嵌合蛛絲蛋白Flag-MaSp1重復(fù)模塊的表達(dá)及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

田露陽(yáng),孟 清,林 瑛

(東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院,中國(guó)上海201620)

蜘蛛絲是一種綜合性能優(yōu)越的天然生物材料,具有優(yōu)異的機(jī)械強(qiáng)度和生物學(xué)特性。與蠶絲和目前的人造纖維材料相比,蜘蛛絲有著更為巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值,在生物材料和組織工程等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[1～4]。

圓網(wǎng)蜘蛛具有7種類(lèi)型的特殊分泌腺,它們分泌產(chǎn)生7種具有不同特定功能的蛛絲和膠狀物質(zhì)[4],這些功能包括防止墜落、束縛獵物、編織蛛網(wǎng)、包裹卵袋等[5～6]。不同類(lèi)型的蛛絲蛋白在氨基酸序列、物理性質(zhì)及功能上各不相同[7]。蛛絲蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)均包括高度保守的非重復(fù)的N端(N-terminal domain,NT)、C 端(C-terminal domain,CT)以及占比達(dá)90%以上的重復(fù)區(qū)域[8]。蛛絲蛋白的機(jī)械性能主要與重復(fù)模塊(repetitive module,R)的序列有關(guān)[8～9]。

在7種類(lèi)型的蛛絲蛋白中,鞭狀腺絲蛋白(flagelliform spidroin,Flag)的一級(jí)結(jié)構(gòu)具有3個(gè)特征:1)含有多個(gè)Gly-Pro-Gly-Gly-X結(jié)構(gòu)域；2)含有多個(gè)帶電和親水性氨基酸的高度保守間隔區(qū)；3)具有非重復(fù)的C端,這些結(jié)構(gòu)的組合賦予鞭狀腺絲最高的彈性,使其可以拉伸至自身長(zhǎng)度的 200%[10～11]。主壺腹腺絲蛋白 1(major ampullate spidroin,MaSp1)的氨基酸序列分為三類(lèi),包括多聚丙氨酸的結(jié)構(gòu)域(poly Ala/Gly-Ala)、富含甘氨酸的結(jié)構(gòu)域(Gly-Gly-X)以及非重復(fù)的N端和C端[7]。Gly-Gly-X參與形成的310-螺旋在β-折疊片層之間以及蛋白質(zhì)分子中相鄰的Gly-Gly-X螺旋之間起連接作用,以促進(jìn)纖維的排列[12]。Poly-Ala自發(fā)形成反向平行的β-折疊,賦予拖絲優(yōu)越的機(jī)械性能[13],這與其他蛛絲蛋白中的報(bào)道相一致,成絲過(guò)程中由無(wú)序及其他結(jié)構(gòu)形成的β-折疊結(jié)構(gòu),被認(rèn)為是絲纖維具有高拉伸強(qiáng)度的原因[14～15]。Teulé等[16]構(gòu)建了含F(xiàn)lag和MaSp2共有重復(fù)序列的嵌合蛋白,并發(fā)現(xiàn)嵌合蛋白共有重復(fù)序列的總體結(jié)構(gòu)決定了纖維的機(jī)械性能。因此,為制備具有人們所需機(jī)械性能的嵌合蛛絲纖維,了解嵌合蛛絲蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。

本文首先構(gòu)建重組蛋白嵌合體,它包含長(zhǎng)度相近的兩個(gè)模塊,即Flag蛋白的重復(fù)模塊與MaSp1蛋白的重復(fù)模塊。將重組蛋白嵌合體純化后去除外源標(biāo)簽,并利用手工拉絲的方法制備嵌合絲纖維。然后,使用圓二色譜(circular dichroism spectrum,CD spectrum)及傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)對(duì)成絲前后的嵌合蛛絲蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；利用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)對(duì)絲纖維的表面形態(tài)進(jìn)行表征,進(jìn)而分析并預(yù)測(cè)其潛在的力學(xué)性質(zhì)。研究結(jié)果為制備嵌合蛛絲纖維提供了研究方向和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

