小分子化合物WK429抑制炎癥和降低體液免疫反應(yīng)的研究

胡 盼,邢雅婧,彭世鴻,謝玖清,郭偉凱,謝佳伊,劉明耀,易正芳

(華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院上海市調(diào)控生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生命醫(yī)學(xué)研究所,中國(guó)上海200241)

在周圍淋巴器官(如脾臟、扁桃體、淋巴結(jié))中,成熟的B細(xì)胞在經(jīng)過(guò)T細(xì)胞依賴性抗原刺激后,可依附于濾泡樹突狀細(xì)胞(follicular dendritic cell,FDC)組成網(wǎng)狀組織,形成一個(gè)短暫的動(dòng)態(tài)組織結(jié)構(gòu),稱為生發(fā)中心(germinal center,GC)[1～2]。成熟的GC含有多種類型的免疫細(xì)胞,包括濾泡輔助性T細(xì)胞(T follicular helper cell,Tfh cell)、生發(fā)中心 B細(xì)胞(germinal center B cell,GC B cell)、濾泡樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等[3]。

GC反應(yīng)是一種T細(xì)胞依賴性抗原的免疫應(yīng)答過(guò)程,這個(gè)過(guò)程包括活化的B細(xì)胞經(jīng)歷克隆增殖、體細(xì)胞高頻突變、抗體類別轉(zhuǎn)換以及分化為產(chǎn)生高親和力抗體的漿細(xì)胞或記憶B細(xì)胞[4]。GC反應(yīng)是體液免疫的基礎(chǔ),是機(jī)體發(fā)揮獲得性免疫的重要組成部分。B細(xì)胞淋巴瘤6(B cell lymphoma 6,BCL6)是GC 形成和維持的重要調(diào)節(jié)因子[5～6]。在不同的免疫細(xì)胞類型中,BCL6具有其獨(dú)特的功能。BCL6對(duì)于Tfh細(xì)胞和GC B細(xì)胞的發(fā)育與功能至關(guān)重要[5]。BCL6已成為Tfh細(xì)胞的主要轉(zhuǎn)錄因子之一,影響Tfh細(xì)胞的分化及其特征分子的表達(dá)[7～8]。在抗體類別轉(zhuǎn)換過(guò)程中,BCL6允許GC B細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞高頻突變和DNA雙鏈的斷裂,并通過(guò)抑制DNA損傷反應(yīng)和檢查點(diǎn)基因來(lái)更好地應(yīng)對(duì)這種壓力[9]。

BCL6是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子,屬于BTB/POZ/鋅指核酶家族成員,由706個(gè)氨基酸殘基組成。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能,BCL6包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域:N端的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域(1～130號(hào)氨基酸殘基)、預(yù)測(cè)具有很少或沒(méi)有固定結(jié)構(gòu)的中心區(qū)域(131～517號(hào)氨基酸殘基)和C端的6個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域(518～681號(hào)氨基酸殘基)[9]。BCL6功能的發(fā)揮需要BTB二聚化形成同源二聚體,二聚化的BTB招募轉(zhuǎn)錄共抑制子SMRT(silencing mediator of retinoid and thyroid receptors)、N-CoR(nuclear receptor corepressor)和BCoR(BCL6 interacting corepressor),抑制靶基因的表達(dá)[9～11]。研究表明,在小鼠中敲除BCL6,小鼠不能形成GC,也不能產(chǎn)生高親和力抗體,而且BCL6基因全身性敲除小鼠會(huì)出現(xiàn)致死性炎癥疾病[6,12～13]。后續(xù)研究表明,在小鼠體內(nèi)突變BTB結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)氨基酸(N21K,H116A)可以破壞其招募轉(zhuǎn)錄共抑制子的功能,使BCL6不能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用,同時(shí)小鼠體內(nèi)的GC和分泌的高親和力抗體明顯減少,但是小鼠沒(méi)有出現(xiàn)炎癥和不良反應(yīng)[14]?，F(xiàn)有研究報(bào)道,GC和自身抗體存在于多種自身免疫性疾病患者體內(nèi)或者動(dòng)物模型中,比如:系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)[15～17]。目前,系統(tǒng)性紅斑狼瘡的靶向藥物極其缺乏,50多年來(lái),美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)僅批準(zhǔn)了貝利單抗(belimumab)用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療[18]。由于BCL6和GC的形成與高親力抗體的產(chǎn)生密切相關(guān),已有研究者初步嘗試將靶向BCL6BTB結(jié)構(gòu)域的多肽類抑制劑BPI-1用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡。雖然只是個(gè)例治療,但是患者出現(xiàn)了積極的應(yīng)答反應(yīng)[19],這提示靶向BCL6BTB結(jié)構(gòu)域的藥物具有治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的潛力。因此,本文以BCL6為靶點(diǎn),開發(fā)針對(duì)BCL6BTB結(jié)構(gòu)域的新型高效小分子抑制劑,系統(tǒng)性地評(píng)價(jià)BCL6小分子抑制劑對(duì)Tfh細(xì)胞、GC B細(xì)胞和漿細(xì)胞的影響,以及炎癥因子的分泌和抗體的生成,希望為體液免疫反應(yīng)過(guò)強(qiáng)的自身免疫性疾病的預(yù)防或治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1 材料

