nóng)學院 生物與資源環(huán)境學院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，北京 102206)

朱砂葉螨(Tetranychuscinnabarinus)是一種世界性害螨，對農(nóng)業(yè)造成很大危害[1,2]。目前，對朱砂葉螨的防治有生物防治、農(nóng)業(yè)防治與藥劑防治等措施[3]，其中農(nóng)藥防治應用最廣泛，但現(xiàn)有殺蟲劑存在影響非靶標生物以及殘留等問題。

乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)是神經(jīng)傳導的關(guān)鍵酶[4]，是有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥靶標[5,6]。目前，乙酰膽堿酯酶抑制劑[7-9]，主要有植物源[10,11]、微生物源以及化學合成類[12,13]。隨著有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的大量使用，對哺乳動物發(fā)育中的神經(jīng)的危害逐漸顯現(xiàn)[14]。鑒于對環(huán)境和人畜的危害以及朱砂葉螨對其抗性問題，急需開發(fā)新型選擇型殺螨劑。

AChE的體外高效表達，在選擇性殺螨劑的研制中尤為重要。Lang[15]等比較了鱗翅類昆蟲的兩種AChE的抑制動力學。Ilg[16]等表達了兩種蚤類AChE并測定抑制活性。Kim[17]等研究了馬鈴薯甲蟲AChE突變體的功能。彭博[18]等采用重組朱砂葉螨AChE篩選體外抑制化合物，但重組蛋白的活性還有待提高。在AChE抑制化合物的篩選中，重組蛋白具有特異性和重復性好、干擾少以及方便易得等特點，是較好的選擇。

此研究擬探究朱砂葉螨ace基因中疏水序列以及不同表達載體對其表達效果的影響，建立AChE體外高效表達純化體系，為抑制朱砂葉螨AChE活性化合物的篩選以及新型選擇性殺螨劑的研發(fā)提供試驗指向。

1 材料與方法

1.1 材 料

菌株和載體：E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)購自天根生化科技(北京)有限公司；ace原核表達重組質(zhì)粒pET-30a/ace-1842(基因全長)由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室保存。

主要試劑：限制性內(nèi)切酶(EcoR Ⅰ、SalⅠ和XhoⅠ)、Primer STAR Max DNA Polymerase、dNTP購自Takara公司，蛋白Marker購自北京聚合美生物科技有限公司，江蘇康為生化試劑有限公司的Cocktail蛋白酶抑制和One Step Western Kit HRP(rabbit)，TIANpure Mini Plasmid Kit、DNA Marker購自天根生化科技(北京)有限公司，Ni-NTA購自GE Healthcare，BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo Scientific公司。

1.2 方 法

1.2.1 pET-30a/ace-1782、pCold Ⅱ/ace-1842和pCold Ⅱ/ace-1782原核表達載體的構(gòu)建 以保存的T/ace-1842質(zhì)粒為模板，設計特有引物(見表1)，F(xiàn)1、R1擴增ace-1782(pCold Ⅱ)；引物F1、R2擴增ace-1842(pCold Ⅱ)； F2、R1擴增ace-1782(pET-30a)。PCR擴增條件為：98 ℃預變性5 min，98 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃保溫10 min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收目的片段。

隨后，T4連接酶分別連接用限制性內(nèi)切酶消化的目的基因與空表達載體pCold Ⅱ和pET-30a，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)，構(gòu)建pET-30a/ace-1782、pCold Ⅱ/ace-1842、pCold Ⅱ/ace-1782原核表達載體經(jīng)雙酶切鑒定后，送測鑒定。

表1 不同形式ace基因擴增引物

1.2.2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導表達 將鑒定正確的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)。挑取陽性菌株單菌落活化并逐步擴大培養(yǎng)。pET-30a表達載體于37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600 nm值為0.6～0.8，加入終濃度1 mmol/L IPTG，28 ℃誘導7 h。pCold Ⅱ表達載體于37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600 nm值為0.4～0.6，加入終濃度0.4 mmol/L IPTG，15 ℃誘導24 h。誘導后離心清洗并收集菌體，保存于-80 ℃待用。

1.2.3 目的蛋白的純化 誘導表達后的菌體，每升菌液用20 mL結(jié)合緩沖液A(2.7 mmol/L KCl、140 mmol/L NaCl、1.8 mmol/L KH2PO4、10 mmol/L Na2HPO4，pH 8.0)重懸，加入1 mmol/L PMSF、200 μL Cocktail蛋白酶抑制劑，冰上攪拌30 min。200 W功率破碎菌體140個循環(huán)。

將離心后的上清液與已平衡的Ni-NTA在4 ℃條件下結(jié)合2 h。用結(jié)合緩沖液和50 mM的咪唑緩沖液洗去未吸附和非特異性結(jié)合蛋白，用200 mmol/L的咪唑緩沖液洗脫目的蛋白。收集流出峰進行SDS-PAGE電泳進一步分析。用Amicon?Ultra-15濃縮并置換緩沖液，目的蛋白溶液于-80 ℃保存。