分子克隆使用的DNA小量抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒等均購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Trans 2K PlusⅡ購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶以及T4 DNA連接酶購(gòu)于美國(guó)ThermoFisher Scientific公司；PCR中用到的Taq DNA聚合酶購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司。重組蛋白質(zhì)表達(dá)所使用的宿主菌E.coli T1和BL21(DE3)購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。重組蛋白質(zhì)純化所用的鎳柱購(gòu)于德國(guó)Qiagen公司。Western-blot所用的PVDF膜購(gòu)于德國(guó)Merck公司,ECL化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司,6×His標(biāo)簽的特異性抗體及HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗購(gòu)于天津邁基生物科技有限公司。pGHScRp1及pGH-MaSp1R質(zhì)粒委托上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行全基因合成。引物合成和DNA測(cè)序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以pGHScRp1質(zhì)粒(含F(xiàn)lagR序列)為模板,表1中的Flag-P1及Flag-P2為引物,PCR擴(kuò)增得到FlagR片段。PCR條件如下:95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s,65℃退火30 s,72℃延伸30 s,72℃補(bǔ)平10 min,循環(huán)數(shù)30個(gè)。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行BglⅡ和XhoⅠ雙酶切,對(duì)本課題組改造的pET-32a表達(dá)載體pEHS(含6×His-SUMO標(biāo)簽)及上述獲得的FlagR片段同時(shí)進(jìn)行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切,使用T4 DNA連接酶將片段和載體相連接,得到過(guò)渡質(zhì)粒pEHS-FlagR。根據(jù)大腹園蛛(Araneus ventricosus)MaSp1的mRNA序列(GenBank登錄號(hào):JN857964.2),取一個(gè)長(zhǎng)696 bp、編碼232個(gè)氨基酸的完整重復(fù)區(qū),記作MaSp1R,對(duì)完整序列進(jìn)行大腸桿菌密碼子優(yōu)化后委托上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行全基因合成,并在兩端加入BamHⅠ和SpeⅠ酶切位點(diǎn)。對(duì)合成質(zhì)粒pGH-MaSp1R及過(guò)渡質(zhì)粒pEHS-FlagR同時(shí)進(jìn)行BamHⅠ和SpeⅠ雙酶切,隨后連接得到重組質(zhì)粒pEHS-FlagR-MaSp1R。

1.3 嵌合蛛絲蛋白的表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒pEHS-FlagR-MaSp1R轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中,37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單克隆,接種于含氨芐青霉素(ampicillin,Amp)抗性的10 mL LB培養(yǎng)基中,于37℃、180 r/min條件下過(guò)夜培養(yǎng)；將菌種轉(zhuǎn)接于Amp(終質(zhì)量濃度為100 μg/mL)抗性的LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8,隨后加入終濃度為0.5 mmol/L的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),誘導(dǎo)條件為:20℃,180 r/min,過(guò)夜。在4℃條件下4 000 r/min離心20 min收集菌體,并用50 mL 20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)將其充分重懸；細(xì)胞重懸液使用高壓破碎儀(JN-3000 plus,JINBO)進(jìn)行細(xì)胞破碎(120～130 MPa)；隨后,4 ℃、10 000 r/min離心30 min收集上清液。根據(jù)Qiagen鎳柱使用說(shuō)明進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化:將上清液與Ni2+-NTA柱子置于冰上孵育1 h,使其充分結(jié)合；隨后使用沖洗緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L咪唑、300 mmol/L NaCl,pH 8.0)對(duì)柱子進(jìn)行沖洗；最后使用洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl、250 mmol/L咪唑、300 mmol/L NaCl,pH 8.0)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫并收集。向蛋白質(zhì)溶液中加入SUMO蛋白酶(體積比100︰1)并在4℃條件下過(guò)夜透析于20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)中,以去除NaCl以及咪唑。透析后的蛋白質(zhì)溶液再次與鎳柱結(jié)合,收集得到嵌合蛛絲蛋白。

1.4 嵌合蛛絲蛋白的檢測(cè)

使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量280 nm處的吸光度,以確定嵌合蛛絲蛋白的濃度和產(chǎn)率；使用15%的SDS-PAGE檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)純化情況,并通過(guò)考馬斯亮藍(lán)R-250染色后采用Image J進(jìn)行分析,以確定蛋白質(zhì)的純度；通過(guò)Western-blot檢測(cè)嵌合蛛絲蛋白有無(wú)標(biāo)簽污染:15%的SDSPAGE凝膠300 mA恒流轉(zhuǎn)膜60 min后,先后使用6×His標(biāo)簽的特異性抗體及二抗孵育結(jié)合,隨后進(jìn)行ECL底物反應(yīng),暗室顯色后壓片掃描保存。