8～10周齡雄性C57BL/6小鼠購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Raw264.7和人彌漫大B細(xì)胞株SUDHL4購(gòu)于美國(guó)ATCC。分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)所用的血液來(lái)自志愿者的靜脈血,由上海長(zhǎng)海醫(yī)院提供,符合人體倫理標(biāo)準(zhǔn)。小分子化合物來(lái)源于華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳益華教授課題組。

均相時(shí)間分辨熒光(homogeneous time-resolved fluorescence,HTRF)稀釋緩沖液、6His-XL665 和GST-Tb購(gòu)于Cisbio公司(美國(guó))；BCL6蛋白和SMRT多肽購(gòu)于北京安必奇生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和青霉素&鏈霉素(penicillin & streptomycin,P/S)雙抗均購(gòu)自Gibco公司(美國(guó))；羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimide ester,CFSE)、FITC-Annexin V 凋亡檢測(cè)試劑盒、donkey anti-rat IgG(H+L)-Alexa Fluor 488、eFluor 660-anti-GL7 和IgG(total)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購(gòu)于ThermoFisher Scientific公司(美國(guó))；4-羥基-3-硝基苯基乙?；?4-hydroxy-3-nitrophenylacetyl,NP)購(gòu)自 Santa Cruz公司(美國(guó))；雞免疫球蛋白(chicken gamma globulin,CGG)購(gòu)于Cedarlane公司(加拿大)；白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)和白細(xì)胞介素-21(interleukin-21,IL-21)購(gòu)于PeproTech公司(美國(guó))；anti-CD16/32 Fc購(gòu)于 eBioscience公司(美國(guó))；白細(xì)胞介素-17A(interleukin-17A,IL-17A)、γ 干擾素(interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和 IL-6 ELISA 試劑盒以及PerCP/cy5.5-anti-B220、PerCP/cy5.5-anti-CD4、PE-anti-CXCR5、streptavidin-Cy3、PE-anti-IgG1和APC-anti-PD-1購(gòu)于BioLegend公司(美國(guó))；FITC-anti-FAS、FITC rat anti-mouse CD38、APC rat anti-mouse CD138、IgD、purified NA/LE hamster anti-mouse CD28、purified NA/LE hamster anti-mouse CD3e、紅細(xì)胞裂解液和 3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)顯色液購(gòu)于BD Pharmingen公司(美國(guó))；冰凍切片包埋劑(opti-mum cutting temperature compound,OCT)購(gòu)于Sakura公司(美國(guó))；脂多糖、防淬滅劑、刀豆蛋白A和花生凝集素(peanut agglutinin,PNA)購(gòu)于Sigma公司(德國(guó))；3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,MTS)]購(gòu)于Promega公司(美國(guó))；造血細(xì)胞無(wú)血清X-VIVO培養(yǎng)基購(gòu)于Lonza公司(瑞士)；羧甲基纖維素鈉購(gòu)于上海阿拉丁試劑有限公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司。

1.2 小分子化合物的篩選

HTRF是一種可以用于檢測(cè)純液相體系中兩種蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù),其結(jié)合了熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)和時(shí)間分辨熒光(time-resolved fluorescence,TRF)兩種技術(shù),具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性。在本研究的篩選體系中,能量供體為GST-Tb和BCL6BTBGST,受體為6His-SMRT和6His-XL665,當(dāng)BCL6BTB與SMRT結(jié)合時(shí),BCL6BTB供體上的熒光能量會(huì)轉(zhuǎn)移到 SMRT受體上,此時(shí)在665 nm處能檢測(cè)到熒光,如果藥物破壞了二者的結(jié)合,則熒光消失或減弱。實(shí)驗(yàn)體系為20 μL,在384孔板中加入5× BCL6BTB-GST(6.25 nmol/L)和 5× 6His-SMRT(200 nmol/L),體積均為4 μL,室溫孵育0.5 h,每組設(shè)兩個(gè)復(fù)孔,然后加入10×不同濃度WK429小分子化合物(2 μL),再加入GST-Tb和6His-XL665,體積均為5 μL,室溫孵育過(guò)夜,在Cytation 5細(xì)胞成像微孔板檢測(cè)儀上讀出每孔的數(shù)值。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

1.3.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離

在50 mL離心管中加入15 mL淋巴細(xì)胞分離液,將血液輕輕吹打混勻,緩慢加入2倍體積的血液于淋巴細(xì)胞分離液面上,保持界面清晰。800 r/min離心25 min后,液面分為三層,棄去上層,吸取中間層至新的50 mL離心管中,加入1×磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)(pH=7.4),輕輕吹打均勻,500 r/min離心10 min后棄上清,1×PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

1.3.2 細(xì)胞的培養(yǎng)

人彌漫大B細(xì)胞株SUDHL4培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中,小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,PBMC培養(yǎng)于含有IL-2(200 U/mL)的X-VIVO培養(yǎng)基中,P/S的濃度為1%。細(xì)胞培養(yǎng)在37℃恒溫培養(yǎng)箱中,濕度為95%,CO2體積濃度為5%。

1.3.3 MTS法測(cè)定細(xì)胞增殖

鋪細(xì)胞于96孔板中,細(xì)胞密度為2.5×103～10×103,每孔 100 μL。過(guò)夜培養(yǎng)后,加入 WK429(給藥組)或 FX1(陽(yáng)性組),藥物濃度為:0.045 μmol/L、0.137μmol/L、0.411μmol/L、1.234μmol/L、3.703μmol/L、11.110 μmol/L、33.330 μmol/L 和 100 μmol/L。對(duì)照組加入等量的完全培養(yǎng)基,每組設(shè)兩個(gè)復(fù)孔。藥物孵育72 h后,每孔加入20 μL MTS,在490 nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值,統(tǒng)計(jì)并分析藥物對(duì)細(xì)胞活力的影響。

