納豆多糖的硫酸化改性工藝

楊 波， 楊 光， 陳遠(yuǎn)嬌， 楊文麗

（上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

納豆起源于中國古代豆豉，是日本的發(fā)酵產(chǎn)品[1]，它是天然的抗生物，富含多種營養(yǎng)素，有助于調(diào)節(jié)血壓和血脂，降低膽固醇，綜合提高人體免疫力等[2-3]。近年來，對(duì)納豆功能性成分的研究越來越多，納豆多糖是由納豆菌發(fā)酵大豆所得的副產(chǎn)物，其抗氧化、改善免疫學(xué)機(jī)制以及提高免疫力的作用已經(jīng)被證實(shí)[4-6]。多糖的生物活性與其復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)相關(guān)，硫酸酯化多糖是一種酸性多糖，是單糖結(jié)構(gòu)中的羥基被硫酸基團(tuán)取代而形成的一類多功能生理活性物質(zhì)[7]。多糖經(jīng)硫酸化修飾后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被改變，使其生物活性功能發(fā)生改變，有利于增強(qiáng)硫酸酯化多糖的抗氧化、抗癌、免疫調(diào)節(jié)和抗凝血活性等多種生物功能[8]。朱麗丹等[9]對(duì)硫酸酯化米糠多糖的研究中發(fā)現(xiàn)，硫酸酯化米糠多糖在體外條件下可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。目前，多糖的硫酸酯化方法主要有濃硫酸法、三氧化硫–吡啶法、氯磺酸法，但這些方法均有缺陷，其中濃硫酸和氯磺酸屬于強(qiáng)酸，反應(yīng)條件難以控制，效果不甚理想。

因此，本研究選擇氯磺酸–吡啶法來對(duì)納豆多糖進(jìn)行硫酸化修飾，單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了最佳工藝；采用傅立葉紅外光譜觀察分析硫酸酯化納豆多糖（以下簡稱酯化多糖）的官能團(tuán)變化；同時(shí)探究了酯化多糖與納豆多糖對(duì)阪岐桿菌（Bntorobater sakazakii）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）及大腸桿菌 O157（Escherichia coli）的抑制作用，為納豆多糖的硫酸酯化改性提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：納豆多糖由本實(shí)驗(yàn)室利用購自連云港糧油工業(yè)有限公司的大豆豆粕提取得到。

試劑：氯磺酸、吡啶、N,N–二甲基甲酰胺、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、營養(yǎng)肉湯（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、大腸桿菌、阪岐桿菌、嗜水氣單胞菌（上海一研生物科技有限公司）。

1.2 儀 器

精密增力電動(dòng)攪拌器（JJ-1）：常州朗越儀器制造有限公司；數(shù)控升降水浴鍋：上海振捷設(shè)備有限公司；pH計(jì)（pHS-3TC）：上海天達(dá)儀器有限公司；超凈工作臺(tái)（Vs-840-2）：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；生化培養(yǎng)箱（LRH-250）：上?；厶﹥x器制造有限公司；可見分光光度計(jì)（WFJ 7200）：優(yōu)尼柯儀器有限公司；數(shù)顯水浴恒溫振蕩器（SHZ-82B）：常州人和儀器廠；紅外光譜儀（NICOLET5700）：美國熱電公司。

1.3 方 法

1.3.1 酯化納豆多糖的制備

硫酸酯化試劑的制備：參照Qian等[10]的方法。將帶有冷凝和攪拌裝置的三頸瓶置于鹽水–冰浴中，取適量預(yù)冷的吡啶，按照一定比例緩慢加入氯磺酸，邊加邊攪拌，使兩者充分反應(yīng)?？刂品磻?yīng)溫度在10 ℃以內(nèi)，反應(yīng)時(shí)間為30～40 min即可得到淡黃色酯化試劑。

酯化多糖的制備：稱取適量納豆多糖，使其溶于一定體積的N,N–二甲基甲酰胺中，并加入裝有酯化試劑的三頸瓶中。調(diào)節(jié)水浴鍋溫度，攪拌一定時(shí)間后，倒入裝有適量冰水的燒杯中，用4 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至中性。加入95%乙醇，使溶液中乙醇濃度為75%后放入4 ℃冰箱中醇沉過夜。離心得到多糖沉淀流水透析48 h，再蒸餾水透析12 h，濃縮、凍干即可得硫酸酯化納豆多糖。