1.5 圓二色譜分析

嵌合蛛絲蛋白在4℃條件下過(guò)夜透析于10 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 8.0)后,使用超濾離心管進(jìn)行濃縮,并將濃縮產(chǎn)物溶于pH 7.0的10 mmol/L磷酸緩沖液中。將200 μL蛋白質(zhì)溶液加入0.1 cm光程的200 μL石英比色皿中,使用Chirascan光譜儀(Applied Photophysics Ltd.,England)于25℃條件下記錄260～190 nm的嵌合蛛絲蛋白FlagR-MaSp1R溶液的CD光譜。掃描步長(zhǎng)為0.5 nm,響應(yīng)時(shí)間為1 s,帶寬為1 nm。CD光譜取3次掃描的平均值。測(cè)試蛋白質(zhì)樣品的終質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL。

1.6 手工拉絲

參照文獻(xiàn)[11]報(bào)道的方法進(jìn)行絲纖維的制備,主要操作如下:室溫下將200 μL純化后的蛋白質(zhì)溶液(含20 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0)以適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量濃度(0.8～1.0 mg/mL)置于載玻片上,使用小針頭以約6 mm/s的速度連續(xù)將絲狀纖維從溶液中拉出,并纏繞在特制的紙片上。制備好的樣品可用于后續(xù)測(cè)試。

1.7 傅里葉變換紅外光譜分析

使用Nicolet iN 10 MX傅里葉紅外顯微成像光譜儀(ThermoFisher Scientific,USA)測(cè)定嵌合蛛絲纖維位于600～4 000 cm-1范圍內(nèi)的紅外光譜圖。使用Peakfit v4.12軟件對(duì)位于酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)的光譜進(jìn)行處理,根據(jù)子峰面積計(jì)算蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的百分比例。

1.8 掃描電子顯微鏡觀察

使用掃描電子顯微鏡(Phenom XL,USA)觀察嵌合蛛絲纖維的表面形態(tài)。選擇5～15 kV電壓和電子背散射衍射(electron backscattering diffraction,EBSD)模式進(jìn)行觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pEHS-FlagR-MaSp1R的構(gòu)建

為構(gòu)建表達(dá)嵌合蛛絲蛋白的重組質(zhì)粒,首先PCR擴(kuò)增獲取FlagR片段,DNA電泳結(jié)果見(jiàn)圖1A,目標(biāo)條帶與預(yù)期大小(728 bp)相符,說(shuō)明成功擴(kuò)增獲得FlagR片段。隨后將FlagR片段與pEHS載體進(jìn)行酶切、連接及轉(zhuǎn)化,得到過(guò)渡質(zhì)粒pEHS-FlagR,再對(duì)過(guò)渡質(zhì)粒及合成質(zhì)粒(含MaSp1R)進(jìn)行酶切、連接及轉(zhuǎn)化,得到重組質(zhì)粒pEHS-FlagR-MaSp1R。重組質(zhì)粒的NdeⅠ及XhoⅠ雙酶切鑒定結(jié)果如圖1B所示。此外,我們將雙酶切鑒定陽(yáng)性結(jié)果送往上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果證實(shí)重組質(zhì)粒pEHS-FlagR-MaSp1R構(gòu)建成功。

2.2 嵌合蛛絲蛋白的表達(dá)與純化

嵌合蛛絲蛋白所涉及到的不同重復(fù)模塊的氨基酸序列見(jiàn)圖2A,Flag和MaSp1的重復(fù)模塊均來(lái)源于大腹園蛛,模塊的組合方式見(jiàn)圖2B。蛛絲蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)常以包涵體形式存在,為增加嵌合蛛絲蛋白的可溶性及方便后續(xù)純化,在兩種重復(fù)模塊序列的N端添加6×His-SUMO標(biāo)簽。純化后使用SUMO蛋白酶將標(biāo)簽切除。