1.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PBMC,調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106～2.0×106cells/mL,接種于 6 孔板,進(jìn)行藥物處理。將細(xì)胞分為對(duì)照組、給藥組和陽(yáng)性組,其中,對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基；給藥組加入完全培養(yǎng)基和不同濃度的 WK429(5 μmol/L 或 10 μmol/L)；陽(yáng)性組加入完全培養(yǎng)基和不同濃度的陽(yáng)性藥物FX1(5 μmol/L 或 10 μmol/L)。處理 48 h,隨后收集細(xì)胞于離心管中,800 r/min離心5 min,棄上清,1× PBS 洗滌一次,1× binding buffer(100 μL)重懸細(xì)胞。細(xì)胞分為不染組(不加染色試劑)、單染碘化丙啶(propidium iodide,PI)組(加入 5 μL PI)、單染Annexin V 組(加入 5 μL Annexin V)以及 PI和 Annexin V雙染組(PI和Annexin V各加入5 μL)。不同染色組細(xì)胞混勻后,室溫避光孵育15 min,再加入1×binding buffer(300 μL),用流式細(xì)胞儀BD LSRFortessa進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 脂多糖和刀豆蛋白A刺激PBMC分泌炎癥因子實(shí)驗(yàn)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PBMC,調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106～2.0×106cells/mL,接種于 12 孔板,進(jìn)行藥物處理。將細(xì)胞分為空白組、對(duì)照組、給藥組和陽(yáng)性組,其中,空白組加入完全培養(yǎng)基；對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基和脂多糖(10 μg/mL)；給藥組加入完全培養(yǎng)基、脂多糖(10 μg/mL)和不同濃度的WK429(5 μmol/L 或 10 μmol/L)；陽(yáng)性組加入完全培養(yǎng)基、脂多糖(10 μg/mL)和不同濃度的陽(yáng)性藥物FX1(5 μmol/L 或 10 μmol/L)。培養(yǎng) 24 h 后收集細(xì)胞于離心管中,1 000 r/min離心5 min,收集上清,采用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清中的炎癥因子IL-6和TNF-α。刀豆蛋白A刺激PBMC分泌炎癥因子實(shí)驗(yàn)的操作步驟如上所述,刀豆蛋白A的質(zhì)量濃度為5 μg/mL,采用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清中的炎癥因子IFN-γ和IL-17A。

1.6 脂多糖刺激Raw264.7細(xì)胞分泌炎癥因子和趨化因子實(shí)驗(yàn)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Raw264.7細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為 0.5×106～1.0×106cells/mL,接種于 12 孔板,12 h后進(jìn)行藥物處理。如方法1.5所述,將細(xì)胞分為空白組、對(duì)照組、給藥組和陽(yáng)性組,脂多糖添加水平為100 ng/mL。培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞,提取RNA并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA,采用熒光定量PCR 檢測(cè)炎癥因子 IL-1β、IL-6、IL-12p40、TNF-α、CCL2和CCL7的表達(dá)。PCR檢測(cè)的引物信息如下:IL-1β-F:5′-CACAGAGGATACCACTCCCAACA-3′,IL-1β-R:5′-TCCACGATTTCCCAGAGAACA-3′；IL-6-F:5′-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3′,IL-6-R:5′-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3′；IL-12p40-F:5′-TGGTTTGCCATCGTTTTGCTG-3′,IL-12p40-R:5′-ACAGGTGAGGTTCACTGTTTCT-3′；TNF-α-F:5′-CCTGTAGCCCACGTCGTAG-3′,TNF-α-R:5′-GGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3′；CCL2和 CCL7基因的引物序列參照文獻(xiàn)[14]。

1.7 體外Tfh細(xì)胞形成實(shí)驗(yàn)

1.7.1 脾臟細(xì)胞的分離

麻醉處死8～10周齡C57BL/6小鼠,經(jīng)75%乙醇消毒后,取出小鼠脾臟并將其置于40 μm的濾網(wǎng)上。用注射器內(nèi)芯充分研磨脾臟,然后用1×MACS緩沖液(1×PBS+2%FBS+2 mmol/L EDTA)沖洗并收集細(xì)胞懸液。1 500 r/min離心5 min,棄去上清,加入1×紅細(xì)胞裂解液,裂解2 min左右,隨后加入5倍體積的緩沖液終止裂解,用40 μm的濾網(wǎng)過(guò)濾去除細(xì)胞團(tuán)塊；將過(guò)濾液1 500 r/min離心5 min,棄去上清,再用1×MACS緩沖液重懸細(xì)胞,并進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7.2 Tfh細(xì)胞形成實(shí)驗(yàn)

