鯊魚(yú)單域抗體-堿性磷酸酶融合蛋白的表達(dá)及熱穩(wěn)定性分析

劉 鑫,屈躍寬,曹立民,隋建新

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是一種基于抗原抗體特異性結(jié)合的快速檢測(cè)技術(shù),具有高靈敏性、簡(jiǎn)便性和高通量等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于農(nóng)獸藥殘留、環(huán)境污染物、生物毒素和食品添加劑等危害物的檢測(cè)中。常規(guī)ELISA通常包括添加一抗和酶標(biāo)二抗兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1],其中辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)標(biāo)記的二抗是ELISA中的核心物質(zhì)之一。現(xiàn)階段酶標(biāo)二抗的制備普遍使用化學(xué)偶聯(lián)的方式將抗體與酶交聯(lián),反應(yīng)過(guò)程可能會(huì)產(chǎn)生分子的隨機(jī)交聯(lián)[2],導(dǎo)致酶活性及抗體親和性的不同程度損失。同時(shí),化學(xué)偶聯(lián)物的分子比例難以控制,偶聯(lián)過(guò)程需要昂貴的試劑,且HRP標(biāo)記的抗體對(duì)溫度敏感,在高溫下極易變性失活,這些不足影響了其在ELISA技術(shù)中的應(yīng)用[3]。

堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AP)可以水解去除底物上的磷酸基團(tuán),是廣泛使用的免疫診斷試劑之一,但其表面糖基含量較低,通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)法獲得抗體-堿性磷酸酶復(fù)合物的效率較低,價(jià)格昂貴,熱穩(wěn)定性較差[4],在ELISA中應(yīng)用較少。研究報(bào)道發(fā)現(xiàn),使用基因工程構(gòu)建酶和抗體的融合蛋白可以代替化學(xué)偶聯(lián)的方法進(jìn)行抗體標(biāo)記[5-6],且可以克服化學(xué)偶聯(lián)方法的許多劣勢(shì)。針對(duì)單鏈抗體-堿性磷酸酶(scFv-AP)融合蛋白的研究表明,堿性磷酸酶可在保持酶活性的同時(shí)提高scFv-AP融合蛋白對(duì)抗原的親和力[7-8],在熒光免疫分析中具有更高的靈敏性[9]。近年來(lái),雖然scFv-AP融合蛋白已用于萊克多巴胺、O,O-二乙基有機(jī)磷農(nóng)藥[10-11]等小分子化合物的檢測(cè),但通過(guò)基因工程技術(shù)獲得具有高親和力和高熱穩(wěn)定性的單鏈抗體[12-13]仍然可遇不可求。

單域抗體(single-domain antibody,sdAbs)是利用基因工程技術(shù)從駱駝科動(dòng)物和軟骨魚(yú)血清中克隆得到的只保留重鏈可變區(qū)的具有抗原結(jié)合活性的新型抗體[14]。與常規(guī)抗體相比,sdAb分子量小(約15 kDa),具有更高的親和力和熱穩(wěn)定性?；谶@些優(yōu)點(diǎn),包括駱駝重鏈可變區(qū)(VHH)和鯊魚(yú)重鏈可變區(qū)(VNAR)在內(nèi)的sdAb已被廣泛用于治療、檢測(cè)和生物技術(shù)等領(lǐng)域[15-20]。研究發(fā)現(xiàn),與原始VHH相比,VHH-AP融合蛋白可增加抗體的結(jié)合親和力,且熱穩(wěn)定性與原始抗體相比沒(méi)有明顯變化[21-23]。鯊源VNAR因其特定的結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)環(huán)境而具有更好的親和力和穩(wěn)定性[24-25],但受到動(dòng)物養(yǎng)殖限制,關(guān)于VNAR的研究報(bào)道相對(duì)較少。

肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase,MBSP)作為絲氨酸蛋白酶的一種,廣泛存在于魚(yú)類肌肉組織中,在適宜條件下可有效降解肌原纖維中的肌球蛋白重鏈,是導(dǎo)致魚(yú)糜制品蛋白凝膠劣化、彈性下降的主要原因[26]。本實(shí)驗(yàn)室前期利用鯊魚(yú)VNAR抗體進(jìn)行了MBSP活性抑制的研究,該研究已通過(guò)噬菌體展示技術(shù)從鯊魚(yú)單域抗體文本庫(kù)中淘選出可識(shí)別MBSP的VNAR抗體基因,并表達(dá)出特異性識(shí)別MBSP的VNAR抗體,將其命名為B7(已申請(qǐng)名為“一種鰱魚(yú)魚(yú)糜凝膠劣化的生物抑制劑”的發(fā)明專利)。本研究以B7為目的基因,克隆表達(dá)單域抗體-堿性磷酸酶(B7-AP)融合蛋白,對(duì)融合蛋白的親和力和熱穩(wěn)定性進(jìn)行研究,可為單域抗體-堿性磷酸酶融合蛋白在ELISA中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