圖1 FlagR片段的PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果(A)FlagR片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn),泳道1:陰性對(duì)照(使用等體積的H2O作為PCR擴(kuò)增模板),泳道2:FlagR片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(箭頭所示)；(B)重組質(zhì)粒pEHS-FlagR-MaSp1R的雙酶切驗(yàn)證圖譜。M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn),泳道1:經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后的重組質(zhì)粒(箭頭所示)。Fig.1 PCR amplification of FlagRfragment and double digestion of the recombinant plasmid(A)PCR amplification product of FlagRDNA was separated on agarose gel electrophoresis.M:DNA marker,Lane 1:Negative control(equal volume of H2O was used as PCR amplification template),Lane 2:FlagRPCR amplification product(as indicated by the arrow)；(B)Double digestion map of recombinant plasmid pEHS-FlagR-MaSp1R.M:DNA marker,Lane 1:Recombinant plasmid after double digestion with NdeⅠand XhoⅠ(as indicated by the arrow).

圖2 嵌合蛛絲蛋白的氨基酸序列及示意圖(A)嵌合蛛絲蛋白的氨基酸序列組成；(B)嵌合蛛絲蛋白的模塊示意圖。Fig.2 Amino acid sequence and schematic diagram of chimeric spidroin(A)Amino acid sequence of chimeric spidroin；(B)Schematic diagram of chimeric spidroin.

將重組質(zhì)粒pEHS-FlagR-MaSp1R轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株,并用IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)重組蛋白質(zhì)。重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖3A,與誘導(dǎo)前的菌裂解液(圖3A泳道1)相比,誘導(dǎo)后的菌裂解液(圖3A泳道2)在45 kD到66.2 kD之間有一顯著增強(qiáng)的表達(dá)條帶,且該條帶大小與預(yù)期重組蛋白質(zhì)的大小相符合。此外,從圖3A的電泳結(jié)果可知,上清(圖3A泳道4)中含有較多的重組蛋白質(zhì),而沉淀(圖3A泳道3)中僅有少量重組蛋白質(zhì)存在,說(shuō)明重組蛋白質(zhì)主要以可溶的形式存在于上清中。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳柱親和純化后的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果如圖3B泳道1所示,帶有6×His-SUMO標(biāo)簽的重組蛋白質(zhì)純度較高。為減少標(biāo)簽對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能的影響,將鎳柱親和純化后的產(chǎn)物進(jìn)行SUMO蛋白酶消化,以去除6×His-SUMO標(biāo)簽。SUMO蛋白酶消化液的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果如圖3B泳道2所示。對(duì)消化液再次進(jìn)行鎳柱親和純化,以去除外源標(biāo)簽及剩余的SUMO蛋白酶,收集的流穿液即為純化后的嵌合蛛絲蛋白。去除標(biāo)簽后的嵌合蛛絲蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量與理論值35.355 kD相符,且純度好(圖3B泳道3)。將圖3B泳道1～3的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行Western-blot檢測(cè),結(jié)果如圖3C所示,說(shuō)明嵌合蛛絲蛋白無(wú)6×His-SUMO標(biāo)簽污染(圖3C泳道3)。

圖3 嵌合蛛絲蛋白的SDS-PAGE及Western-blot分析結(jié)果(A)重組蛋白質(zhì)(含有6×His-SUMO標(biāo)簽)誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE結(jié)果。泳道1:誘導(dǎo)前,泳道2:誘導(dǎo)后,泳道3:沉淀,泳道4:上清；(B)嵌合蛛絲蛋白純化后的SDS-PAGE結(jié)果。泳道1:重組蛋白質(zhì)(含有6×His-SUMO標(biāo)簽),泳道2:SUMO蛋白酶消化液,泳道3:純化后的嵌合蛛絲蛋白；(C)嵌合蛛絲蛋白純化后的Western-blot分析結(jié)果。泳道1:重組蛋白質(zhì)(含有6×His-SUMO標(biāo)簽),泳道2:SUMO蛋白酶消化液,泳道3:純化后的嵌合蛛絲蛋白。泳道M均為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。Fig.3 SDS-PAGE and Western-blot analysis of chimeric spidroin(A)SDS-PAGE results of induced expression of recombinant protein(containing 6×His-SUMO tag).Lane 1:Non-induced,Lane 2:Induced,Lane 3:Precipitation,Lane 4:Supernatant；(B)SDS-PAGE results of purified chimeric spidroin.Lane 1:Recombinant protein(containing 6×His-SUMO tag),Lane 2:SUMO protease digestion solution,Lane 3:Purified chimeric spidroin；(C)Western-blot analysis of purified chimeric spidroin.Lane 1:Recombinant protein(containing 6×His-SUMO tag),Lane 2:SUMO protease digestion solution,Lane 3:Purified chimeric spidroin.All the M lanes represent protein markers.