分選出初始CD4+T細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為2.0×105～4.0×105cells/mL,鋪 24 孔板,進(jìn)行藥物處理。將細(xì)胞分為對(duì)照組、給藥組和陽(yáng)性組,其中,對(duì)照組只加入刺激因子:anti-CD3(5 μg/mL)、anti-CD28(2 μg/mL)、anti-IFN-γ (10 μg/mL)、anti-IL-4(10 μg/mL)、anti-TGF-β (20 μg/mL)、IL-6(100 ng/mL)和IL-21(50 ng/mL)；給藥組加入刺激因子和不同濃度的 WK429(5 μmol/L 或 10 μmol/L)；陽(yáng)性組加入刺激因子和不同濃度的陽(yáng)性藥物FX1(5 μmol/L或10 μmol/L)。培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞進(jìn)行染色,用流式細(xì)胞儀BD LSRFortessa檢測(cè)Tfh細(xì)胞(CD4+CXCR5+PD-1+)的形成。

1.8 體外GC B細(xì)胞形成實(shí)驗(yàn)

從脾臟中分離出單個(gè)細(xì)胞,然后分選出總B(B220+)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為 3.0×105～5.0×105cells/mL,鋪24孔板,進(jìn)行藥物處理。如方法1.5所述,將細(xì)胞分為空白組、對(duì)照組、給藥組和陽(yáng)性組。培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞進(jìn)行染色,用流式細(xì)胞儀BD LSRFortessa檢測(cè)GC B細(xì)胞(B220+GL7+)的形成。

1.9 體外漿細(xì)胞的分裂和形成實(shí)驗(yàn)

將分選出的總B(B220+)細(xì)胞用1×PBS溶液洗滌兩次以除去多余的血清,800 r/min離心5 min,棄去上清,用1×PBS(室溫)重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為 5.0×106～10×106cells/mL,加入 CFSE 染料至終濃度為2 μmol/L,隨后立即混勻細(xì)胞懸液,室溫避光孵育10 min。加入4～5倍預(yù)冷的完全培養(yǎng)基,冰上孵育5 min,隨后800 r/min離心5 min,棄去上清,重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為3.0×105～5.0×105cells/mL,鋪24孔板,進(jìn)行藥物處理。將細(xì)胞分為空白組、對(duì)照組、給藥組和陽(yáng)性組,其中,空白組加入完全培養(yǎng)基；對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基、脂多糖(10 μg/mL)和 IL-4(10 ng/mL)；給藥組加入完全培養(yǎng)基、脂多糖(10 μg/mL)、IL-4(10 ng/mL)和不同濃度的 WK429(5 μmol/L 或 10 μmol/L)；陽(yáng)性組加入完全培養(yǎng)基、脂多糖(10 μg/mL)、IL-4(10 ng/mL)和不同濃度的陽(yáng)性藥物FX1(5 μmol/L或10 μmol/L)。培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞進(jìn)行染色,用流式細(xì)胞儀BD LSRFortessa檢測(cè)漿細(xì)胞的分裂(CFSE)和漿細(xì)胞(B220-CD138+)的比例。

1.10 體內(nèi)生發(fā)中心形成實(shí)驗(yàn)

1.10.1 動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)

選擇8～10周的C57BL/6小鼠,腹腔注射100 μg NP偶聯(lián)的CGG。免疫2 d后隨機(jī)分為3組,其中,對(duì)照組為溶劑羧甲基纖維素鈉,給藥組為WK429(50 mg/kg),陽(yáng)性組為FX1(50 mg/kg)。給藥頻率為每天1次,給藥組給藥方式為灌胃給藥,陽(yáng)性組給藥方式為腹腔注射給藥。連續(xù)給藥12 d,免疫后第14天麻醉處死小鼠,取小鼠脾臟放置于1×PBS中。

1.10.2 脾臟細(xì)胞的免疫熒光實(shí)驗(yàn)

用OCT包埋脾臟,放入液氮冷凍后置于-80℃保存。在冰凍切片機(jī)上將脾臟切成6 μm的薄片,丙酮固定15 min后室溫晾干；PBS洗滌10 min,再用0.1%的Triton-X 100通透10 min,10%的FBS封閉30 min；4℃孵育一抗(PNA+IgD)過(guò)夜,PNA的稀釋比例為1︰200,IgD的稀釋比例為1︰500,再用PBST洗3遍,每次3 min,隨后常溫孵育二抗[streptavidin-Cy3+donkey anti-rat IgG(H+L)-Alexa Fluor 488],streptavidin-Cy3的稀釋比例為1︰100,donkey anti-rat IgG(H+L)-Alexa Fluor 488的稀釋比例為1︰300,1 h后回收二抗并同樣用PBST洗3遍,每次3 min；加入防淬滅劑,蓋上蓋玻片,封片后將其置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.10.3 流式細(xì)胞術(shù)分析實(shí)驗(yàn)

從小鼠脾臟中分離出單個(gè)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106cells/mL。每個(gè)樣本取50 μL重懸的細(xì)胞,封閉后分別加入50 μL稀釋好的流式抗體(比例為1︰100),用于GC染色的抗體:PerCP/cy5.5-anti-B220、FITC-anti-FAS 和 eFluor 660-anti-GL7；用于Tfh細(xì)胞檢測(cè)的抗體:PerCP/cy5.5-anti-CD4、PE-anti-CXCR5和APC-anti-PD-1；用于記憶B細(xì)胞檢測(cè)的抗體:FITC rat anti-mouse CD38和PE-anti-IgG1；用于漿細(xì)胞檢測(cè)的抗體:PerCP/cy5.5-anti-B220和APC rat anti-Mouse CD138,4℃避光孵育30 min。加入1 mL的緩沖液終止染色,1 500 r/min離心 5 min,棄去上清,用 300～400 μL緩沖液重懸細(xì)胞,并轉(zhuǎn)移到流式管中,用流式細(xì)胞儀BD LSRFortessa檢測(cè)Tfh細(xì)胞(CXCR5+PD-1+)、GC B 細(xì)胞(FAS+GL7+)、記憶 B 細(xì)胞(CD38+IgG1+)和漿細(xì)胞(B220-CD138+)的變化。

