動植物DNA主動去甲基化途徑及其調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

劉春雨,王 宇,解莉楠

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國黑龍江哈爾濱150040)

DNA甲基化是以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)作為甲基供體,經(jīng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)催化,在胞嘧啶的5位碳原子上添加1個(gè)甲基的過程,是一種很重要的表觀遺傳修飾。DNA甲基化調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和沉默,與癌癥和老年癡呆等許多疾病密切相關(guān),同時(shí)也調(diào)控很多關(guān)鍵的生物學(xué)過程,如抑制印記基因表達(dá)、使X染色體失活、控制基因組織特異性表達(dá)等[1]。

DNA甲基化分為從頭合成甲基化和維持甲基化。目前,人們已在哺乳動物中鑒定出3種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶:DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。DNMT1負(fù)責(zé)維持DNA甲基化,而DNMT3A和DNMT3B則負(fù)責(zé)DNA甲基化的從頭合成[2]。DNMT3L(DNMT3-like)雖然沒有甲基轉(zhuǎn)移酶的催化活性,但是可以調(diào)控DNMT3A和DNMT3B的表達(dá)[3～4]。動物中的DNA甲基化主要發(fā)生在CG位點(diǎn),并且在整個(gè)基因組范圍內(nèi)的CG位點(diǎn)都是高甲基化。植物中的DNA甲基化存在3種不同的類型,包括對稱的CG、CHG和非對稱的CHH(H代表堿基A、T或C)位點(diǎn)的甲基化,這些不同位點(diǎn)的甲基化的從頭合成都是由RNA介導(dǎo)的DNA甲基化 (RNA-di rected DNA methylation,RdDM)途徑來實(shí)現(xiàn)的[5]。通常,不同位點(diǎn)的甲基化需要不同的酶來維持。甲基轉(zhuǎn)移酶1(methyltransferase 1,MET1)是哺乳動物DNMT1的同源體,負(fù)責(zé)維持CG類型的甲基化[6]。CMT3(chromomethylase 3)是植物中特有的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶,是維持CHG位點(diǎn)甲基化所必需的[7]。DRM2(domains rearranged methyltransferase 2)在維持CHH位點(diǎn)甲基化的作用中最為突出,因?yàn)镃HH位點(diǎn)的甲基化主要依賴于DMR2參與的RdDM途徑,并且DMR2的活性受到Rd-DM途徑的調(diào)控[8～9]。動植物中的DNA甲基化不僅在發(fā)生位點(diǎn)上有所不同,而且在發(fā)生部位上也不盡相同。植物中的DNA甲基化主要發(fā)生在轉(zhuǎn)座子和其他重復(fù)的DNA序列；動物中的DNA甲基化則發(fā)生在基因的啟動子區(qū),主要抑制下游基因的表達(dá)。

為了保證基因在適當(dāng)?shù)陌l(fā)育階段進(jìn)行程序性表達(dá),生物體內(nèi)也會發(fā)生DNA去甲基化(demethylation)的現(xiàn)象。DNA去甲基化是指5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)被胞嘧啶取代的過程[10～11]。DNA去甲基化的過程要比甲基化的過程復(fù)雜得多。一般認(rèn)為,DNA去甲基化有兩種方式:主動去甲基化(active demethylation)和被動去甲基化(passive demethylation)[10～11]。被動去甲基化發(fā)生在 DNA復(fù)制時(shí)期。DNA復(fù)制屬于半保留復(fù)制,新合成的DNA鏈?zhǔn)菦]有任何修飾的。在正常情況下,一系列DNA甲基轉(zhuǎn)移酶參與DNA從頭修飾。當(dāng)這類維持機(jī)制被抑制或失活時(shí),每次復(fù)制都只會產(chǎn)生沒有發(fā)生甲基化修飾的DNA。這樣在多代復(fù)制后,生物體中的總體DNA甲基化水平就會逐漸降低。但通過這種“稀釋”的模式去除DNA甲基化的效率極低。所以,生物體需要通過其他的方式調(diào)節(jié)DNA甲基化程度,以應(yīng)答體外環(huán)境的變化。因此,主動去甲基化的過程在生物體內(nèi)至關(guān)重要。與DNA甲基化形成和維持機(jī)制相比,DNA去甲基化的機(jī)制還有待進(jìn)一步得到闡釋,本文主要對動植物中DNA主動去甲基化途徑及其調(diào)控機(jī)制的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述及比較分析,為后續(xù)相關(guān)研究提供理論支持。