1.2.3 Western Blot分析 目的蛋白SDS-PAGE電泳后，100 V恒壓電轉(zhuǎn)2 h到PVDF膜上后，按照康為One Step Western Kit HRP(rabbit)試劑盒說明書進行操作，室溫封閉PVDF膜5 min，本實驗室制備的抗AChE特異性抗體孵育后，用ECL化學發(fā)光試劑盒進行檢測。

1.2.4 BCA蛋白定量和酶活力測定 按照Thermo Scientific公司BCA蛋白定量試劑盒說明書，建立蛋白濃度-吸光值標準曲線，測定各種AChE蛋白與螨粗提液的蛋白濃度。按文獻[1]制備螨粗提液。

按照改進的Ellman法測定AChE重組蛋白活性[15]，以50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)作為空白對照組；在試驗組中加入100 μL 50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，80 μL相同濃度的各種AChE重組蛋白或螨粗提液。隨后每孔加入顯色劑DNTB(0.4 mmol/L DTNB，1.5 mmol/LNaHCO3) 20 μL和底物ATChI (1 mmol/L) 40 μL。室溫孵育后測定412 nm處吸光值。重復3次。

計算AChE重組蛋白與螨粗提液活性[19]，SPSS 19.0進行活性差異顯著性分析。

分析AChE去掉疏水區(qū)對其表達效果的影響，比較AChE在pET-30a和pCold Ⅱ兩種表達載體中的表達效果。

1.2.5 毒扁豆堿對各種形式的AChE活性的抑制 96孔板中加入各種形式的 AChE分別和5個不同濃度梯度(終濃度為0～2 mM)的毒扁豆堿的預混液，每個處理重復3個孔。50 mM Tris-HCl(pH 8.0)作為空白對照， AChE作為陽性對照，如上所述測定酶的剩余活性。利用SPSS 19.0卡方檢驗計算毒扁豆堿對各種形式AChE的半數(shù)抑制濃度，進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同形式ace原核表達載體的構(gòu)建

將構(gòu)建好的pET-30a/ace-1782、pET-30a/ace-1842、pCold Ⅱ/ace-1782與pCold Ⅱ/ace-1842進行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖1所示，ace去疏水區(qū)以及野生型ace全長分別構(gòu)建的pCold Ⅱ與pET-30a重組質(zhì)粒，雙酶切鑒定結(jié)果正確，測序驗證正確說明原核表達載體構(gòu)建成功，可以用于后續(xù)表達。

注：M.DNA MarkerⅢ；1, 3.pCold Ⅱ/ace-1842；2.pCold Ⅱ/ace-1782；4.pET-30a/ace-1842；5.pET-30a/ace-1782

2.2 不同形式ace的誘導表達

將含 pET-30a/ace-1782、pET-30a/ace-1842、pCold Ⅱ/ace-1782和pCold Ⅱ/ace-1842陽性質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)菌株分別劃線培養(yǎng)，挑取單菌落擴大培養(yǎng)至對數(shù)期，分別IPTG誘導表達，SDS-PAGE檢測表達情況，如圖2所示，與未誘導的相比，AChE重組蛋白去疏水區(qū)以及野生型全長AChE重組蛋白在pCold Ⅱ與pET-30a載體中均得到成功表達，并且條帶大小均與預期一致。總體來說，ace基因在 pCold Ⅱ載體中表達量要遠高于pET-30a載體，相對表達量約為后者的7倍。

注：A.M.蛋白marker；1.未誘導的AChE-1842(pET-30a)；2.未誘導的AChE-1842(pCold Ⅱ)；3.未誘導的AChE-1782(pCold Ⅱ)；4.誘導后的AChE-1842(pET-30a)；5.誘導后的AChE-1842(pCold Ⅱ)；6：誘導后的AChE-1782(pCold Ⅱ)。B.M.蛋白marker；1.未誘導的AChE-1782(pET-30a)；2.未誘導的AChE-1782 (pCold Ⅱ)；3.誘導后的AChE-1782(pET-30a)；4.誘導后的AChE-1782 (pCold Ⅱ)

2.3 不同形式AChE重組蛋白的純化

Ni-NTA純化濃縮后，用SDS-PAGE分析和Western Blot檢測。如圖3所示， AChE重組蛋白去疏水區(qū)后的條帶以及野生型全長AChE重組蛋白的條帶大小與預期一致，說明AChE在pCold Ⅱ與pET-30a中表達成功，獲得的AChE蛋白符合后續(xù)試驗要求。

注：A.SDS-PAGE鑒定 M.蛋白marker；1.純化的AChE-1842(pCold Ⅱ)；2.純化的AChE-1782(pCold Ⅱ)； 3-4.純化的AChE-1842(pET-30a)；5.純化的AChE-1782(pET-30a)。B.Western-blot檢測 M.蛋白marker；1.純化的AChE-1782(pCold Ⅱ)；2.純化的AChE-1842(pCold Ⅱ)； 3.純化的AChE-1842(pET-30a)；4-5.純化的AChE-1782(pET-30a)