1.11 血清中抗體IgG的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),小鼠眼眶取血,室溫靜置1 h,6 000 r/min離心10 min,吸上層液體(血清)至新的離心管中,按照說(shuō)明書采用小鼠IgG(total)ELISA試劑盒檢測(cè)血清中抗體IgG的含量。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析,多組間比較采用單因素方差分析,P值表示差異的顯著性,當(dāng)P＞0.05時(shí),差異不顯著,標(biāo)注為ns；在差異顯著的情況下,P＜0.05標(biāo)注為*,P＜0.01標(biāo)注為**,P＜0.001標(biāo)注為***。

2 結(jié)果

2.1 小分子化合物WK429的篩選和細(xì)胞活性評(píng)價(jià)

為了檢測(cè)目標(biāo)小分子化合物是否可阻斷BCL6BTB與SMRT的結(jié)合,本文構(gòu)建了HTRF藥物篩選體系,從小分子化合物庫(kù)中篩選到活性最好的化合物WK429(圖1)。對(duì)于BCL6高表達(dá)的人彌漫大B細(xì)胞株SUDHL4,WK429明顯抑制其生長(zhǎng)；此外,WK429對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Raw264.7和 PBMC 的 IC50＞100 μmol/L,表明 WK429 對(duì)免疫細(xì)胞沒(méi)有毒性作用(表1)。

圖1 WK429的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structure of WK429

2.2 WK429對(duì)PBMC的凋亡沒(méi)有影響

采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組(即 Control組)相比,10 μmol/L WK429給藥組的細(xì)胞凋亡比例基本沒(méi)有變化(P＞0.05)(圖2)。這表明WK429不影響PBMC的凋亡。

2.3 WK429抑制PBMC分泌炎癥因子

在PBMC的炎癥因子分泌實(shí)驗(yàn)中,與空白組(即Blank組)相比,脂多糖(Control組)刺激明顯促進(jìn)PBMC分泌炎癥因子IL-6(P＜0.001)和TNF-α(P＜0.01)；而與 Control組相比,10 μmol/L WK429處理后,炎癥因子 IL-6(P＜0.01)和 TNF-α (P＜0.05)的產(chǎn)生明顯降低(圖3A)。此外,在刀豆蛋白A刺激PBMC實(shí)驗(yàn)中,與Blank組相比,刀豆蛋白A(Control組)刺激明顯促進(jìn)PBMC分泌炎癥因子IFN-γ(P＜0.001)和 IL-17A(P＜0.001)；而與 Control組相比,10 μmol/L WK429處理后,炎癥因子 IFN-γ(P＜0.001)和 IL-17A(P＜0.001)的產(chǎn)生也明顯降低(圖3B)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在脂多糖或者刀豆蛋白A的刺激下,WK429抑制PBMC分泌炎癥因子。

表1 WK429的活性評(píng)價(jià)Table 1 The activity evaluation of WK429

圖2 WK429對(duì)PBMC凋亡的影響(A)PBMC細(xì)胞凋亡的流式圖；(B)PBMC細(xì)胞凋亡的統(tǒng)計(jì)圖。ns:P＞0.05 vs.對(duì)照組。Fig.2 Effect of WK429 on the apoptosis of PBMCs(A)The apoptotic cells of PBMC were analyzed by flow cytometry；(B)The apoptotic cells of PBMC were calculated.ns:P＞0.05,compared with the control group.

2.4 WK429抑制Raw264.7細(xì)胞分泌炎癥因子和趨化因子

在Raw264.7細(xì)胞的炎癥因子分泌實(shí)驗(yàn)中,與空白組(即 Blank組)相比,脂多糖(Control組)刺激明顯促進(jìn)Raw264.7細(xì)胞分泌炎癥因子IL-1β(P＜0.001)、IL-6(P＜0.001)、IL-12p40(P＜0.001)和TNF-α (P＜0.001)；而與 Control組相比,10 μmol/L WK429 處理后,炎癥因子 IL-1β (P＜0.001)、IL-6(P＜0.001)、IL-12p40(P＜0.01)和 TNF-α (P＜0.01)的產(chǎn)生明顯降低(圖4A)。此外,與Blank組相比,脂多糖(Control組)刺激明顯促進(jìn)Raw264.7細(xì)胞分泌趨化因子 CCL2(P＜0.001)和 CCL7(P＜0.001)；而與Control組相比,10 μmol/L WK429處理后,趨化因子 CCL2(P＜0.001)和 CCL7(P＜0.001)的表達(dá)也明顯下調(diào)(圖4B)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在脂多糖的刺激下,WK429抑制Raw264.7細(xì)胞分泌炎癥因子和趨化因子。

圖3 WK429抑制PBMC分泌炎癥因子(A)在脂多糖刺激下,WK429抑制PBMC分泌炎癥因子IL-6和TNF-α；(B)在刀豆蛋白A刺激下,WK429抑制PBMC分泌炎癥因子 IFN-γ和 IL-17A。ns:P＞0.05；*:P＜0.05；**:P＜0.01；***:P＜0.001。Fig.3 WK429 inhibited the production of inflammatory factors in PBMCs(A)WK429 inhibited the expression of inflammatory factors IL-6 and TNF-α in PBMCs stimulated by lipopolysaccharide；(B)WK429 inhibited the expression of inflammatory factors IFN-γ and IL-17A in PBMCs stimulated by concanavalin A.ns:P＞0.05；*:P＜0.05；**:P＜0.01；***:P＜0.001.