1 植物DNA主動去甲基化

1.1 植物DNA主動去甲基化酶的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)分析

多項(xiàng)研究表明,植物體內(nèi)的DNA主動去甲基化過程主要是通過ROS1/DME(repressor of silencing 1/demeter)介導(dǎo)的堿基切除修復(fù)(base excision repair,BER)機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的[12～13]。2002 年Gong 等[14]利用RD29A-LUC(RD29A-luciferase)系統(tǒng)篩選到ros1突變體,該突變體導(dǎo)致RD29A啟動子處的DNA甲基化過高,從而使其沉默；同時(shí),體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)ROS1具有DNA糖基化酶的活性,這為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。同年,Choi等[15]在擬南芥中研究胚胎和胚乳發(fā)育過程時(shí)篩選到了dme突變體,隨后Gehring等[16]通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在dme突變體的種子胚乳中CG甲基化水平有所升高,表明DME可能在DNA去甲基化的過程中起作用。另有研究報(bào)道,該家族蛋白中的另外兩個(gè)蛋白質(zhì)DML2(demeter-like 2)和 DML3(demeter-like 3)也能夠識別所有類型的胞嘧啶甲基化并切除5mC[17]。相關(guān)的序列對比分析結(jié)果顯示,擬南芥ROS1/DME家族蛋白結(jié)構(gòu)中都包含HhH-GPD(helix-hairpinhelix-Gly-Pro-Asp)結(jié)構(gòu)域、FES(4Fe-4S)簇結(jié)構(gòu)域、與組蛋白H1相似的H1結(jié)構(gòu)域和未知功能的DUF結(jié)構(gòu)域(圖1)。其中,FES結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)酶的激活,HhH-GPD結(jié)構(gòu)域在ROS1/DME雙功能酶活性發(fā)揮中起著關(guān)鍵的作用[18]。

1.2 ROS1/DME介導(dǎo)的DNA主動去甲基化途徑

ROS1/DME介導(dǎo)的DNA主動去甲基化途徑是一種類似于DNA損傷修復(fù)中的堿基切除過程。當(dāng)甲基化的DNA存在時(shí),ROS1/DME會識別甲基化的胞嘧啶并且水解DNA鏈中的脫氧核苷酸和堿基之間的糖苷鍵,從而將其切除。當(dāng)裂解DNA骨架時(shí),ROS1和DME催化β消除反應(yīng)或δ消除反應(yīng)(圖 2)。β 消除反應(yīng)會產(chǎn)生 3′-磷酸-α,β-不飽和醛(3′-phosphoric acid-α,β-unsaturated aldehyde,3′-PUA)間隙,而 δ消除反應(yīng)則會產(chǎn)生 3′-磷酸末端間隙[13,19]。3′-磷酸和 3′-PUA 都會轉(zhuǎn)化為 3′-羥基(3′-OH),以便在DNA聚合酶和連接酶活性下可以填補(bǔ)間隙。許多蛋白質(zhì)參與了DNA去甲基化的過程,如ZDP(zinc finger DNA 3′phosphoesterase)和 APE1L(apurinic/apyrimidinic endonuclease)。全基因組甲基化分析表明,zdp突變體中上百個(gè)內(nèi)源基因位點(diǎn)高度甲基化,這可能是由于在突變體中去甲基化的過程受到了阻礙；隨后相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)ZDP與ROS1具有相互作用[20～21]。APE1L與ROS1蛋白在體內(nèi)共定位,ape1l突變體種子胚乳中甲基化水平增加,從而降低受去甲基化酶DME調(diào)控的印記基因FWA(flowering wageningen)和MEA(medea)的表達(dá)水平。此外,生化數(shù)據(jù)表明純化的ZDP蛋白可以將3′-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)化為3′-OH基團(tuán)[20,22],而APE1L蛋白可以將3′-PUA末端加工為3′-OH末端[23],所以ZDP和APE1L產(chǎn)生3′-OH的過程作為兩個(gè)獨(dú)立的分支共同參與ROS1/DME介導(dǎo)的DNA去甲基化。甲基化的胞嘧啶被切除以后,未甲基化的胞嘧啶如何填補(bǔ)縫隙？這一問題至今還沒有確切的答案,目前在擬南芥中鑒定到了具有DNA連接酶活性的AtLIG1(Arabidopsis thaliana DNA ligase 1),它可以在DNA鏈的兩端連接上未甲基化的胞嘧啶,從而實(shí)現(xiàn)去除DNA甲基化的目的[24～25](圖 2)。

