白豆蔻揮發(fā)油對(duì)慶大霉素所致急性腎損傷大鼠中Caspase-3、Bcl-2、Bax及NF-кB p65蛋白表達(dá)的影響

程小玲，豐姝姝，張珂*，王航宇，劉博,2，王金輝,3

(1 石河子大學(xué)藥學(xué)院/新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002；2 四川大學(xué)華西醫(yī)院/生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生物治療協(xié)同創(chuàng)新中心，四川 成都 610041；3 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150081)

白豆蔻收錄于2015版中國(guó)藥典(第一部)，為姜科植物白豆蔻AmomurnkravanhPierre ex Gagnep.或爪哇白豆蔻AmomumcompactumSoland ex Maton.的干燥成熟果實(shí)，功能化濕行氣、溫中止嘔、開(kāi)胃消食，主治濕濁中阻、不思飲食、胸悶不饑、寒濕嘔逆、胸腹脹痛、食積不消等癥?，F(xiàn)代研究中已有白豆蔻粉末對(duì)阿霉素腎病模型大鼠的機(jī)制研究以及白豆蔻揮發(fā)油對(duì)糖尿病腎病模型大鼠的保護(hù)作用研究，結(jié)果表明白豆蔻在治療腎病方面具有一定的療效[1-2]。但是對(duì)于將白豆蔻揮發(fā)油用于慶大霉素所致急性腎損傷機(jī)制方面的研究還很少，白豆蔻揮發(fā)油作為藥典所記錄的含量測(cè)定成分，對(duì)其對(duì)慶大霉素所致急性腎損傷進(jìn)行研究有一定的意義。

慶大霉素是常用抗生素之一，在治療疾病上具有很好的療效，但是如果長(zhǎng)期使用慶大霉素會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的副作用，各項(xiàng)研究表明連續(xù)治療使用7 d以上的患者極易出現(xiàn)腎毒性[3]，甚至是出現(xiàn)急性腎損傷，這為使用慶大霉素來(lái)治療疾病帶來(lái)了極大的風(fēng)險(xiǎn)。有研究表明，慶大霉素所致急性腎損傷可能與氧化應(yīng)激，細(xì)胞凋亡，炎癥反應(yīng)，自噬等有關(guān)[4]。本研究對(duì)白豆蔻揮發(fā)油對(duì)慶大霉素所致急性腎損傷的作用機(jī)制進(jìn)行了一定的研究，以期為白豆蔻揮發(fā)油作為治療腎病的有效藥物提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

健康清潔級(jí)Srague-Dawley(SD)雄性大鼠60只，體重在200～250 g之間，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(新)2016-0001。飼養(yǎng)于溫、濕度適宜，通風(fēng)良好的動(dòng)物房，自由飲食，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2 藥品及主要試劑

白豆蔻(由安國(guó)圣山藥業(yè)有限公司提供，產(chǎn)地：廣西)；硫酸慶大霉素注射液(批號(hào)：1804164)：河南潤(rùn)紅制藥股份有限公司；維拉帕米(批號(hào)：180201)：天津市中央藥業(yè)有限公司；一氧化氮合成酶(NOS)(批號(hào)：20190226)、肌酐(Cr)(批號(hào)：20190307)、一氧化氮(NO)(批號(hào)：20190307)、尿素氮(Bun)(批號(hào)：20190308)、超氧化物歧化酶(SOD)(批號(hào)：20190308)、丙二醛(MDA)(批號(hào)：20190308)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)(批號(hào)：20190308)、尿蛋白(批號(hào)：20190311)測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所；Caspase3抗體(批號(hào)：0911412Da9488120)、Bax抗體(批號(hào)：13CM400 A)、NF-кB p65抗體(批號(hào)：BM3940)、Bcl-2抗體(批號(hào)：196841)：博士德公司；β-actin 抗體(批號(hào)：16A00205)、山羊抗兔抗體(批號(hào)：129256)、山羊抗小鼠抗體(批號(hào)：127655)：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器