2.5 WK429體外抑制Tfh細(xì)胞的形成

在刺激因子的作用下,對(duì)照組(即Control組)中的初始CD4+T細(xì)胞明顯分化成Tfh細(xì)胞,而與Control組相比,10 μmol/L WK429給藥組中Tfh細(xì)胞(CXCR5+PD-1+)的比例明顯降低(P＜0.001),并且低于10 μmol/L FX1陽(yáng)性組Tfh細(xì)胞的比例(圖5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明WK429體外抑制Tfh細(xì)胞的形成。

2.6 WK429體外抑制GC B細(xì)胞的形成

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)體外培養(yǎng)條件下GC B細(xì)胞的形成情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白組(即Blank組)相比,脂多糖(Control組)處理下GC B細(xì)胞(B220+GL7+)的比例明顯增加(P＜0.001),而與Control組相比,10 μmol/L WK429給藥組中GC B細(xì)胞的比例明顯降低(P＜0.001),并且低于10 μmol/L FX1陽(yáng)性組GC B細(xì)胞的比例(圖6)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明WK429體外抑制GC B細(xì)胞的形成。

2.7 WK429體外抑制漿細(xì)胞的分裂和形成

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)體外培養(yǎng)條件下漿細(xì)胞的分裂和形成,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白組(即Blank組)相比,脂多糖(Control組)處理下峰形圖左移且峰的數(shù)目明顯增加(P＜0.01),這表示漿細(xì)胞的分裂能力增強(qiáng)；而與Control組相比,10 μmol/L WK429給藥組中峰形圖右移并且峰的數(shù)目顯著減少(P＜0.01),幾乎是單一峰形,基本恢復(fù)到Blank組的水平,這表示漿細(xì)胞的分裂能力顯著降低(圖7A,C)。此外,與Blank組相比,Control組中漿細(xì)胞(B220-CD138+)的比例明顯增加(P＜0.001),而與Control組相比,10 μmol/L WK429給藥組中漿細(xì)胞的比例明顯降低(P＜0.001),并且低于10 μmol/L FX1陽(yáng)性組漿細(xì)胞的比例(圖7B,D)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明WK429體外抑制漿細(xì)胞的分裂和形成。

2.8 WK429體內(nèi)抑制Tfh細(xì)胞和GC B細(xì)胞的形成

動(dòng)物免疫后第14天,GC形成達(dá)到高峰,取小鼠脾臟檢測(cè)Tfh細(xì)胞和GC B細(xì)胞的形成情況。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明,與單純的羧甲基纖維素鈉(Control組)處理相比,50 mg/kg WK429給藥組脾臟中Tfh細(xì)胞(CXCR5+PD-1+)的比例明顯降低(P＜0.01),并且顯著低于50 mg/kg FX1陽(yáng)性組的比例(P＜0.05)(圖 8A,C)；此外,與 Control組相比,50 mg/kg WK429給藥組脾臟中GC B細(xì)胞(FAS+GL7+)的比例也明顯降低(P＜0.01),并與50 mg/kg FX1陽(yáng)性組的比例相當(dāng)(圖8B,D)；但是,與50 mg/kg WK429給藥組相比,50 mg/kg FX1陽(yáng)性組脾臟中總B細(xì)胞的比例顯著降低(P＜0.05)(圖8E)。因此,WK429可抑制脾臟中Tfh細(xì)胞和GC B細(xì)胞的形成。

2.9 WK429體內(nèi)抑制生發(fā)中心的形成

動(dòng)物免疫后第14天,取小鼠脾臟進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)GC的形成。PNA是GC特異表達(dá)的糖蛋白,可以用于GC染色,IgD可用于總B細(xì)胞染色。與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果一致,免疫熒光結(jié)果表明,與Control組相比,50 mg/kg WK429給藥組脾臟中GC的面積(圖9A黃色箭頭所指)明顯減少(P＜0.001),并且低于50 mg/kg FX1陽(yáng)性組脾臟中GC的面積(圖9)。因此,免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證明WK429可體內(nèi)抑制GC的形成。

圖4 在脂多糖刺激下WK429抑制Raw264.7細(xì)胞分泌炎癥因子和趨化因子(A)在Raw264.7細(xì)胞中,WK429抑制炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-12p40和TNF-α的表達(dá)；(B)在Raw264.7細(xì)胞中,WK429抑制趨化因子 CCL2 和 CCL7 的表達(dá)。ns:P＞0.05；*:P＜0.05；**:P＜0.01；***:P＜0.001。Fig.4 WK429 inhibited inflammatory factor and chemokine secretion in Raw264.7 cells stimulated by lipopolysaccharide(A)WK429 inhibited the expression of inflammatory factors IL-1β,IL-6,IL-12p40 and TNF-α in Raw264.7 cells；(B)WK429 inhibited the expression of chemokines CCL2 and CCL7 in Raw264.7 cells.ns:P＞0.05；*:P＜0.05；**:P＜0.01；***:P＜0.001.