圖1 擬南芥ROS1/DME家族蛋白結(jié)構(gòu)域[18]Fig.1 The domains of Arabidopsis ROS1/DME family proteins[18]

圖2 堿基切除修復(fù)介導(dǎo)的植物DNA主動去甲基化[21,23]Fig.2 Base excision repair-mediated DNA active demethylation in plants[21,23]

1.3 ROS1介導(dǎo)的DNA主動去甲基化的調(diào)控

ROS1介導(dǎo)的DNA主動去甲基化過程受許多因素的調(diào)控,比如:轉(zhuǎn)錄水平上受到的調(diào)控、酶活性水平上受到的Fe-S基序調(diào)節(jié)。此外,ROS1識別靶位點(diǎn)的過程還受到各種蛋白質(zhì)復(fù)合物的影響。

1.3.1 ROS1轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)

ROS1基因的表達(dá)受許多因素調(diào)節(jié)。其可與RdDM途徑相互拮抗來預(yù)防特異位點(diǎn)上的DNA超甲基化,并且在所有已知的RdDM相關(guān)的突變體中ROS1的表達(dá)量均降低,說明DNA甲基化和主動去甲基化之間是相互協(xié)調(diào)的關(guān)系[26～30]。除Rd-DM相關(guān)的突變體外,met1突變體中ROS1的表達(dá)同樣被抑制[31]。ROS1啟動子上有一段可以調(diào)控甲基化水平的39 bp序列,被稱為DNA甲基化監(jiān)測序列(methylation monitoring sequence,MEMS)[29]。RdDM途徑使全基因組的甲基化升高,MEMS上的高甲基化促進(jìn)了ROS1的表達(dá),防止甲基化過高,從而使機(jī)體甲基化保持平衡。MEMS的高甲基化發(fā)生在ROS1功能缺失的突變體中,說明MEMS也是ROS1的靶位點(diǎn)。相關(guān)研究報(bào)道,MEMS的超甲基化伴隨著ROS1的表達(dá)增加,并導(dǎo)致擬南芥的根系長度顯著增加[29,32]。在MEMS的上游包含一個(gè)螺旋狀的轉(zhuǎn)座子,該轉(zhuǎn)座子可能有助于吸引DNA甲基化因子,并使啟動子對DNA甲基化作出反應(yīng),但是通過DNA甲基化促進(jìn)ROS1轉(zhuǎn)錄的特異性轉(zhuǎn)錄因子尚未發(fā)現(xiàn)[33]。綜上可知,MEMS可通過調(diào)控ROS1的表達(dá)來協(xié)調(diào)DNA甲基化與去甲基化之間的平衡,避免DNA甲基化的過低或過高,進(jìn)而維持生物體良好的生長發(fā)育狀態(tài)。