限制性核酸內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶 北京New England Biolabs公司;2xT5 Super PCR Mix和DNA凝膠純化試劑盒 北京擎科生物技術(shù)有限公司;氨芐青霉素,SDS-PAGE凝膠試劑盒,異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)和HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG 北京索萊寶科技有限公司;EL-P-NPP顯色試劑盒、引物AP-F和AP-R 上海生工生物工程股份有限公司;大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞,大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞和快速質(zhì)粒小提試劑盒DP105 北京天根生化科技有限公司;生物素化試劑盒 江蘇博美達(dá)生物科學(xué)有限公司;所有緩沖液配制所用試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純;攜帶AP基因的載體pet22b-phoA 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)饋贈(zèng);鼠抗鯊魚(yú)VNAR抗體IgG 馬里蘭大學(xué)醫(yī)學(xué)院友情提供;兔源抗his標(biāo)簽的多克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 上海生工生物工程股份有限公司;MBSP蛋白、特異性VNAR抗體(B7)和堿性磷酸酶(AP) 本實(shí)驗(yàn)室前期研究制備。

CMax Plus微孔板酶標(biāo)儀 上海美谷分子儀器;Octet RED96e 美國(guó)加利福尼亞州ForteBio公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pet22b-B7-phoA的構(gòu)建 通過(guò)互補(bǔ)限制位點(diǎn)將B7的C末端融合到堿性磷酸酶編碼基因片段phoA的N末端構(gòu)建編碼B7-AP融合蛋白的重組質(zhì)粒pet22b-B7-phoA。使用2xT5 Super PCR Mix,擴(kuò)增B7基因(AP-F:5′-CAGAGCTCATAATAA GGAATTCCATGGCTCGAGTGGAC;AP-R:5′-AAGC TTGGCCGCATTCACAGTCAC)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠驗(yàn)證后用DNA凝膠純化試劑盒純化,用Sac I和Hind Ⅲ限制性核酸內(nèi)切酶同時(shí)酶切目的片段B7和載體pet22b-phoA后,使用T4 DNA連接酶將酶切后的B7片段連接到載體pet22b-phoA中。通過(guò)熱擊法(42 ℃,45 s)將重組的pet22b-B7-phoA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌接種到含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上,在37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后,挑選陽(yáng)性單克隆按照快速質(zhì)粒小提試劑盒DP105的使用方法提取質(zhì)粒,送到上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.2.2 B7-AP融合蛋白的表達(dá) 以熱擊法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,在含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板中37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液態(tài)培養(yǎng)基中37 ℃振蕩(轉(zhuǎn)速200 r/min)培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6,加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L,16 ℃振蕩(轉(zhuǎn)速200 r/min)誘導(dǎo)18 h,4000×g離心20 min收集細(xì)菌細(xì)胞,用TBS緩沖液(50 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl)洗滌3次后復(fù)溶菌體,在高壓(6×107～7×107Pa)條件下破碎細(xì)胞。將破碎后的細(xì)胞用12000×g離心30 min后收集上清液,利用12% SDS-PAGE(按照北京索萊寶科技有限公司SDS-PAGE凝膠試劑盒的具體步驟配制)驗(yàn)證[27]可溶性B7-AP融合蛋白的表達(dá)效果。

1.2.3 表達(dá)條件的優(yōu)化 在1.2.2的基礎(chǔ)上,通過(guò)改變IPTG的終濃度(0～1 mmol/L,誘導(dǎo)溫度為16 ℃)和誘導(dǎo)溫度(16、20、30、37 ℃,IPTG終濃度為0.5 mmol/L)探究融合蛋白的最佳表達(dá)條件,并將表達(dá)后的上清液同樣通過(guò)12% SDS-PAGE進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.4 B7-AP融合蛋白的純化 將表達(dá)上清液經(jīng)0.45 μm無(wú)菌過(guò)濾器除菌后上樣到Ni-親和層析柱中,用十倍柱床體積的結(jié)合緩沖液(TBS緩沖液,pH8.0)洗滌后,用含不同濃度(20、50、100、200 mmol/L)咪唑的結(jié)合緩沖液洗脫,收集各洗脫組分,利用12% SDS-PAGE 驗(yàn)證純化效果,使用Image J軟件調(diào)節(jié)凝膠圖片的灰度,對(duì)洗脫后的蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行灰度分析,確定純化后融合蛋白的純度。并利用兔源抗his標(biāo)簽的多克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG進(jìn)行Western blot(WB)鑒定,最后收集純化的B7-AP融合蛋白,用TBS緩沖液于4 ℃過(guò)夜透析后在-20 ℃條件下存儲(chǔ)備用。

