設(shè)施番茄表皮蠟質(zhì)測(cè)定及脂肪醇合成基因的表達(dá)分析

封文佳，韓瑞瑞，李嘉麗，柴乖強(qiáng)

(榆林學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 榆林 719000)

陜西省榆林市屬于典型的干旱半干旱氣候[1]，長(zhǎng)期風(fēng)蝕、水蝕導(dǎo)致地表土壤中有機(jī)質(zhì)流失嚴(yán)重，土地生產(chǎn)力降低，形成荒漠化[2，3]；本地區(qū)年降雨稀少集中，植物的生長(zhǎng)環(huán)境較為惡劣，從而導(dǎo)致整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)具有脆弱性和不穩(wěn)定性。但是，榆林市全年光照條件好，地理優(yōu)勢(shì)明顯，是陜西乃至全國(guó)設(shè)施農(nóng)業(yè)發(fā)展的優(yōu)生區(qū)。近年來(lái)，榆林市大力發(fā)展設(shè)施農(nóng)業(yè)，已形成突出區(qū)域特色的設(shè)施蔬菜種植區(qū)[4，5]，可以有效地緩解淡季供需矛盾，新鮮蔬菜的供給得到有效保障，為促進(jìn)產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展、增產(chǎn)增收和貧困地區(qū)脫貧攻堅(jiān)做出了積極的貢獻(xiàn)。然而，由于設(shè)施蔬菜的連茬及重茬種植，使得在設(shè)施番茄生產(chǎn)中，病蟲害有逐年加重的趨勢(shì)[6]。

植物表皮蠟質(zhì)是植物表皮中能溶于有機(jī)溶劑而不溶于水的一層晶體結(jié)構(gòu)。其主要成分由酸、烷烴、脂肪醇、酯類、醛等組成。表皮蠟質(zhì)因能限制非氣孔性水分散失、阻止真菌孢子的擴(kuò)散，因此在植物抗旱和病蟲害防治方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[7]。表皮蠟質(zhì)層是植物病原菌與宿主最先接觸的區(qū)域，因此表皮蠟質(zhì)勢(shì)必在病原菌活動(dòng)中起到關(guān)鍵性作用，有研究表明，表皮蠟質(zhì)可以影響病原菌分生孢子的萌發(fā)和孵化[8]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)番茄蠟質(zhì)合成的機(jī)理研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但是對(duì)設(shè)施栽培條件下，其表皮蠟質(zhì)的成分和晶體還鮮有報(bào)道，因此本試驗(yàn)采用GC-MS技術(shù)和電鏡掃描，對(duì)設(shè)施番茄果實(shí)著色后期的葉片和果實(shí)表皮蠟質(zhì)成分、含量及晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定和分析，同時(shí)運(yùn)用qPCR技術(shù)鑒定番茄中脂肪醇合成相關(guān)基因的表達(dá)，以期為番茄抗病蟲育種及揭示設(shè)施番茄蠟質(zhì)合成機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料選取抗病、高產(chǎn)品種“長(zhǎng)豐5號(hào)”，番茄種子從榆林市莊稼醫(yī)院種子公司購(gòu)置。選取飽滿的番茄種子，播于花盆中，選用園藝通用的混合基質(zhì)栽培，在榆林學(xué)院西區(qū)日光溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，待幼苗長(zhǎng)到高約15 cm的時(shí)候，將生長(zhǎng)一致的番茄秧苗以每穴1株，轉(zhuǎn)移到鋪設(shè)有滴灌袋的膜下栽培，生長(zhǎng)約2個(gè)月后，采集生長(zhǎng)一致，且葉位相同的葉片和果實(shí)材料進(jìn)行蠟質(zhì)測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)5次。