1.3.2 ROS1酶活性水平的調(diào)節(jié)

ROS1功能的發(fā)揮不僅受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,還受酶活性水平的調(diào)節(jié)。很多研究都關(guān)注了ROS1/DME去甲基化酶的表觀遺傳學(xué)功能,但是人們對其酶活性調(diào)控機(jī)理仍知之甚少。早在30年前,相關(guān)研究就發(fā)現(xiàn)一種在堿基切除修復(fù)(BER)過程中起作用的DNA糖基化酶(DNA glycosylase)中含有Fe-S簇結(jié)構(gòu)域,并且該結(jié)構(gòu)域?qū)ζ涿富钚缘谋３种陵P(guān)重要[34]。現(xiàn)有研究顯示,ROS1/DME去甲基化酶中也含有同樣保守的Fe-S功能域(如圖1中的FES),且該結(jié)構(gòu)域是ROS1/DME活性所必需的,Fe-S基序突變的DME蛋白在體外不能切開甲基化的DNA[35～36]；同樣的體外實(shí)驗(yàn)在ROS1中也得到了相同的結(jié)果[32]。以上信息表明,Fe-S基序?qū)OS1/DME蛋白酶活性的保持具有重要的作用。

1.3.3 ROS1靶位點(diǎn)識別水平的調(diào)節(jié)

除上述兩種調(diào)控外,ROS1識別DNA甲基化位點(diǎn)的過程也受到多種因子的調(diào)控。目前DNA主動去甲基化途徑的下游反應(yīng)已經(jīng)取得了突破性的進(jìn)展,但是去甲基化酶識別甲基化胞嘧啶的具體過程仍然有待探索。當(dāng)前研究已經(jīng)篩選到了一系列參與DNA主動去甲基化位點(diǎn)識別的酶和相關(guān)因子,這些酶和因子相互作用,共同參與了ROS1識別甲基化DNA的過程[37～42]。該過程可以簡要概括為以下四步:第一步,蛋白乙?；?increased DNA methylation,IDM)復(fù)合體識別甲基化的胞嘧啶,并且在該位點(diǎn)對組蛋白進(jìn)行乙?；揎?；第二步,染色質(zhì)重塑復(fù)合體SWR1識別組蛋白乙酰化標(biāo)記,并被招募到染色質(zhì)上；第三步,SWR1復(fù)合體在染色質(zhì)上招募H2A.Z蛋白[43]。H2A.Z是組蛋白H2A的變體,主要位于常染色質(zhì)區(qū)域,其在DNA高甲基化區(qū)域的水平較低,存儲H2A.Z的復(fù)合體發(fā)生突變會導(dǎo)致全基因組DNA甲基化水平的升高[44]；第四步,H2A.Z和ROS1直接相互作用,將ROS1招募到甲基化胞嘧啶上進(jìn)行DNA主動去甲基化過程(圖3)。

2 動物DNA主動去甲基化

2.1 動物DNA主動去甲基化關(guān)鍵酶的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)分析

過去的幾十年中,人們一直在動物中尋找像植物中ROS1/DME一樣可以直接去除DNA甲基化的酶,但始終沒有鑒定出ROS1/DME同源蛋白,這表明動物中直接切除甲基化胞嘧啶的化學(xué)反應(yīng)可能并不存在。Kriaucionis等[45]發(fā)現(xiàn)哺乳動物細(xì)胞中的甲基化胞嘧啶可轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hmC)。Song 等[46]研究發(fā)現(xiàn)5hmC在腦組織和多能胚胎干細(xì)胞中尤其豐富,并且這些5hmC存在于高CpG含量的啟動子上,這些啟動子的DNA甲基化水平通常較低。Williams等[47]經(jīng)過一系列研究發(fā)現(xiàn),在動物中一些關(guān)鍵分子間接作用于DNA去甲基化過程。這些酶首先修飾甲基化的胞嘧啶,隨后使其被DNA堿基修復(fù)途徑去除。2002年,Ono等[48]發(fā)現(xiàn)TET(ten-eleven translocation)蛋白可以使5mC轉(zhuǎn)化為5hmC；2009年,Rao等[49]發(fā)現(xiàn)TET1過表達(dá)細(xì)胞的基因組DNA在CG中含有修飾,推斷它可能在高等生物中介導(dǎo)5mC羥基化。進(jìn)一步的研究顯示TET1確實(shí)能夠使哺乳動物DNA中的5mC轉(zhuǎn)化為5hmC,這為TET1在DNA去甲基化中的作用提供了證據(jù)[49]。