Legend Micro 21R高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher)、GT200震動(dòng)球磨儀(上海凈信)、power wave XS2酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD 公司)、DYCZ-24DN制膠器(北京六一生物科技有限公司)、Axio Imager 2光學(xué)顯微儀(ZEISS)、CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司)、DYCZ-40D型電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備

白豆蔻揮發(fā)油：藥材粉碎成粗粉，稱取100 g，置于圓底燒瓶中，加5倍量蒸餾水浸泡1 h，按照《中國(guó)藥典》2015年版揮發(fā)油測(cè)定法(通則2204甲法)提取制備[5]，置電熱套中緩緩加熱至沸，保持微沸提取6 h，至白豆蔻揮發(fā)油量不再增加為止，靜置30 min，得白豆蔻揮發(fā)油5.62 mL(得率為5.62%)。將制備好的白豆蔻揮發(fā)油置于棕色瓶中，密閉保存，放入4 ℃冰箱中備用。

樣品溶液的配制：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前，分別取白豆蔻揮發(fā)油0.175、0.35、0.70 mL，加入溶液(0.5%的CMC-Na溶液：2%的吐溫-80溶液=5∶1)配制成0.098 4%、0.197%、0.393%的乳劑，折合成生藥質(zhì)量濃度分別為0.312 5、0.625、1.25 g·mL-1，4 ℃條件下保存，臨用前搖勻。

1.2.2 動(dòng)物分組、造模及樣本收集

將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、白豆蔻揮發(fā)油低、中、高劑量組及陽(yáng)性藥組(維拉帕米：15 mg·kg-1·d-1)6個(gè)組，每組10只，共50只。除空白對(duì)照組外，其它各組每天腹腔注射慶大霉素(140 mg·kg-1·d-1)1次，連續(xù)7 d，建立急性腎損傷模型。第8天起，均以0.04 mL/10 g給大鼠灌胃給藥，空白組和模型組給予0.5%的CMC-Na溶液和2%的吐溫-80溶液5∶1混合溶液，白豆蔻揮發(fā)油低、中、高各組分別給予低、中、高三種不同濃度的白豆蔻揮發(fā)油，陽(yáng)性藥組給予維拉帕米溶液，連續(xù)給藥28 d。

在實(shí)驗(yàn)第7天注射結(jié)束后，收集24 h內(nèi)大鼠尿液，眼眶采血收集大鼠血液。實(shí)驗(yàn)第35天，收集24 h內(nèi)大鼠尿液，腹主動(dòng)脈收集大鼠血液。處死大鼠，取其兩側(cè)腎臟，生理鹽水沖洗干凈后，濾紙擦干，拍照稱重；右腎固定在10%中性福爾馬林中。將所有尿液、血清和左腎組織樣本置于-80 ℃冰箱中凍存，待測(cè)。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè)

取尿液及血液樣本，對(duì)尿蛋白、Scr、Bun含量進(jìn)行檢測(cè)；取右腎組織進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察；取左腎組織樣本，制備10%腎皮質(zhì)勻漿，對(duì)MDA、NO含量及SOD、NOS，GSH-Px活性進(jìn)行檢測(cè)；取左腎組織樣本，制備腎組織勻漿，提取蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，Westem Blot法檢測(cè)腎組織勻漿中NF-кB p65，Caspase-3，Bax，Bcl-2蛋白的表達(dá)，β-actin為內(nèi)參，Ecl顯色，拍照，ImageJ 圖像分析軟件測(cè)定條帶的光密度，計(jì)算灰度值。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠急性腎損傷模型的判斷

注射慶大霉素7 d后，急性腎損傷模型造模大鼠出現(xiàn)尿蛋白、血清尿素氮(Bun)及血清肌酐(Scr)含量比空白對(duì)照組顯著增高(P<0.05)，表明連續(xù)注射慶大霉素7 d后，大鼠腎臟已受到損傷(表1)。