2.10 WK429體內(nèi)抑制漿細(xì)胞的形成和抗體IgG的產(chǎn)生

圖5 WK429體外抑制Tfh細(xì)胞的形成(A)WK429抑制Tfh細(xì)胞形成的流式圖；(B)WK429抑制Tfh細(xì)胞形成的統(tǒng)計(jì)圖。ns:P＞0.05 vs.對(duì)照組；*:P＜0.05 vs.對(duì)照組；**:P＜0.01 vs.對(duì)照組；***:P＜0.001 vs.對(duì)照組。Fig.5 WK429 inhibited the formation of Tfh cells in vitro(A)The rate of CXCR5+PD-1+Tfh cells was analyzed by flow cytometry；(B)The rate of Tfh cells was calculated.ns:P＞0.05,compared with the control group；*:P＜0.05,compared with the control group；**:P＜0.01,compared with the control group；***:P＜0.001,compared with the control group.

圖6 WK429體外抑制GC B細(xì)胞的形成(A)WK429抑制GC B細(xì)胞形成的流式圖；(B)WK429抑制GC B細(xì)胞形成的統(tǒng)計(jì)圖。*:P＜0.05；**:P＜0.01；***:P＜0.001。Fig.6 WK429 inhibited the formation of GC B cells in vitro(A)The rate of B220+GL7+GC B cells was analyzed by flow cytometry；(B)The rate of GC B cells was calculated.*:P＜0.05；**:P＜0.01；***:P＜0.001.

動(dòng)物免疫后第 14天,取小鼠脾臟檢測(cè)漿細(xì)胞的形成情況。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明,與Control組相比,50 mg/kg WK429給藥組脾臟中記憶B細(xì)胞的比例不變(P＞0.05),這表示W(wǎng)K429不影響記憶B細(xì)胞的形成(圖10A,C)；但是,漿細(xì)胞的比例明顯降低(P＜0.01),從0.90%下降到0.26%,并且低于50 mg/kg FX1陽(yáng)性組脾臟中漿細(xì)胞的比例(0.33%)(圖10B,D),這表明WK429抑制漿細(xì)胞的形成。此外,與Control組相比,50 mg/kg WK429給藥組中抗體IgG的含量明顯降低(P＜0.05),這表示抗體IgG的產(chǎn)生受到抑制(圖10E)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,WK429抑制漿細(xì)胞的形成和抗體IgG的產(chǎn)生。

圖7 WK429體外抑制漿細(xì)胞的分裂和形成(A)WK429抑制漿細(xì)胞分裂的流式圖；(B)WK429抑制漿細(xì)胞形成的流式圖；(C)WK429抑制漿細(xì)胞分裂的統(tǒng)計(jì)圖；(D)WK429抑制漿細(xì)胞形成的統(tǒng)計(jì)圖。**:P＜0.01；***:P＜0.001。Fig.7 WK429 inhibited the division and formation of plasma cells in vitro(A)The division of plasma cells was analyzed by CFSE；(B)The rate of plasma cell was analyzed by flow cytometry；(C)The division of plasma cells was calculated；(D)The rate of plasma cells was calculated.**:P＜0.01；***:P＜0.001.

3 討論

目前,研究者在多種自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)和重癥肌無(wú)力(myasthenia gravis,MG)等患者或動(dòng)物模型中均發(fā)現(xiàn)GC的形成和自身抗體的產(chǎn)生[15～16,20]。Tfh細(xì)胞是一種新發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞亞群,專門用于刺激GC的形成以及在GC中選擇高親和力的B細(xì)胞,有助于抗體產(chǎn)生[21～23]。針對(duì)Tfh細(xì)胞在自身免疫性疾病中的作用,人們主要在小鼠模型中進(jìn)行探索,研究表明易患疾病的小鼠中存在大量的Tfh細(xì)胞[24]。此外,研究者發(fā)現(xiàn)循環(huán)Tfh細(xì)胞中BCL6的表達(dá)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡全身疾病的活動(dòng)呈正相關(guān)[25]。在Tfh細(xì)胞分化過(guò)程中,BCL6表達(dá)上調(diào),缺失BCL6的T細(xì)胞不能分化為Tfh細(xì)胞,而持續(xù)性表達(dá)BCL6可以增強(qiáng)Tfh細(xì)胞的分化能力。此外,增殖后的GC B細(xì)胞從暗區(qū)遷移到亮區(qū),在這里,Tfh細(xì)胞幫助GC B細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行抗體類別轉(zhuǎn)換和陽(yáng)性細(xì)胞選擇[23,26～28]。Tfh細(xì)胞和GC B細(xì)胞都是GC反應(yīng)不可或缺的,在這兩種細(xì)胞類型中BCL6的缺失會(huì)導(dǎo)致GC反應(yīng)的終止[29]。

圖8 WK429體內(nèi)抑制Tfh細(xì)胞和GC B細(xì)胞的形成(A)WK429抑制Tfh細(xì)胞形成的流式圖；(B)WK429抑制GC B細(xì)胞形成的流式圖；(C)WK429抑制Tfh細(xì)胞形成的統(tǒng)計(jì)圖；(D)WK429抑制GC B細(xì)胞形成的統(tǒng)計(jì)圖；(E)WK429對(duì)總B細(xì)胞比例的影響。*:P＜0.05；**:P＜0.01。Fig.8 WK429 inhibited the formation of Tfh cells and GC B cells in vivo(A)The rate of CXCR5+PD-1+Tfh cells was analyzed by flow cytometry；(B)The rate of B220+GL7+FAS+GC B cells was analyzed by flow cytometry；(C)The rate of Tfh cells was calculated；(D)The rate of GC B cells was calculated；(E)Effect of WK429 on the rate of total B cells.*:P＜0.05；**:P＜0.01.