圖3 IDM、SWR1和H2A.Z在DNA主動去甲基中的工作模型[43]Fig.3 Working model for the roles of SWR1,IDM and H2A.Z in active DNA demethylation[43]

TET 蛋白是 Fe(Ⅱ)/α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid,α-KG)依賴型雙加氧酶。TET蛋白家族包含3個(gè)成員,分別是TET1、TET2和TET3,其中TET1在小鼠體細(xì)胞中以TET1s的形式存在,在胚胎干細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞中以TET1e的形式存在[50]。TET3也有兩個(gè)亞型,分別為TET3s和TET3o,前者在神經(jīng)元分化期間表達(dá)量較高,后者則在卵母細(xì)胞中大量表達(dá)[51～52]。TET家族所有成員(包含亞型)都含有雙鏈β螺旋(double stranded β helix,DSBH)和富含半胱氨酸(Cys-rich)結(jié)構(gòu)域[53](圖4)。這些結(jié)構(gòu)域在TET蛋白參與DNA主動去甲基化的過程中具有關(guān)鍵作用,其中DSBH結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)TET對5mC的氧化,Cys-rich結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)TET與DNA之間的結(jié)合。另外,TET1和TET3所特有的CXXC結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)TET蛋白在CpG島區(qū)域內(nèi)的富集。CXXC結(jié)構(gòu)域缺失的突變體中TET蛋白在CpG島的富集率有所降低,表明該結(jié)構(gòu)域在TET蛋白靶向到特定的DNA位點(diǎn)過程中發(fā)揮了重要的作用[55]。

圖4 小鼠TET蛋白的結(jié)構(gòu)域[54]Fig.4 The domain of the mouse TET protein[54]

2.2 TET介導(dǎo)的DNA主動去甲基化途徑

盡管動物不能像植物那樣直接將甲基化胞嘧啶切除,但是動物體內(nèi)也有獨(dú)特的去除甲基化胞嘧啶的方式。目前,人們已提出幾種可在動物中介導(dǎo)DNA主動去甲基化的機(jī)制[56～58],其中TETTDG(thymine DNA glycosylase)途徑得到了最廣泛的支持[54]。在該途徑中5mC可以被TET蛋白逐步氧化成5hmC、5-甲?；奏?5-formylcytosine,5fC)和 5-羧基胞嘧啶(5-carboxycytosine,5caC)[59～60],然后通過胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)和堿基切除修復(fù)(BER)機(jī)制除去5fC和5caC,完成5mC的主動去甲基化(圖5)。

圖5 哺乳動物中TET介導(dǎo)的DNA主動去甲基化[58]Fig.5 TET-mediated DNA active demethylation in mammals[58]

在TET蛋白介導(dǎo)DNA主動去甲基化的過程中,5mC、5hmC和5fC都是其底物,但TET蛋白對這3種底物表現(xiàn)出不同的結(jié)合或催化活性。生化和結(jié)構(gòu)研究表明,相對于5hmC和5fC,TET蛋白優(yōu)先選擇5mC作為其反應(yīng)的底物；酶動力學(xué)分析顯示,人TET1或TET2催化5mC至5hmC的轉(zhuǎn)化速率快于5hmC至5fC和5fC至5caC的轉(zhuǎn)化速率[61]。并且,無論互補(bǔ)鏈的狀態(tài)如何,CpG體系中TET蛋白參與5mC的氧化速率大致相似[45]。TET蛋白的這種底物偏好性在生物體內(nèi)是十分重要的,因?yàn)镈NA主動去甲基化的過程伴隨著許多DNA從頭合成甲基化和DNA復(fù)制的反應(yīng)。

2.3 TET介導(dǎo)的DNA主動去甲基化的調(diào)控

TET介導(dǎo)的DNA主動去甲基化反應(yīng)可以在各種水平被調(diào)節(jié),5mC、5hmC和5fC被氧化的反應(yīng)直接受到底物活性的影響,同時(shí)這些反應(yīng)也可以通過輔助因子調(diào)節(jié)。與植物中ROS1一樣,TET可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平進(jìn)行調(diào)節(jié)。此外,將TET靶向到甲基化DNA區(qū)域的因子也可以調(diào)節(jié)其識別靶位點(diǎn)的過程,但是與植物中ROS1識別靶位點(diǎn)的過程有所不同。