1.2.5 B7-AP融合蛋白的鑒定

1.2.5.1 B7-AP融合蛋白的酶活測(cè)定 將B7-AP融合蛋白和AP分別稀釋成系列濃度后添加到96孔板中,100 μL/孔,再向孔中添加100 μL P-NPP試劑,混勻后置于37 ℃下孵育5 min,最后加入50 μL 4 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng),利用CMax Plus微孔板酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm處的吸光度。

1.2.5.2 B7-AP融合蛋白的抗體親和力測(cè)定 鯊魚(yú)VNAR抗體B7對(duì)MBSP的特異性在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中已經(jīng)證實(shí),考慮融合蛋白的表達(dá)沒(méi)有改變B7的基因序列,因此在本研究中采用生物膜干涉技術(shù)(Biofilm interference,BLI)測(cè)定融合蛋白與MBSP的特異性親和能力。具體操作為:用PBS緩沖液平衡傳感器60 s后,加入生物素標(biāo)記后的MBSP(濃度為5 μg/mL)進(jìn)行固定,用PBST緩沖液(含0.02% Tween-20的PBS緩沖液,pH7.4)封閉180 s。在30 ℃的恒溫條件下觀察不同梯度下B7-AP融合蛋白及特異性VNAR抗體B7與MBSP的結(jié)合和解離情況,并通過(guò)Octet RED96e數(shù)據(jù)處理程序計(jì)算B7-AP融合蛋白和特異性VNAR抗體B7的親和常數(shù)(KD)。

1.2.6 B7-AP融合蛋白的熱穩(wěn)定性分析 熱處理可能會(huì)影響融合蛋白中AP的催化活性和B7的抗原結(jié)合活性,本研究將融合蛋白和單獨(dú)的B7、AP在不同溫度(20～85 ℃)和時(shí)間(0～180 min)下加熱處理后,分別進(jìn)行活性對(duì)比。

1.2.6.1 融合蛋白B7-AP和AP酶活測(cè)定 方法同1.2.5。

1.2.6.2 抗原結(jié)合能力測(cè)定 B7抗原結(jié)合能力測(cè)定方法采用常規(guī)間接ELISA方法,MBSP包被濃度為 30 μg/mL,一抗為特異性VNAR抗體B7,二抗為鼠抗鯊魚(yú)VNAR抗體IgG,最后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG用于顯色;B7-AP融合蛋白的抗原結(jié)合能力采用直接ELISA方法測(cè)定:將MBSP用CBS緩沖液稀釋至30 μg/mL后添加到96孔板(100 μL/孔)中,37 ℃孵育2 h后用TBST緩沖液(含有0.05%的Tween-20,pH7.4的TBS緩沖液)洗滌3次。每孔添加300 μL含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液,在4 ℃條件下過(guò)夜封閉,并用TBST緩沖液洗滌3次。加入經(jīng)過(guò)不同熱處理并恢復(fù)至室溫的B7-AP融合蛋白稀釋液,在37 ℃孵育1.5 h后,用TBST緩沖液洗滌3次,加入100 μL稀釋的P-NPP試劑并在37 ℃下孵育15 min,最后加入50 μL 4 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng),使用CMax Plus微孔板酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm處的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)三次,應(yīng)用Origin 8.5數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的誤差分析及作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 B7-AP融合蛋白的表達(dá)