2.3 嵌合蛛絲蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

為了解嵌合蛛絲蛋白溶液狀態(tài)下的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征,我們測(cè)定了嵌合蛛絲蛋白在pH 7.0磷酸鹽溶液條件下的CD光譜,結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖中可以觀察到,FlagR-MaSp1R蛋白在192 nm處呈現(xiàn)正吸收峰,在208 nm及222 nm處呈現(xiàn)負(fù)吸收峰,均為典型的α-螺旋特征吸收峰。為進(jìn)一步確定溶液狀態(tài)下各二級(jí)結(jié)構(gòu)的百分含量,使用CDNN v2.1對(duì)CD光譜進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)表2,α-螺旋占比為47.1%,表明在溶液狀態(tài)下嵌合蛛絲蛋白以α-螺旋構(gòu)象為主。

為了解手工拉絲獲得的絲纖維的二級(jí)結(jié)構(gòu),我們對(duì)其進(jìn)行了FTIR測(cè)定,FTIR位于酰胺Ⅰ帶的光譜結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖中可以觀察到,β-折疊的區(qū)域峰集中在 1 610.1 cm-1、1 620.0 cm-1、1 628.8 cm-1、1 637.2 cm-1及1 694.3 cm-1附近；無(wú)規(guī)卷曲集中在1 644.6 cm-1附近；α-螺旋集中在1 653.3 cm-1附近；β-轉(zhuǎn)角集中在 1 661.7 cm-1、1 670.1 cm-1、1 679.3 cm-1及1 687.3 cm-1附近。絲纖維二級(jí)結(jié)構(gòu)的百分含量見(jiàn)表2。結(jié)合圓二色譜分析得到的二級(jí)結(jié)構(gòu)百分含量結(jié)果可知,絲纖維中α-螺旋的百分含量明顯下降,β-折疊與β-轉(zhuǎn)角明顯增多,表明在成絲過(guò)程中蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了由α-螺旋向β-折疊的轉(zhuǎn)變。

2.4 嵌合蛛絲纖維的形態(tài)特征

為了解嵌合蛛絲纖維的形態(tài)特征,使用SEM對(duì)絲纖維的表面形態(tài)進(jìn)行觀察。圖6的顯微結(jié)果顯示,1 000倍條件下,絲纖維十分纖細(xì)(圖6A)；放大絲纖維的局部至5 000倍時(shí),可以清晰地看到絲纖維的輪廓(圖6B)；選取視野的中心位置繼續(xù)放大至10 000倍,可以觀察到絲纖維具有類(lèi)似天然蛛絲纖維的形態(tài),直徑1～2 μm,接近天然蛛絲纖維的尺寸,且整體較為光滑均勻(圖6C)。

圖4 嵌合蛛絲蛋白的圓二色譜分析Fig.4 CD analysis of chimeric spidroin

圖5 嵌合蛛絲蛋白位于酰胺Ⅰ帶的傅里葉變換紅外光譜Fig.5 FTIR of chimeric spidroin in amideⅠband

表2 FlagR-MaSp1R成絲前后的二級(jí)結(jié)構(gòu)百分含量Table 2 The contents of secondary structure before and after FlagR-MaSp1Rsilk formation