2.3.1 TET蛋白氧化過程的調(diào)控

TET蛋白介導(dǎo)的氧化反應(yīng)需要α-KG和氧氣作為底物,并以Fe(Ⅱ)為輔助因子。在該反應(yīng)中,Fe(Ⅱ)首先與TET蛋白中保守的His-Asp殘基結(jié)合,并且與H2O和α-KG相互協(xié)調(diào),然后α-KG被氧氣氧化生成CO2和琥珀酸酯,并產(chǎn)生高價(jià)的Fe(Ⅳ)中間體,該中間體與5mC反應(yīng)生成5hmC和琥珀酸鹽[62]。當(dāng)反應(yīng)所需的底物和輔助因子發(fā)生變化時(shí)會導(dǎo)致氧化反應(yīng)產(chǎn)生不同的結(jié)果。α-KG由異檸檬酸通過異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)氧化脫羧反應(yīng)產(chǎn)生[63],IDH1或IDH2的過表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞中5hmC的產(chǎn)生[64～65]。此外,idh突變體可通過產(chǎn)生2-羥基戊二酸(2 hydroxyglutarate,2HG)與α-KG競爭性結(jié)合來抑制TET蛋白活性,進(jìn)而使5mC無法轉(zhuǎn)化為5hmC[64]。除α-KG外,氧氣對TET蛋白介導(dǎo)的氧化反應(yīng)的影響已在體外量化[66],缺氧會降低5hmC的水平但不會使TET蛋白表達(dá)下調(diào),并且該變化與細(xì)胞增殖和代謝物濃度的變化無關(guān),這表明氧氣可直接參與調(diào)節(jié)TET蛋白介導(dǎo)的氧化反應(yīng)[66]。作為反應(yīng)的輔助因子,Fe(Ⅱ)也能夠影響TET蛋白的活性,細(xì)胞中鐵濃度的增加可提高5hmC的水平[67]；TET結(jié)構(gòu)中與鐵結(jié)合的關(guān)鍵殘基的突變會降低其酶活性[66]。

2.3.2 TET轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

除上述底物和輔助因子會影響氧化反應(yīng)外,TET的功能在轉(zhuǎn)錄水平上也會受到調(diào)控。與植物中MEMS參與ROS1轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)不同的是,TET和TDG的mRNA水平受到很多微RNA(microRNA,miRNA)調(diào)節(jié)[68]。其中,miR-15b、miR-22和miR-125等過表達(dá)會降低TET的表達(dá)并且降低 5hmC 的水平[68～70]；miR-26a 和 miR-29 過表達(dá)會抑制TDG的表達(dá),而敲除這兩個(gè)miRNA則可增強(qiáng)TDG的表達(dá),5hmC的水平與TDG的變化趨勢一致[71～72]。

2.3.3 TET翻譯后水平的調(diào)控

TET蛋白不僅在轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)控,而且在翻譯后修飾上也受到調(diào)控。翻譯后,TET蛋白酶活性可通過共價(jià)修飾和蛋白質(zhì)之間的相互作用來調(diào)節(jié)[73]。研究顯示,TET蛋白保守的賴氨酸殘基泛素化能夠促進(jìn)TET蛋白與染色質(zhì)的結(jié)合,在人TET2蛋白的N端,兩個(gè)保守的賴氨酸殘基發(fā)生乙?；軌蛱岣咂涿富钚?增強(qiáng)其在氧化應(yīng)激下對5mC的靶向性[74]。TET蛋白的水平也可以通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)水解來調(diào)節(jié),TET2蛋白的分子伴侶IDAX(inhibition of the Dvl and Axin complex)過表達(dá)會導(dǎo)致TET2蛋白的降解,而將IDAX耗盡則會使TET2蛋白含量升高[75]。鈣蛋白酶在小鼠胚胎干細(xì)胞的維持和分化過程中介導(dǎo)TET蛋白水解[76],泛素蛋白酶則在人癌細(xì)胞介導(dǎo)TET2的降解,進(jìn)而導(dǎo)致5hmC水平的降低[74]。