1.3.2 硫含量的測定

硫酸根含量測定方法采用氯化鋇–明膠法[11]。以硫酸鉀的含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。由圖1可以得到，以K2SO4為標(biāo)樣所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.848x+0.016 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9。

圖 1 硫酸根測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for the determination of sulfate

樣品中硫酸根提取：準(zhǔn)確稱取樣品0.05 g于樣品瓶中，加入1 mol/L的鹽酸溶液2 mL，搖勻后密封，105 ℃ 水解 3 h。冷卻后用 1 mol/L 的鹽酸溶液定容至50 mL。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法測定吸光度。每個(gè)樣品測定3次，取平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酯化多糖中硫酸根離子含量，根據(jù)公式計(jì)算其取代度。

取代度計(jì)算公式為

式中：DS為取代度；S為硫酸根離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3 酯化多糖制備單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

a. 氯磺酸與吡啶的體積比V氯磺酸∶V吡啶對(duì)取代度的影響

按照1.3.1中的方法，設(shè)置V氯磺酸∶V吡啶分別1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，探究在V酯化試劑∶V多糖為4∶3、酯化溫度70 ℃、酯化時(shí)間為2 h的條件下，測定V氯磺酸∶V吡啶對(duì)酯化多糖取代度的影響。

b. 酯化試劑與納豆多糖溶液的體積比V酯化試劑∶V多糖對(duì)取代度的影響

按照1.3.1中的方法，設(shè)置V酯化試劑∶V多糖分別為 4∶1，4∶2，4∶3，4∶4，4∶5，探究在V氯磺酸∶V吡啶為 1∶3、酯化溫度 70 ℃、酯化時(shí)間為2 h的條件下，測定V酯化試劑∶V多糖對(duì)酯化多糖取代度的影響。

c. 多糖酯化溫度對(duì)取代度的影響

按照1.3.1中的方法，設(shè)置酯化溫度分別為50，60 ，70，80 ，90 ℃，探究在V氯磺酸∶V吡啶為1∶3、V酯化試劑∶V多糖為 4∶3、酯化時(shí)間為 2 h的條件下，測定酯化溫度對(duì)酯化多糖取代度的影響。

d. 多糖酯化時(shí)間對(duì)取代度的影響

按照1.3.1中的方法，設(shè)置酯化時(shí)間分別為1，2，3，4，5 h，探究在V氯磺酸∶V吡啶為1∶3、V酯化試劑∶V多糖為4∶3、酯化溫度為70 ℃的條件下，測定酯化時(shí)間對(duì)酯化多糖取代度的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化

為了探究各單因素之間的相互作用，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用軟件minitab 17.0對(duì)V氯磺酸∶V吡啶、V酯化試劑∶V多糖、酯化溫度和酯化時(shí)間制定四因素三水平的正交優(yōu)化試驗(yàn)，以酯化多糖取代度為指標(biāo)，確定最適酯化工藝。

1.3.5 酯化多糖的紅外光譜分析

參考馬小雙等[12]的測定方法，取2 mg納豆多糖樣品及200 mg干燥的溴化鉀放入瑪瑙研缽中，在紅外燈照射下將其混勻并研細(xì)。用壓片機(jī)將混合物壓成 0.3～0.5 mm 的透明薄片，在 400～4 000 /cm紅外波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，觀察并分析譜峰情況。

1.3.6 抑菌試驗(yàn)方法

參考陳致印等[13]的方法，固體培養(yǎng)基：分別稱取牛肉膏 5 g、蛋白胨 10 g、氯化鈉 5 g、瓊脂 15 g，加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中，滅菌后備用。液體培養(yǎng)基：粉狀營養(yǎng)肉湯7.2 g，加熱溶解于400 mL蒸餾水中，低濃度NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH值為7.2～7.4，高壓滅菌后備用。

菌懸液制備：選用活化后的大腸桿菌、阪岐桿菌和嗜水氣單胞菌，用接種環(huán)挑取單菌落至液體培養(yǎng)基中，根據(jù)各菌種的最適宜生長溫度，分別在150 r/min轉(zhuǎn)速下震蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣計(jì)數(shù)，使菌懸液濃度為106cfu/mL（每毫升待檢樣品中含有的菌落總數(shù)）。

抑菌作用測定：采用濾紙片法。將酯化多糖與納豆多糖配制成不同濃度梯度的溶液，過0.45 μm濾膜備用。使用十字交叉法測定抑菌圈直徑。抑菌圈大小可表示抑菌活性大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 酯化反應(yīng)條件對(duì)酯化多糖取代度的影響