3 討論

已有研究報(bào)道,蛛絲蛋白可以在一定條件下自組裝形成絲狀纖維。Xu等[17]研究發(fā)現(xiàn)葡萄狀腺絲蛋白(aciniform spidroin 1,AcSp1)至少需要兩個(gè)重復(fù)模塊才可以自組裝形成絲纖維。Zhou等[18]將來(lái)源于不同種蜘蛛的MaSp1的NT、次壺腹腺絲蛋白(minor ampullate spidroin,MiSp)的CT及 AcSp1的重復(fù)模塊進(jìn)行了組合,所得到的嵌合蛛絲蛋白可以自組裝形成絲纖維。在本研究中,我們?cè)O(shè)計(jì)了同種蜘蛛不同類(lèi)型絲蛋白重復(fù)模塊相嵌合的嵌合蛛絲蛋白,并在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)(約50 mg/L)(圖3B)。純化后不含外源標(biāo)簽的蛋白質(zhì)可于室溫中性pH生理溶液中經(jīng)手工拉絲獲得絲狀纖維,表明在不含有蛛絲蛋白的NT及CT的條件下,不同類(lèi)型的絲蛋白也能夠發(fā)生自組裝現(xiàn)象。CD光譜分析表明,嵌合蛛絲蛋白溶液在室溫及中性pH條件下的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主(圖4),這與已有報(bào)道提及的蛛絲蛋白溶液狀態(tài)下的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋構(gòu)象[19]相吻合；FTIR酰胺Ⅰ帶的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示,手工拉絲獲得的絲纖維以β-折疊與β-轉(zhuǎn)角為主(圖5),表明嵌合蛛絲蛋白的成絲過(guò)程具有與其他蛛絲蛋白[17～18]類(lèi)似的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化,即蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋向β-折疊轉(zhuǎn)變?，F(xiàn)有研究顯示,Flag中含有的特征模塊Gly-Pro-Gly-Gly-X結(jié)構(gòu)域成絲后進(jìn)一步形成β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)[10]；MaSp1中含有的poly-Ala模塊較長(zhǎng),且占比高,可產(chǎn)生大量的β-折疊,從而賦予絲纖維優(yōu)越的強(qiáng)度[20]；Flag及MaSp1中共有的Gly-Gly-X結(jié)構(gòu)域形成的310-螺旋結(jié)構(gòu)與Gly-Pro-Gly-Gln-X一同形成α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的混合結(jié)構(gòu),并進(jìn)一步形成β-spiral構(gòu)象,構(gòu)成無(wú)定型區(qū)域,共同賦予絲纖維良好的彈性[11,21]。本研究所獲得的嵌合蛛絲纖維的二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊占比高達(dá)約32%,β-轉(zhuǎn)角占比高達(dá)約40%(表2),表明在嵌合蛛絲纖維中,不同類(lèi)型的絲蛋白仍保持各自的結(jié)構(gòu)特征,并很可能表現(xiàn)出優(yōu)異的抗拉伸強(qiáng)度及延展性。同時(shí),本研究手工制得的嵌合蛛絲纖維與相同方法獲得的重組蛛絲纖維[18]直徑相近,且表面形態(tài)整體光滑,相比濕法紡絲[22～23],更加綠色環(huán)保,直徑也更接近天然(圖6)。

圖6 嵌合蛛絲纖維的掃描電子顯微鏡圖Fig.6 SEM image of chimeric spider silk fibers

現(xiàn)有的研究絕大多數(shù)局限于同種蜘蛛相同類(lèi)型蛋白質(zhì)的重復(fù)模塊的疊加[17,24],本研究將同種蜘蛛的不同類(lèi)型絲蛋白的重復(fù)模塊相嵌合,在不含蛛絲蛋白的NT及CT的情況下嵌合蛛絲蛋白仍可以自組裝形成絲纖維,且絲纖維表面形態(tài)均勻光滑。在嵌合蛛絲蛋白成絲后的二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊的百分含量較高,說(shuō)明嵌合蛛絲纖維很可能具有出色的機(jī)械性能,本研究可為產(chǎn)生具有優(yōu)越機(jī)械性能的嵌合蛛絲纖維提供研究方向和理論基礎(chǔ)。未來(lái)研究人員可以通過(guò)增加嵌合蛛絲蛋白重復(fù)模塊的數(shù)量及改變優(yōu)化紡絲過(guò)程的各項(xiàng)參數(shù)來(lái)制備嵌合蛛絲纖維,并更好地應(yīng)用在現(xiàn)代科技生活中,如生物醫(yī)學(xué)、組織工程、航空航天以及軍事等眾多領(lǐng)域。