2.4 不同形式AChE酶活力比較

采用ATCh-DNTB法測定AChE活性。如圖4所示，相同濃度水平下，AChE重組蛋白活性均顯著高于朱砂葉螨粗提液(P<0.05)。pCold Ⅱ和pET-30a兩種表達載體表達AChE時，pCold Ⅱ載體表達的AChE蛋白活性顯著高于pET-30a載體(P<0.05)，AChE重組蛋白在去掉疏水區(qū)后活性顯著提高(P<0.05)。

注：數(shù)據(jù)為3次重復試驗的平均值±標準誤，柱上標的不同小寫字母表示不同差異顯著水平(P<0.05)

2.5 各種AChE對毒扁豆堿的敏感性分析

隨著毒扁豆堿濃度的增加，AChE活性的逐漸下降，見圖5。SPSS計算得出，毒扁豆堿對重組朱砂葉螨AChE(pCold Ⅱ和pET-30a)的IC50分別為1.38 mM和1.79 mM。在pCold Ⅱ中表達的AChE比在pET-30a中表達的AChE對毒扁豆堿更加敏感(P<0.05)，進一步說明了在pCold Ⅱ中表達的AChE比在pET-30a中表達的AChE活性要高，為進一步利用基因工程原理制備純化的螨AChE，為篩選新型農(nóng)藥和農(nóng)藥殘留檢測提供了依據(jù)。

注：圖表中數(shù)據(jù)為3次重復試驗的平均值±標準誤

3 討 論

乙酰膽堿酯酶在昆蟲神經(jīng)信號調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑通過阻斷AChE去極化而毒殺害蟲，隨著其對環(huán)境以及非靶標有益生物毒性的日益顯現(xiàn)，研發(fā)以朱砂葉螨乙酰膽堿為靶標的新型選擇性殺螨劑具有十分重要的實踐意義。目前，乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選通常使用螨粗提液，該方法存在不能排除螨自身其他蛋白對試驗的影響等問題。采用體外重組AChE蛋白，有助于解決這些問題，可以大大提高篩選的效率。彭博[18]等采用螨AChE重組蛋白成功篩選到了有活性的殺螨化合物(毒扁豆堿的IC50為5.4 mM)，但AChE重組蛋白的活性還有待提高。與其相比本研究獲得的AChE對毒扁豆堿靈敏度提高3倍。

目前，已有多種物種的ace基因相繼表達成功。Fischer[20]等于1993年在大腸桿菌中表達了人乙酰膽堿酯酶。陳艷霞[21]于2007年克隆了家蠅乙酰膽堿酯酶并在昆蟲細胞成功表達。2009年Jiang[22]等采用桿狀病毒系統(tǒng)表達了岡比亞蚊AChE1，并得到純化蛋白。昆明鼠AChE在原核表達載體pET28a中成功表達并進行活性測定[23]。周小霞等[24]將東亞飛蝗的AChE在畢赤酵母中成功表達。彭博等[1]構(gòu)建原核表達載體pET-30a/ace，獲得了有一定活性的螨AChE。大腸桿菌具有世代周期短、繁殖速度快、成本低以及遺傳背景清晰的特點，可以高效誘導表達外源蛋白，在基因工程中應用廣泛[25]。但是原核表達體系表達真核生物蛋白時，由于缺少轉(zhuǎn)錄后加工，容易因蛋白折疊不正確而形成無活性的包涵體。pCold II表達載體具有使用方便和成本低等特點。蛋白的低溫誘導表達，有助于蛋白正確折疊，解決上述一些問題。本實驗室曾將ace基因在真核表達載體pcDNA3.1/V5-His-TOPO中進行真核表達，但是表達量和純化量均不理想。鑒于真核細胞表達載體表達AChE蛋白表達量較低，以及pET系列原核表達載體表達AChE蛋白活性不是很理想等問題。此研究對不同形式的AChE基因在兩種原核表達載體分別表達，通過比較表達量與活性水平的差異，篩選更為高效的AChE重組蛋白表達和純化體系，為抗AChE殺蟲劑的篩選奠定基礎。

結(jié)果表明AChE去掉疏水序列可以顯著提高酶的活性高于全長序列，可見去掉疏水區(qū)的AChE蛋白增加了其水溶性，進而增加了重組AChE蛋白的活性。和pET-30a載體表達的AChE相比，使用pCold II載體表達的AChE蛋白酶活性顯著增加，對毒扁豆堿的敏感性也大大提高?？梢妏Cold II的低溫冷表達系統(tǒng)有助于提高蛋白可溶性，進而表現(xiàn)出更高的活性，是表達重組酶蛋白的較好選擇。AChE去掉疏水區(qū)后在pCold II表達載體中表達，獲得的重組蛋白可用于更高效、便捷地篩選朱砂葉螨乙酰膽堿酯酶抑制化合物的研究，為研制新型選擇性殺螨劑提供堅實前期理論和試驗技術(shù)支持。