2.1.1V氯磺酸∶V吡啶對(duì)酯化多糖取代度的影響

取納豆多糖 0.1 g，在V酯化試劑∶V多糖為 4∶3、酯化溫度70 ℃、酯化時(shí)間2 h的條件下，測定V氯磺酸∶V吡啶對(duì)酯化納豆多糖取代度的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖 2 V氯磺酸∶V吡啶對(duì)酯化多糖取代度的影響Fig.2 Effect of volume ratio of chlorosulfonic acid and pyridine on degree of substitution of sulfated polysaccharide

由圖2可知，在制備酯化試劑時(shí)，隨著吡啶體積的增加，酯化多糖的取代度逐漸升高，在V氯磺酸∶V吡啶為1∶4時(shí)達(dá)到最高，這可能由于氯磺酸為強(qiáng)酸；當(dāng)V氯磺酸∶V吡啶＜1∶4時(shí)，過量的氯磺酸使部分納豆多糖分解，小分子糖類羥基基團(tuán)即使被硫酸基取代，也會(huì)被透析除去；當(dāng)V氯磺酸∶V吡啶＞1∶4時(shí)，吡啶過量，與氯磺酸反應(yīng)的吡啶環(huán)上的磺酰氯基團(tuán)達(dá)到飽和，取代羥基的硫酸基團(tuán)不會(huì)增多。因此，利用氯磺酸和吡啶制備硫酸化試劑的最佳比例為1∶4。

2.1.2V酯化試劑∶V多糖對(duì)酯化多糖取代度的影響

取納豆多糖 0.1 g，在V氯磺酸∶V吡啶為 1∶3、酯化溫度70 ℃、酯化時(shí)間2 h的條件下，測定V酯化試劑∶V多糖對(duì)酯化納豆多糖的多糖取代度的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖 3 V酯化試劑∶V多糖對(duì)酯化多糖的多糖取代度的影響Fig.3 Effect of volume ratio of sulfate reagent and natto polysaccharide on degree of substitution of sulfated polysaccharide

由圖3可知，隨著V酯化試劑與V多糖比例的增加，酯化多糖的取代度先增加后降低。原因可能為以N，N–二甲基甲酰胺為分散劑，配制不同體積的納豆多糖溶液，當(dāng)V酯化試劑∶V多糖＜4∶1時(shí)，分散劑的量較低，不足以使全部納豆多糖與酯化試劑反應(yīng)，部分納豆多糖被碳化，導(dǎo)致取代度降低。此外，酯化試劑較多時(shí)，也會(huì)使納豆多糖出現(xiàn)板結(jié)碳化現(xiàn)象；當(dāng)V酯化試劑∶V多糖＞4∶3時(shí)，分散劑太多，使納豆多糖中的C位被硫酸基充分取代。劉捷等[14]對(duì)皺皮木瓜多糖的硫酸酯化研究發(fā)現(xiàn)，氯磺酸與多糖的比例大于30（mL）∶1（mg）時(shí)，酯化木瓜多糖的取代度不再增加，因?yàn)轷セ噭┨砑恿吭龃髸r(shí)，酯化溶液粘稠性增強(qiáng)，攪拌不均勻，使酯化多糖產(chǎn)率降低。因此，V酯化試劑與V多糖的最佳比例為4∶3。

2.1.3 酯化時(shí)間對(duì)取代度的影響

取納豆多糖 0.1 g，在V氯磺酸∶V吡啶為 1∶3、V酯化試劑∶V多糖為 4∶3、酯化溫度為 70 ℃的條件下，測定酯化溫度對(duì)硫酸化納豆多糖取代度的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，酯化多糖取代度隨著酯化時(shí)間的延長先升高后降低，酯化時(shí)間為2 h時(shí)達(dá)到最高。原因可能為酯化時(shí)間較短，硫酸基對(duì)納豆多糖羥基的取代反應(yīng)不完全；酯化時(shí)間過長，納豆多糖長時(shí)間處于酸性條件下會(huì)被水解，不利于酯化多糖的提取回收。因此，納豆多糖最佳的酯化時(shí)間為2 h。高爽等[15]采用濃硫酸法修飾甜玉米芯多糖，反應(yīng)溫度為30 min，取代度為1.14。多糖樣品與濃硫酸直接接觸，很容易被碳化和降解，反應(yīng)時(shí)間不能太長，氯磺酸–吡啶試劑相對(duì)溫和，反應(yīng)時(shí)間延長才能提高硫酸基取代度。