B7-AP融合蛋白由sdAb(14.3 kDa)和AP(47.7 kDa)兩部分組成,理論分子量為62 kDa。如圖1a所示,誘導(dǎo)溫度對(duì)B7-AP融合蛋白的表達(dá)影響顯著,僅在較低的誘導(dǎo)溫度(16 ℃/20 ℃)下上清液中才出現(xiàn)目標(biāo)條帶,在30和37 ℃時(shí)上清液中并無(wú)目的蛋白的表達(dá)。這可能是由于在誘導(dǎo)溫度較高時(shí),轉(zhuǎn)錄和翻譯速度過(guò)快,多肽鏈沒(méi)有足夠時(shí)間進(jìn)行正確折疊,二硫鍵以錯(cuò)誤形式形成,蛋白質(zhì)易形成錯(cuò)誤的空間結(jié)構(gòu),進(jìn)而形成無(wú)蛋白活性的包涵體,而在較低溫度時(shí),基因的翻譯速率變慢,有利于蛋白質(zhì)的正確折疊,促進(jìn)蛋白的可溶性表達(dá)[28-29]。IPTG濃度在0.05～1 mmol/L范圍內(nèi)對(duì)B7-AP融合蛋白的表達(dá)無(wú)明顯影響(圖1b,圖1c),考慮到IPTG的存在可能會(huì)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng),選擇0.05 mmol/L的IPTG作為最終誘導(dǎo)濃度。

圖1 表達(dá)條件優(yōu)化的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE gel image ofthe optimization of expression conditions注:a圖表示不同溫度下誘導(dǎo)表達(dá)的B7-AP融合蛋白;b圖表示不同IPTG濃度(0～0.2 mmol/L)誘導(dǎo)的B7-AP融合蛋白;c圖表示不同IPTG濃度(0～1 mmol/L)誘導(dǎo)的B7-AP融合蛋白。

用Ni-親和層析純化的B7-AP融合蛋白,通過(guò)SDS-PAGE和WB均發(fā)現(xiàn)一個(gè)約63 kDa的目的條帶(圖2),表明B7-AP融合蛋白表達(dá)成功。經(jīng)計(jì)算,1 L發(fā)酵液可以純化得到5 mg純度為 90%的B7-AP融合蛋白。

圖2 純化后B7-AP融合蛋白的SDS-PAGE圖和Western Blot圖Fig.2 SDS-PAGE and WesternBlot gel image of purified B7-AP注:泳道M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白;泳道1為空白對(duì)照組;泳道2為表達(dá)后的上清提取液;泳道3為純化后的B7-AP融合蛋白;泳道4為純化后B7-AP融合蛋白的Western Blot圖。

2.2 B7-AP融合蛋白的活性

B7-AP融合蛋白應(yīng)同時(shí)具有酶促活性和抗原結(jié)合活性。EL-P-NPP顯色試劑盒檢測(cè)表明:B7-AP融合蛋白表現(xiàn)出良好的顯色反應(yīng),在405 nm處的吸光度隨融合蛋白濃度的增加而增加,在1.25 μmol/L的濃度下吸光度達(dá)到4.00(圖3)。在相同摩爾濃度下,B7-AP融合蛋白的OD405值略低于AP,這可能是因?yàn)槊傅幕钚匀Q于其結(jié)合基團(tuán)、催化基團(tuán)及其酶活性中心的空間結(jié)構(gòu),融合蛋白的空間折疊覆蓋了部分堿性磷酸酶的活性位點(diǎn),并使其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[30]。

圖3 在相同摩爾濃度下B7-AP融合蛋白與AP的酶活性對(duì)比Fig.3 The enzyme activity of the B7-AP fusionprotein compared with AP at the same molar concentration

BLI是一種無(wú)標(biāo)記的生物分析技術(shù),通過(guò)測(cè)量親和常數(shù)(KD,單位為mol/L),結(jié)合常數(shù)(Kon,即在1 mol/L的反應(yīng)物A和B下,每秒產(chǎn)生的復(fù)合物數(shù)量,單位為L(zhǎng)/(mol·s))和解離常數(shù)(Koff,即每秒解離的復(fù)合物的百分比,單位為1/s)等動(dòng)力學(xué)參數(shù),直接分析抗體對(duì)抗原的特異性識(shí)別效果。Kon表示抗原抗體形成復(fù)合物的形成速率,Kon值越大,抗原抗體結(jié)合越快;Koff反映了形成的復(fù)合物的穩(wěn)定性,Koff值越大,復(fù)合物解離越快;KD則可以反映抗原與抗體相互作用的結(jié)合能力的大小,當(dāng)KD值達(dá)到10-8mol/L時(shí),表明抗原抗體之間具有很高的親和性。結(jié)果顯示(圖4,表1):抗原抗體的結(jié)合程度隨抗體濃度的增加而增加,融合蛋白B7-AP比B7具有更高的Kon值和更低的Koff值,表明融合蛋白更容易結(jié)合抗原并產(chǎn)生更穩(wěn)定的綴合物。同時(shí),B7-AP的KD(Koff/Kon)值(7.80×10-8mol/L)低于B7的KD值(1.94×10-7mol/L),表明融合蛋白的親和力優(yōu)于B7。已有研究發(fā)現(xiàn),AP在溶液中可以自發(fā)產(chǎn)生二聚體,增強(qiáng)融合抗體的活性,進(jìn)而增強(qiáng)抗體與抗原的有效結(jié)合[5,31],本實(shí)驗(yàn)也表明,B7-AP融合的二聚化顯然有助于抗體具有更高的抗原結(jié)合力。