圖1 番茄材料的種植

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 番茄葉片及果實(shí)表皮蠟質(zhì)的提取

根據(jù)柴乖強(qiáng)[9]提取蠟質(zhì)的方法提取番茄葉片及果實(shí)表皮蠟質(zhì)并準(zhǔn)備CG-MD檢測(cè)。

1.2.2 GC-MS檢測(cè)分析

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)分析方法參考WangZH等[10]的方法并做了部分修改。分析條件為：載氣為氦氣，進(jìn)樣量1微升，進(jìn)樣口溫度為300 ℃，分流比2.5∶1，檢測(cè)器溫度320 ℃。升溫程序：50 ℃保持2 min，以20 ℃/min升溫至250 ℃，并保持2min，再以2.0 ℃/min升溫至320 ℃，保持15 min?；衔锝?jīng)GC-MS檢測(cè)后，得到其離子峰，并借助質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索以定性化合物的類型。

1.2.3 掃描電鏡分析葉片及果實(shí)表皮蠟質(zhì)晶體

在番茄果實(shí)成熟期，取番茄葉片或用鑷子撕下番茄果實(shí)的表皮，用曲別針固定于白紙板上，50 ℃烘箱里烘干24 h。掃描前，用刀片小心割下5 mm×5 mm大小葉片樣品，用雙面膠粘貼在樣品臺(tái)上進(jìn)行噴金鍍膜處理，置于場(chǎng)發(fā)射電子掃描電鏡(Hitac Hi S-4800)中觀察蠟質(zhì)晶體的結(jié)構(gòu)形態(tài)。

1.2.4 番茄脂肪醇合成相關(guān)基因的鑒定與表達(dá)分析

在番茄的成熟期，分別取葉片、果皮及根部，用無(wú)菌水清洗干凈并吸干水分，保存于液氮中。提取番茄這三個(gè)部位的RNA(方法參考天根RNA提取試劑盒)，在檢測(cè)合格后，分成兩管，一管進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，其余送至北京諾禾致源公司進(jìn)行二代測(cè)序分析，基因的表達(dá)聚類分析采用廣州基迪奧生物科技有限公司開發(fā)的在線工具(https://www.omicshare.com/tools/)進(jìn)行。

qRT-PCR反應(yīng)采用CFX96 Real-time PCR detection Systems，按照SYBR?Premix Ex TaqTM(TliRNase H Plus)試劑盒(大連TaKaRa公司)操作說(shuō)明進(jìn)行。相對(duì)定量參照ΔΔCt法，表達(dá)差異值采用2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算，ΔΔCt=ΔCt目標(biāo)基因-ΔCtactin。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并使用SigmaPlot12.5進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 設(shè)施番茄葉片和果實(shí)表皮蠟質(zhì)含量分析

通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)了設(shè)施番茄葉片和果實(shí)表皮蠟質(zhì)成分和含量，結(jié)果表明，番茄葉片總蠟質(zhì)含量顯著低于果實(shí)(P<0.05)(圖2-A)，設(shè)施番茄葉片和果實(shí)表皮蠟質(zhì)的成分相同，都含有脂肪酸、醛、直連烷烴、支鏈烷烴、脂肪醇和三萜類等6種化合物，其中直鏈烷烴含量在各種成分中占據(jù)主導(dǎo)地位，其含量在兩類器官中為790-905 μg·dm-2，其次是支鏈烷烴和三萜類化合物，超長(zhǎng)鏈脂肪醇含量在6類化合物中僅排第四，總含量不高(25-53 μg·dm-2)。此外，通過(guò)比較，果實(shí)中的脂肪醛、支鏈烷烴、脂肪醇和三萜的總量均顯著高于葉片(P<0.05)(圖2-B)。