2.3.4 TET靶位點(diǎn)識別水平的調(diào)控

與ROS1類似,TET蛋白對基因組中甲基化DNA的識別也會受到調(diào)控。但是與植物中一系列酶和復(fù)合物參與ROS1識別靶位點(diǎn)的過程不同,動物中這一過程需要TET和TDG的結(jié)構(gòu)特性、局部染色質(zhì)環(huán)境以及外在因素相協(xié)調(diào)。為了有選擇性地在特定CpG位點(diǎn)去甲基化,TET和TDG需要被定位到相應(yīng)的基因組區(qū)域。在小鼠胚胎干細(xì)胞中進(jìn)行的染色質(zhì)免疫沉淀測序(chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)分析顯示,TET1在CpG島和二價(jià)啟動子處富集,這種CpG結(jié)合偏好性是由于TET蛋白的CXXC結(jié)構(gòu)域會優(yōu)先選擇富含CpG區(qū)域[56],這表明CXXC結(jié)構(gòu)域促進(jìn)了TET1與CpG島的結(jié)合。對于沒有CXXC結(jié)構(gòu)域的TET2蛋白,這種結(jié)合可能是由其相互作用蛋白質(zhì)IDAX來介導(dǎo)[77]。TET2蛋白的分子伴侶也有助于將其招募到甲基化DNA位點(diǎn)上。研究報(bào)道,PRDM14(PR domain zinc finger protein 14)、PRC2(polycomb repressive complex 2)和LIN28A在小鼠胚胎干細(xì)胞中可以招募TET蛋白并與其相互作用[77～79]。在小鼠胚胎干細(xì)胞中,TDG與TET1具有類似的分布模式,并且在活性啟動子和增強(qiáng)子處富集,這種分布模式可能是由于TET與TDG之間存在相互作用[80]。此外,還有其他因素參與TET靶位點(diǎn)識別的過程,如生長停滯、DNA損傷誘導(dǎo)蛋白(GADD45A)和雌激素受體β等[81～82]。

3 總結(jié)

植物和動物通過相似的機(jī)制來調(diào)控DNA從頭合成甲基化和甲基化的維持,但其主動去甲基化的過程具有一定差異。動植物中的DNA主動去甲基化大致都需要經(jīng)歷三步反應(yīng)。在植物中,ROS1/DME首先將5mC切除,酶切產(chǎn)物經(jīng)β消除反應(yīng)或δ消除反應(yīng)分別生成3′-PUA間隙和3′-磷酸間隙,隨后3′-PUA間隙和3′-磷酸間隙分別在APE1L和ZDP的催化下生成3′-OH基團(tuán),最后通過堿基切除修復(fù)機(jī)制完成5mC的去除(圖2)。在動物中,TET-TDG介導(dǎo)的DNA去甲基化途徑被廣泛認(rèn)可,其主要過程如下:TET蛋白先將5mC氧化成5fC和5caC,隨后由TDG將它們切除,最后通過堿基切除修復(fù)機(jī)制獲得未修飾的胞嘧啶(圖5)。盡管動植物中DNA主動去甲基化過程的最后都是通過相同機(jī)制完成的,但是在反應(yīng)初期植物是通過ROS1/DME直接將5mC切除,而動物則需要在TET的催化下逐步將5mC氧化為5hmC、5fC和5caC后再實(shí)行胞嘧啶的切除。雖然動物中目前仍然沒有找到類似于ROS1/DME可以直接切除甲基化胞嘧啶的糖基化酶,但是已經(jīng)確定動物中的DNA去甲基化是由5mC的修飾開始,包括脫氨基作用、氧化作用、甲基團(tuán)脫氫,而不是直接移除甲基基團(tuán)。綜上所述,動物DNA主動去甲基化途徑比植物要更復(fù)雜。