圖 4 酯化時(shí)間對(duì)酯化多糖取代度的影響Fig.4 Effect of sulfated time on degree of substitution of sulfated polysaccharides

2.1.4 酯化溫度對(duì)取代度的影響

取納豆多糖 0.1 g，在V氯磺酸∶V吡啶為 1∶3、V酯化試劑∶V多糖為 4∶3、酯化時(shí)間為 2 h的條件下，測定酯化溫度對(duì)硫酸化納豆多糖取代度的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖 5 酯化溫度對(duì)酯化多糖取代度的影響Fig.5 Effect of sulfated temperature on degree of substitution of sulfated polysaccharides

由圖5可知，隨著酯化溫度的升高，酯化納豆多糖的取代度先增加后降低，在溫度60 ℃時(shí)達(dá)到最高。當(dāng)溫度低于60 ℃時(shí)，納豆多糖與酯化試劑反應(yīng)速度較慢，原因可能為在一定時(shí)間內(nèi)，納豆多糖基團(tuán)中硫酸根離子較少，取代度小，隨著溫度的升高，高分子多糖活性增強(qiáng)，反應(yīng)速度加快，取代度逐漸升高；酯化溫度大于60 ℃并且反應(yīng)體系為酸性時(shí)，納豆多糖會(huì)被高溫降解，導(dǎo)致酯化納豆多糖回收率低，取代度下降。闞國仕等[16]采用三氧化硫–吡啶法硫酸化修飾胡蘿卜多糖，反應(yīng)溫度為70 ℃時(shí)取代度最高。三氧化硫與吡啶的結(jié)合率比氯磺酸低，升高溫度可以提高硫酸基團(tuán)取代羥基的能量。因此，在氯磺酸–吡啶法中，酯化反應(yīng)的最適溫度較低，為60 ℃。

2.2 酯化反應(yīng)條件的優(yōu)化

設(shè)置V氯磺酸∶V吡啶、V酯化試劑∶V納豆多糖、酯化溫度與酯化時(shí)間四因素的正交試驗(yàn)條件，其試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1所示。

由表 1可知，利用V氯磺酸∶V吡啶、V酯化試劑∶V納豆多糖、酯化溫度與酯化時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)得出，各因素影響酯化多糖取代度的主次順序?yàn)轷セ瘯r(shí)間＞V氯磺酸:V吡啶＞V酯化試劑:V多糖＞酯化溫度，即酯化時(shí)間對(duì)取代度的影響最大，其中最佳酯化條件是V氯磺酸∶V吡啶為1∶4、V酯化試劑∶V多糖為4∶3、酯化時(shí)間為 1 h、酯化溫度為 60 ℃，此最適條件不在正交表中，需做驗(yàn)證試驗(yàn)。驗(yàn)證結(jié)果表明，正交試驗(yàn)得出的最佳工藝條件下，酯化多糖的取代度可達(dá)1.613，相比單因素試驗(yàn)最優(yōu)試驗(yàn)結(jié)果，取代度提高了1.19%。陳小紅[17]采用氨基磺酸為改性試劑，對(duì)茯苓多糖進(jìn)行硫酸酯化，經(jīng)過單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得出，酯化溫度為85 ℃、酯化時(shí)間達(dá)4.0 h、氨基磺酸與多糖質(zhì)量比為3.77∶1時(shí)，酯化茯苓多糖的取代度為1.041，并且與氯磺酸–吡啶法的結(jié)果相似。證明了氯磺酸–吡啶法在合適的酯化條件下，可以有效地對(duì)多糖進(jìn)行硫酸化改性。

表 1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.1 Design and results of orthogonal experiment

2.3 紅外光譜分析

采用溴化鉀壓片法，測得酯化多糖紅外光譜圖，如圖6所示。

圖 6 納豆多糖和硫酸酯化多糖的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectra of nattopolysaccharidesand sulphated polysaccharides

圖6為納豆多糖（P-natto）和硫酸酯化多糖（SP-natto）的紅外光譜圖。在酯化納豆多糖色譜圖中，在3 474.13 /cm處的兩個(gè)吸收峰為O—H及N—H的伸縮振動(dòng)峰，在2 943 /cm處的吸收峰為C—H的伸縮振動(dòng)，在1 640.16 /cm處吸收峰是C=O的伸縮振動(dòng)，在1 128.15 /cm處的吸收峰是C—O—C的伸縮振動(dòng)，以上均為多糖的特征吸收峰。相比納豆多糖的振動(dòng)吸收峰，酯化多糖在1 239 /cm處的吸收為 S=O的伸縮振動(dòng)峰，808.03 /cm處吸收為C—O—S的伸縮振動(dòng)峰，兩者是硫酸酯的特征吸收峰[18]，說明納豆多糖經(jīng)硫酸酯化后，硫酸基已與納豆多糖結(jié)合成多糖硫酸酯。