圖2 番茄葉片和果實(shí)蠟質(zhì)含量分析

2.2 設(shè)施番茄葉片和果實(shí)表皮蠟質(zhì)中超長(zhǎng)鏈脂肪醇分析

研究表明，超長(zhǎng)鏈脂肪醇合成相關(guān)基因能調(diào)控植物表皮蠟質(zhì)片狀晶體的生物合成，因此我們分析番茄葉片和果實(shí)中脂肪醇各個(gè)鏈長(zhǎng)，結(jié)果表明：C32脂肪醇在所有碳鏈化合物中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其次是C28醇；設(shè)施番茄葉片中脂肪醇的鏈長(zhǎng)分布范圍較小，僅從C24到C32，沒(méi)有檢測(cè)到C22醇和C34醇；而果實(shí)中脂肪醇的鏈長(zhǎng)分布范圍較大，從C22到C34，說(shuō)明番茄果實(shí)中合成的脂肪醇對(duì)鏈長(zhǎng)的偏好性更強(qiáng)，可能分別存在一些對(duì)C22和C34醇偏好的基因。

圖3 番茄葉片和果實(shí)蠟質(zhì)中超長(zhǎng)鏈脂肪醇鏈長(zhǎng)分析

2.3 設(shè)施番茄葉片和果實(shí)表皮蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析

采用掃描電鏡分別對(duì)設(shè)施番茄葉片和果實(shí)表皮進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，番茄葉片和果實(shí)表皮呈現(xiàn)出不同的蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)。番茄葉片正(圖4-A，4-B)、反面(圖4-C，4-D)均呈現(xiàn)出光滑、無(wú)蠟質(zhì)晶體出現(xiàn)。而果實(shí)表皮的蠟質(zhì)晶體呈現(xiàn)出較為整齊的片狀結(jié)構(gòu)(圖4-E，4-F)。

圖4 番茄葉片和果實(shí)表皮蠟質(zhì)晶體在掃描電鏡分析

2.4 番茄超長(zhǎng)鏈脂肪醇合成基因的鑒定與表達(dá)分析

為了研究調(diào)控番茄中的片狀蠟質(zhì)晶體合成的分子機(jī)理，我們基于番茄的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)13個(gè)參與片狀蠟質(zhì)合成的差異基因，并且在番茄不同的組織中，存在特異表達(dá)的基因(圖5)。為了確定轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性，利用qPCR對(duì)果實(shí)和葉片中所有的基因進(jìn)行了表達(dá)分析，結(jié)果表明，所有基因的表達(dá)主要表現(xiàn)為三種類型，分別為在果實(shí)中高表達(dá)、在葉片中高表達(dá)和在兩種器官中均有表達(dá)。定量表達(dá)的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果相互吻合(圖6)。

圖5 番茄葉片、果實(shí)和根中鑒定超長(zhǎng)鏈脂肪醇合成基因

圖6 超長(zhǎng)鏈脂肪醇合成基因在番茄果實(shí)和葉片中的表達(dá)分析

3 結(jié)論與討論

有研究表明，植物表皮蠟質(zhì)能夠抵抗病蟲害的入侵、抗病、限制非氣孔性水分的散失等，在植物抗旱保水和抵御病蟲害等過(guò)程中發(fā)揮著及其重要的作用[11-13]。植物表皮蠟質(zhì)層也是植物病原菌與宿主首先接觸的部分，因此表皮蠟質(zhì)勢(shì)必在病原菌活動(dòng)中起到關(guān)鍵性作用，例如，表皮蠟質(zhì)可以影響病原菌分生孢子的萌發(fā)和孵化[8]。表皮層蠟質(zhì)不僅可以保護(hù)植物不受病原微生物的侵害，同時(shí)還能保護(hù)植物免受昆蟲的侵?jǐn)_。例如沒(méi)有表皮層蠟質(zhì)的植物相比那些有蠟質(zhì)層的植物來(lái)說(shuō)，更易遭受食草性昆蟲的侵襲，主要的原因是害蟲更容易附著在蠟質(zhì)稀少的植物體表面[14]。設(shè)施溫室條件下，由于濕度較大，經(jīng)常會(huì)面臨病蟲害的發(fā)生，因此研究設(shè)施番茄表皮蠟質(zhì)的合成機(jī)理對(duì)于設(shè)施植物的抗病育種具有重要的理論意義。