有趣的是,研究者利用CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)基因編輯技術(shù)將不具有切割活性的dCas9(dead Cas9)與TET1催化結(jié)構(gòu)域融合后轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥,成功地實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)基因的靶向去甲基化,最終激活了FWA基因的表達(dá),產(chǎn)生了延遲開花的表型,為TET蛋白能夠介導(dǎo)DNA去甲基化提供了佐證[83]。植物中沒有TET酶,這表明TET1介導(dǎo)的去甲基化機(jī)制較為保守,但在進(jìn)化的過程中DNA主動去甲基化的途徑產(chǎn)生了分歧,植物通過ROS1切除而動物則通過TET的氧化作用最終去除5mC。

在調(diào)控方面,植物ROS1介導(dǎo)的去甲基化與RdDM途徑的甲基化之間有一個(gè)動態(tài)反饋抑制環(huán),即RdDM途徑使MEMS上的高甲基化促進(jìn)了ROS1的表達(dá),而ROS1表達(dá)后又抑制全基因組的高甲基化,從而使植物基因組甲基化處于一個(gè)合理的水平。在動物中目前還沒有發(fā)現(xiàn)這種機(jī)制,TET的表達(dá)更多受miRNA調(diào)控。

此外,本文還總結(jié)了參與植物和動物DNA主動去甲基化過程的關(guān)鍵酶及調(diào)控該過程的關(guān)鍵因子,具體如表1和表2所示。

表1 參與動植物主動去甲基化的關(guān)鍵酶及其功能Table 1 Key enzymes involved in active demethylation of plants and animals and their functions

表2 動植物主動去甲基化過程的調(diào)節(jié)因子及其功能Table 2 Regulators and functions of active demethylation in animals and plants

4 展望

盡管現(xiàn)在DNA去甲基化途徑的研究已經(jīng)取得了重大的突破,但是仍有許多環(huán)節(jié)尚不明確。對于植物DNA去甲基化而言,DNA去甲基化酶是如何精準(zhǔn)地作用到靶位點(diǎn)上的？目前,除了在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的IDM和SWR1復(fù)合體參與的調(diào)控機(jī)制外,是否還有其他的調(diào)控通路？另外,在其他作物中DNA去甲基化酶的精準(zhǔn)調(diào)控機(jī)理尚未被發(fā)掘。本課題組利用CRISPR/Cas9技術(shù)對大豆的DME進(jìn)行基因編輯,獲得了dme突變體,并發(fā)現(xiàn)突變體種子的全基因組甲基化水平升高,同時(shí)突變體種子的百粒重與野生型相比顯著增加(數(shù)據(jù)未發(fā)表),但是DME影響大豆種子發(fā)育的過程尚不明確,仍需進(jìn)一步探究。表觀遺傳學(xué)與基因編輯技術(shù)的有機(jī)結(jié)合為改良農(nóng)藝性狀、加速遺傳育種提供了新的手段。對于動物DNA去甲基化而言,也有一些問題需要解決。首先,TET蛋白的功能尚未在各種生物過程中得到很好的定義；其次,需要進(jìn)一步研究以確定氧化的5mC,特別是5hmC,是否可以作為讀取蛋白質(zhì)介導(dǎo)生物功能的識別位點(diǎn)；第三,某些基因組區(qū)域?qū)ET介導(dǎo)的氧化反應(yīng)具有抵抗力,機(jī)體選擇性保護(hù)這些區(qū)域免受氧化的機(jī)制還不完全了解；第四,TET蛋白介導(dǎo)的氧化反應(yīng)在被動去甲基化過程中的確切作用仍有待確定；第五,大多數(shù)的研究都側(cè)重于TET而不是TDG,但由TDG介導(dǎo)的修復(fù)未經(jīng)修飾的胞嘧啶這一過程也尤為關(guān)鍵；最后,盡管成熟神經(jīng)元中5hmC的含量很高,但DNA主動去甲基化在哪里發(fā)生尚不清楚?？偟膩碇v,所有上述問題將會是完善動植物中DNA主動去甲基化機(jī)制的關(guān)鍵所在。