2.4 酯化多糖的抑菌作用研究

2.4.1 酯化多糖與納豆多糖對(duì)阪岐桿菌的抑制作用

分別配制一定濃度的硫酸酯化多糖與納豆多糖，探究相同濃度的兩種多糖對(duì)阪岐桿菌的抑制作用，抑制效果如圖7所示。納豆多糖與酯化多糖隨著濃度的增加，其抑菌圈直徑逐漸變大。質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，酯化多糖的抑菌圈直徑小于納豆多糖，說明酯化多糖抑制阪岐桿菌的效果低于納豆多糖；隨著濃度的增高，酯化多糖的抑菌圈直徑均大于納豆多糖，表明了在高濃度條件下，酯化多糖抑制阪岐桿菌的效果將逐漸高于納豆多糖。

圖 7 酯化多糖和納豆多糖對(duì)阪岐桿菌的抑制作用Fig.7 Inhibition of Bntorobater sakazakii by sulphated polysaccharides and natto polysaccharides

2.4.2 酯化多糖與納豆多糖對(duì)嗜水氣單胞菌的抑制作用

在相同濃度下，酯化多糖與納豆多糖對(duì)嗜水氣單胞菌的抑制作用如圖8所示。隨著濃度的增高，硫酸酯化多糖的抑菌圈直徑一直大于納豆多糖，結(jié)果表明，納豆多糖經(jīng)硫酸酯化提高其硫酸根含量后，相同濃度下，酯化多糖對(duì)嗜水氣單胞菌的抑制作用高于納豆多糖。

圖 8 酯化多糖和納豆多糖對(duì)嗜水氣單胞菌的抑制作用Fig.8 Inhibition of Aeromonas hydrophila by sulphated polysaccharides and natto polysaccharides

2.4.3 酯化多糖與納豆多糖對(duì)大腸桿菌的抑制作用

在相同濃度下，酯化多糖與納豆多糖對(duì)大腸桿菌的抑制作用如圖9所示。隨著多糖濃度的增加，酯化多糖和納豆多糖的抑菌圈直徑也在增大，但在1～10 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，酯化多糖的抑菌圈直徑小于納豆多糖，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度大于10 mg/mL時(shí)，兩種多糖的抑菌圈直徑均增大，而酯化多糖增加的幅度更大。結(jié)果表明，酯化多糖和納豆多糖對(duì)大腸桿菌都有抑制作用，但在質(zhì)量濃度在1～10 mg/mL范圍內(nèi)，納豆多糖的抑制效果高于納豆多糖；多糖質(zhì)量濃度在15～20 mg/mL中，兩種多糖的抑制效果相似；李公斌[19]探究了黑木耳多糖經(jīng)硫酸酯化后的抑菌功能，研究表明：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，對(duì)大腸桿菌的抑制作用為硫酸酯化黑木耳多糖大于黑木耳多糖。本試驗(yàn)的培養(yǎng)時(shí)間為24 h，若培養(yǎng)時(shí)間延長，酯化多糖對(duì)大腸桿菌的抑制效果有可能超越納豆多糖。

圖 9 酯化多糖和納豆多糖對(duì)大腸桿菌O157的抑制作用Fig.9 Inhibition of Escherichia coli O157 by sulphated polysaccharides and natto polysaccharides

3 結(jié) 論

a. 通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了硫酸酯化的最佳工藝條件：V氯磺酸∶V吡啶為1∶4，V酯化試劑∶V納豆多糖為 4∶3，酯化時(shí)間為 1 h，酯化溫度為60 ℃。在此工藝條件下，硫酸化納豆多糖的取代度為1.613。

b. 紅外光譜結(jié)果證實(shí)了納豆多糖經(jīng)硫酸酯化后，硫酸基已與納豆多糖成功結(jié)合成多糖硫酸酯。

c. 硫酸化納豆多糖對(duì)阪岐桿菌與嗜水氣單胞菌的抑制作用比納豆多糖高，且呈現(xiàn)劑量依賴性，而對(duì)大腸桿菌的抑制作用接近納豆多糖。