當(dāng)前，關(guān)于植物表皮蠟質(zhì)的成分和蠟質(zhì)合成機(jī)制，已經(jīng)有較多的研究。其中研究最為透徹的是模式植物擬南芥，其表皮蠟質(zhì)的成分主要由一些C20—C34的超長(zhǎng)鏈脂肪酸及其衍生物組成，主要包括脂肪酸、醛、烷烴、初級(jí)醇、次級(jí)醇、酮類、酯類及少量二醇類。本文利用GC-MS測(cè)定了設(shè)施番茄葉片和果皮表皮蠟質(zhì)的成分和含量，結(jié)果表明，番茄葉片和果皮的蠟質(zhì)成分相同，都含有脂肪酸、脂肪醛、直連烷烴、支鏈烷烴、脂肪醇和三萜類等6種化合物，結(jié)果與擬南芥中蠟質(zhì)的主要成分相似。

植物表皮蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)在不同的物種間存在顯著差異。前人通過(guò)光學(xué)顯微鏡、場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡等可以清晰地看到植物表皮蠟質(zhì)晶體形態(tài)與結(jié)構(gòu)，它們存在著各種不同的性狀，如顆粒狀、桿狀和具鉤的小桿狀等。Barthlott研究了13000多種植物表皮蠟質(zhì)后，非常系統(tǒng)地對(duì)各種蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分類與命名。通過(guò)總結(jié)，他將蠟質(zhì)的晶體表觀形態(tài)描述為片狀、管狀、棒狀等26類。Barthlott等還發(fā)現(xiàn)，蠟質(zhì)表皮的晶體結(jié)構(gòu)在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程并不是固定的或一成不變的，而會(huì)隨著蠟質(zhì)成分或含量的變化而產(chǎn)生變化[15]。此外，在小麥等植物中的研究表明，蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)與其組分緊密相關(guān)，當(dāng)烷烴含量較高時(shí)，植物蠟質(zhì)呈現(xiàn)出無(wú)晶體或光滑結(jié)構(gòu)；脂肪醇含量占主導(dǎo)時(shí)，蠟質(zhì)呈現(xiàn)片狀結(jié)構(gòu)；而當(dāng)β-二酮和羥基-β-二酮占蠟質(zhì)總量較大時(shí)，蠟質(zhì)則呈現(xiàn)出管狀或棒狀結(jié)構(gòu)[16，17]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)設(shè)施番茄的葉片和果皮表皮蠟質(zhì)晶體結(jié)果存在較大差異，主要表現(xiàn)為番茄葉片正、反面均呈現(xiàn)出光滑、無(wú)蠟質(zhì)晶體出現(xiàn)，而果實(shí)表皮蠟質(zhì)晶體則呈現(xiàn)出較為整齊的片狀結(jié)構(gòu)，說(shuō)明調(diào)控番茄葉片和果皮蠟質(zhì)合成的基因不同，可能分別屬于蠟質(zhì)合成的不同調(diào)節(jié)通路中。

關(guān)于植物表皮片狀蠟質(zhì)晶體的合成研究也已經(jīng)有報(bào)道，研究表明，超長(zhǎng)鏈脂肪醇是植物表皮片狀蠟質(zhì)晶體的主要成分，控制其合成的酶為超長(zhǎng)鏈脂肪酰基輔酶A還原酶(Fatty acyl-coenzyme A Reductase, FAR)[9]。目前已經(jīng)分別從擬南芥[18]和小麥[19]中克隆了多個(gè)FAR基因，它們的生物學(xué)功能也已經(jīng)被研究清楚。同樣做為模式生物的番茄，其表皮片狀蠟質(zhì)晶體合成相關(guān)基因的研究還鮮見報(bào)道。因此，本研究以設(shè)施番茄為對(duì)象，通過(guò)高通量測(cè)序，鑒定出13個(gè)參與脂肪醇合成的基因，通過(guò)聚類和表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)這些基因主要分為三類，這三類基因分別在果皮、葉片和根中特異表達(dá)。本研究所鑒定出的這些特異基因是否也能真正參與調(diào)控蠟質(zhì)的合成，還有待進(jìn)一步研究。