越來(lái)越多的研究表明,BCL6是一個(gè)潛在的藥物靶點(diǎn)[30]。在GC反應(yīng)過(guò)程中,BCL6的基因發(fā)生易位和點(diǎn)突變,導(dǎo)致BCL6蛋白持續(xù)性高表達(dá),從而促進(jìn)B細(xì)胞惡性增殖,驅(qū)動(dòng)GC衍生淋巴瘤的發(fā)生[9]。在腫瘤中,阻斷BCL6-BTB與其轉(zhuǎn)錄共抑制子之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是治療彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)的有效策略[31]。近年來(lái),BCL6抑制劑不斷涌現(xiàn)[32～38],但大部分都是針對(duì)腫瘤方面的研究,而且目前BCL6抑制劑也存在諸多問(wèn)題,比如:細(xì)胞水平活性低、生物利用度差和溶解性差等。大部分BCL6抑制劑只有體外數(shù)據(jù),體內(nèi)數(shù)據(jù)尚未報(bào)道。盡管陽(yáng)性化合物FX1在體內(nèi)外均存在抗腫瘤活性,但是其溶解度不高。因此,本文以BCL6為靶點(diǎn),開發(fā)針對(duì)BCL6BTB結(jié)構(gòu)域的新型高效的小分子抑制劑。

圖9 WK429體內(nèi)抑制生發(fā)中心的形成(A)WK429抑制生發(fā)中心形成的免疫熒光圖(標(biāo)尺:100 μm)；(B)WK429抑制生發(fā)中心形成的的統(tǒng)計(jì)圖。***:P＜0.001 vs.對(duì)照組。Fig.9 WK429 inhibited the formation of GCs in vivo(A)Representative staining of GC was analyzed by immunofluorescence(scale bar:100 μm)；(B)The areas of GC was calculated.***:P＜0.001,compared with the control group.

通過(guò)HTRF篩選體系,我們從小分子化合物庫(kù)篩選到WK429。在體外,WK429能夠抑制PBMC產(chǎn)生炎癥因子 IL-6、TNF-α、IFN-γ 和 IL-17A,抑制Raw264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子 IL-1β、IL-6、IL-12p40和TNF-α,表明WK429具有抑制炎癥的作用,這與陽(yáng)性化合物FX1的抗炎作用一致。研究表明,BCL6抑制劑FX1能夠降低炎癥因子的產(chǎn)生,減弱巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)活性,并提高患有膿毒癥小鼠的存活率[39]。在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,WK429不僅抑制Tfh細(xì)胞和GC B細(xì)胞的形成,而且顯著降低漿細(xì)胞的形成和抗體IgG的產(chǎn)生,表明WK429通過(guò)對(duì)Tfh細(xì)胞和GC B細(xì)胞的影響,抑制GC反應(yīng),最終起到調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng)的作用。與陽(yáng)性藥物FX1腹腔注射給藥相比,WK429可以口服給藥,更具有成藥的潛力。此外,與WK429給藥組相比,陽(yáng)性藥物FX1明顯影響總B細(xì)胞的形成。雖然存在BCL6多肽類抑制劑BPI-1治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的個(gè)例報(bào)道,但是多肽屬于大分子藥物,而大分子藥物一般作用于細(xì)胞表面的靶點(diǎn),抑制蛋白質(zhì)相互作用,特異性強(qiáng),不能口服,難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),即使改造后可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),多肽類藥物的費(fèi)用也較高。從市場(chǎng)份額來(lái)看,小分子藥物占有率達(dá)70%,而且小分子化合物可以口服,能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)作用于胞內(nèi)靶點(diǎn)?？偟膩?lái)講,本研究系統(tǒng)性地評(píng)價(jià)了小分子化合物WK429抑制炎癥和降低體液免疫反應(yīng)的作用,具有為體液免疫反應(yīng)過(guò)強(qiáng)的自身免疫性疾病的預(yù)防或治療提供新策略的潛力。

圖10 WK429體內(nèi)抑制漿細(xì)胞的形成和抗體IgG的產(chǎn)生(A)記憶B細(xì)胞的流式圖；(B)WK429抑制漿細(xì)胞形成的流式圖；(C)記憶B細(xì)胞占比的統(tǒng)計(jì)圖；(D)WK429抑制漿細(xì)胞形成的統(tǒng)計(jì)圖；(E)WK429抑制抗體IgG產(chǎn)生。ns:P＞0.05 vs.對(duì)照組；*:P＜0.05 vs.對(duì)照組；**:P＜0.01 vs.對(duì)照組。Fig.10 WK429 inhibited the formation of plasma cells and the production of IgG antibody in vivo(A)The rate of CD38+IgG1+memory B cells was analyzed by flow cytometry；(B)The rate of B220-CD138+plasma cells was analyzed by flow cytometry；(C)The rate of memory B cells was calculated；(D)The rate of plasma cells was calculated；(E)WK429 inhibited the production of IgG antibody.ns:P＞0.05,compared with the control group；*:P＜0.05,compared with the control group；**:P＜0.01,compared with the control group.