表1 大鼠血清中Bun、Scr 和尿蛋白含量測(cè)定結(jié)果 n=8

2.2 白豆蔻揮發(fā)油對(duì)急性腎損傷大鼠腎體指數(shù)及外觀的影響

治療結(jié)束后，模型組大鼠腎組織相較于空白對(duì)照組大鼠腎組織，腎體指數(shù)顯著增高(P<0.05)；白豆蔻揮發(fā)油各組大鼠相較于模型組大鼠，白豆蔻揮發(fā)油中、高各劑量組及陽(yáng)性藥組大鼠腎體指數(shù)顯著減少(P<0.05)。此外，從圖1中可以看出，模型組大鼠腎臟明顯增大，而白豆蔻揮發(fā)油各治療組及陽(yáng)性藥組有一定的改善，改善結(jié)果有一定的劑量依賴性。各組腎體指數(shù)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 白豆蔻揮發(fā)油對(duì)大鼠的腎臟指數(shù)的影響 n=8

A—空白對(duì)照；B—模型；C—揮發(fā)油低劑量；D—揮發(fā)油中劑量；E—揮發(fā)油高劑量；F—陽(yáng)性藥

2.3 白豆蔻揮發(fā)油對(duì)急性腎損傷大鼠尿蛋白、Bun及Scr的影響

治療后對(duì)尿液及血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示模型組大鼠尿液和血清中尿蛋白、Bun及Scr含量相較空白對(duì)照組均顯著增高(P<0.05)；白豆蔻揮發(fā)油各組相較于模型組，白豆蔻揮發(fā)油中、高各劑量組及陽(yáng)性藥組大鼠尿液和血清中尿蛋白、Bun及Scr含量均顯著減少(P<0.05)，改善結(jié)果有一定的劑量依賴性(表3)。

表3 白豆蔻揮發(fā)油對(duì)大鼠的尿蛋白、血清尿素氮及血清肌酐的影響 n=8

2.4 HE染色(圖2)

圖2顯示模型組大鼠右腎組織發(fā)生了明顯的病理變化，腎小管出現(xiàn)高度擴(kuò)張，嚴(yán)重壞死等；相較模型組，除揮發(fā)油低劑量外，其余每組腎小管損傷有所減輕，其中揮發(fā)油高劑量組減輕效果最好。

2.5 白豆蔻揮發(fā)油對(duì)MDA和NO含量，SOD、NOS及GSH-Px活力的影響

腎組織檢測(cè)結(jié)果顯示。模型組大鼠腎組織中MDA含量、NO含量和NOS活性相較空白對(duì)照組明顯增高(P<0.05)，而SOD活性及GSH-Px活性顯著下降(P<0.05)。白豆蔻揮發(fā)油中、高各劑量組及陽(yáng)性藥組對(duì)大鼠腎組織MDA含量、NO含量及NOS活性的升高表現(xiàn)出顯著降低，并且對(duì)SOD及GSH-Px活性的降低表現(xiàn)出明顯的升高作用(P<0.05)，改善結(jié)果有一定的劑量依賴性。各組MDA、NO含量及SOD、GSH-Px、NOS活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 白豆蔻揮發(fā)油對(duì)腎組織中MDA、NO含量及SOD、GSH-Px、NOS活力的影響 n=8

2.6 Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

模型組大鼠腎組織中NF-кB p65，Caspase-3，Bax蛋白表達(dá)和空白對(duì)照組相比顯著增高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，白豆蔻揮發(fā)油中、高各劑量組，及陽(yáng)性藥組與模型組相比NF-кB p65，Caspase-3，Bax蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)(圖3)。