圖4 不同濃度抗體的結(jié)合解離曲線Fig.4 The binding and dissociation curves ofantibodies at different concentrations注:a圖為不同濃度B7的結(jié)合解離圖;b圖為不同濃度B7-AP的結(jié)合解離圖。

表1 B7和B7-AP的Kon,Koff和KD值Table 1 Comparison of Kon,Koff andKD value between B7 and B7-AP

2.3 融合蛋白的熱穩(wěn)定性

圖5 B7-AP融合蛋白的熱穩(wěn)定性測(cè)量結(jié)果Fig.5 The thermal stability measurement of the B7-AP fusion protein注:a圖為不同溫度下處理10 min后保留酶活對(duì)比結(jié)果;b圖為58 ℃下處理不同時(shí)間后保留酶活對(duì)比結(jié)果;c圖為不同溫度下處理10 min后保留的抗原結(jié)合能力對(duì)比結(jié)果;d圖為58 ℃下處理不同時(shí)間后保留的抗原結(jié)合能力對(duì)比結(jié)果。

在不同溫度下處理10 min后,單獨(dú)的AP活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),在37～70 ℃溫度范圍內(nèi)活性較高,在85 ℃加熱10 min后,仍保留了80%以上的活性,表明AP二聚體的形成可能增強(qiáng)AP對(duì)熱的抵抗力[32],而融合蛋白的AP活性在58 ℃處理10 min后即喪失了超過(guò)30%(圖5a);雖然在加熱10 min后融合蛋白不如單獨(dú)的AP酶活高,但在58 ℃加熱180 min后,單獨(dú)AP的活性損失了80%以上,而融合蛋白的酶活卻可以保留60%以上(圖5b)。這可能是因?yàn)楫?dāng)融合蛋白中的兩個(gè)蛋白分子相互作用時(shí),促進(jìn)了接觸表面上水分子的排出,從而降低了自由能,使蛋白更加折疊并增強(qiáng)了融合蛋白的穩(wěn)定性[33]。

在不同溫度下處理10 min后,單獨(dú)B7的結(jié)合活性保持良好,85 ℃加熱10 min后結(jié)合活性甚至達(dá)到未加熱前的三倍,這種現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與單域抗體的特殊結(jié)構(gòu)有關(guān),短時(shí)間加熱使單域抗體的結(jié)構(gòu)充分伸展,快速冷卻后,單域抗體進(jìn)行重折疊并形成了更利于與抗原結(jié)合的結(jié)構(gòu)[34]。融合蛋白的抗原結(jié)合活性呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì),在58 ℃時(shí)結(jié)合活性達(dá)到最大值,在85 ℃時(shí)可保留50%的活性(圖5c),由于B7-AP融合蛋白在85 ℃處理10 min后僅保留20%的酶活性(圖5a),因此不難推測(cè),加熱處理后B7-AP融合蛋白對(duì)MBSP的抗原結(jié)合能力是顯著升高的,結(jié)果所顯示的活性降低主要受融合蛋白中AP熱變性的影響[23]。更重要的是,即使在58 ℃下處理180 min,B7-AP融合蛋白的整體活性仍幾乎沒(méi)有變化(圖5d),體現(xiàn)出比傳統(tǒng)酶標(biāo)抗體更好的熱穩(wěn)定性和應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

本研究表達(dá)并純化出針對(duì)MBSP的單域抗體—堿性磷酸酶(B7-AP)融合蛋白,并對(duì)融合蛋白的性能和熱穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià),為單域抗體在免疫分析中的應(yīng)用提供了參考。結(jié)果表明,以0.05 mmol/L IPTG為誘導(dǎo)劑,在16 ℃條件下融合蛋白可以實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá),Ni親和純化后蛋白純度可以達(dá)到90%以上,產(chǎn)量為5 mg/L;融合蛋白對(duì)MBSP具有高親和力,且熱穩(wěn)定性極佳,可以作為一種潛在的免疫診斷劑應(yīng)用于ELISA的檢測(cè)過(guò)程中。