與空白對(duì)照相比##P<0.01；與模型組相比**P<0.01,*P<0.05。

3 討論

慶大霉素作為臨床常用的抗生素類(lèi)藥物會(huì)引起嚴(yán)重的腎毒性，其能在腎小管上皮細(xì)胞和溶酶體等堆積而對(duì)代謝造成障礙，導(dǎo)致腎小管受損，甚至引發(fā)急性腎損傷[6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腹腔注射慶大霉素導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)急性腎損傷來(lái)探討了白豆蔻揮發(fā)油對(duì)慶大霉素所致急性腎損傷的影響。研究結(jié)果顯示白豆蔻揮發(fā)油可以改善尿蛋白含量，血清Bun、Scr含量變化，表明白豆蔻揮發(fā)油可以促進(jìn)物質(zhì)代謝產(chǎn)物的排出，從而改善腎功能障礙[7-8]。有研究表明慶大霉素所致的急性腎損傷可以通過(guò)在溶酶體，高爾基體等細(xì)胞器的堆積，最終導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，其主要是通過(guò)線粒體通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9-11]。研究結(jié)果顯示白豆蔻揮發(fā)油可以改善腎組織中MDA、SOD、GSH-Px、NO和NOS的改變，表明白豆蔻揮發(fā)油對(duì)腎組織中ROS的釋放有改善作用。ROS的過(guò)度釋放，可以直接或間接導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，表明白豆蔻可以通過(guò)抑制ROS的釋放來(lái)改善細(xì)胞凋亡[12]。另外，白豆蔻揮發(fā)油還可以抑制凋亡相關(guān)蛋白NF-кB p65、Caspase-3、Bax蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2蛋白的表達(dá)，表明白豆蔻揮發(fā)油一方面可以直接通過(guò)抑制Bax蛋白的表達(dá)、促進(jìn)Bcl-2蛋白的表達(dá)來(lái)抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C，從而抑制細(xì)胞凋亡，另一方面，還可以通過(guò)抑制IкB蛋白裂解導(dǎo)致的NF-кB二聚體解體后進(jìn)入細(xì)胞核所引起的凋亡蛋白基因Bcl-2、Bax的改變來(lái)間接抑制細(xì)胞凋亡[13]。此外，在模型組大鼠腎組織中可以觀察到嚴(yán)重鈣化現(xiàn)象，其它各組有所改善，表明白豆蔻揮發(fā)油還可以抑制Ca2+內(nèi)流引起的細(xì)胞凋亡[13]。

白豆蔻作為一種傳統(tǒng)中藥，大量研究發(fā)現(xiàn)白豆蔻具有鎮(zhèn)咳祛痰平喘、抗炎、促消化等多種作用[14-15]。此外，白豆蔻在治療腎病方面有廣泛的應(yīng)用，在蒙醫(yī)和藏醫(yī)中均有治療腎病的記載，現(xiàn)代運(yùn)用中在對(duì)慢性腎衰、慢性腎盂腎炎、急慢性腎風(fēng)、難治性腎病綜合征等多種腎病的治療時(shí)也均有白豆蔻的使用記錄，表明其在治療腎病方面具有一定的療效。白豆蔻的藥用部位為干燥成熟果實(shí)，其中富含揮發(fā)油，揮發(fā)油作為一種混合物，其中含有1，8-桉油精(1,8-cineole)、α-蒎烯(α-pinene)、樟腦(camphor)等多種成分[16]，其中1，8-桉油精為其主要成分，由于產(chǎn)地不同1，8-桉油精含量有一定的差異，約在49%～82%之間。有研究表明1，8-桉油精具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、殺蟲(chóng)、鎮(zhèn)痛等作用[17-19]。也有研究表明，白豆蔻揮發(fā)油具有抗失眠、殺蟲(chóng)、抗氧化等作用[20-22]。現(xiàn)代研究中對(duì)白豆蔻揮發(fā)油對(duì)腎病治療機(jī)制的研究還很少，運(yùn)用現(xiàn)代研究方法可以逐漸闡明白豆蔻揮發(fā)油的作用機(jī)制，解釋白豆蔻揮發(fā)油治療腎病的科學(xué)內(nèi)涵。本文主要探討了白豆蔻揮發(fā)油在凋亡通路上對(duì)慶大霉素所致急性腎損傷的影響，在其它機(jī)制作用方面的探究有所欠缺，此外白豆蔻揮發(fā)油對(duì)其它腎病的作用效果也有待進(jìn)一步研究。