基于16SrRNA基因測(cè)序技術(shù)分析痰證糖耐量減低患者的腸道菌群特點(diǎn)*

杜含光 陳霞波 顧穎杰 周 開 張 業(yè) 謝莉莎

1 寧波市中醫(yī)院 浙江 寧波 315010

2 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

糖耐量異常(impaired glucose tolerance，IGT)主要表現(xiàn)為糖耐量減低，此類患者發(fā)生糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于正常人，飲食運(yùn)動(dòng)干預(yù)雖經(jīng)濟(jì)、安全，但臨床不少患者依從性差，腸道菌群調(diào)節(jié)劑逐漸成為防治IGT的新靶點(diǎn)[1-2]。16SrRNA基因是細(xì)菌上編碼rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌的基因組中。本研究擬通過16SrRNA基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)痰證IGT患者與健康人群的腸道菌群，分析腸道菌群基因組成結(jié)構(gòu)及多樣性的差異，探討腸道菌群與IGT痰證的相關(guān)性及規(guī)律，旨在通過保持腸道的菌群平衡來(lái)預(yù)防IGT的發(fā)病，為中醫(yī)藥證候研究提供新的研究思路和方法。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象：40例患者均來(lái)自寧波市中醫(yī)院的IGT患者，經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)且自愿簽署知情同意書。其中男22例，女18例，年齡28～70歲，平均45.16±6.23歲。

1.2 IGT診斷標(biāo)準(zhǔn)：空腹血糖＜7.0mmol/L；葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)即口服75g葡萄糖2h后血糖7.8～11.1mmol/L。（以上為靜脈血漿測(cè)值）

1.3 證素辨證：具體方法參照朱文鋒《證素辨證學(xué)》。以“常見癥狀的辨證意義”為依據(jù)，制定全面、規(guī)范化采集表進(jìn)行證素評(píng)分，確定證素是否存在及輕重程度。如積分＜70分，歸為0級(jí)，說明基本無(wú)病理變化；70分≤積分＜100分，歸為1級(jí)，說明該證素存在輕度病變；100分≤積分＜150分歸為2級(jí)，說明存在中度病變；積分≥150分，歸為3級(jí)，說明存在重度病變。臨床出現(xiàn)的兼夾證分別計(jì)入與之相應(yīng)的證素。

1.4 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合以上診斷標(biāo)準(zhǔn)者；②患者依從性好，配合調(diào)查。

1.5 排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＜30歲或＞70歲；②Ⅰ型、2型糖尿病和妊娠糖尿病者、繼發(fā)性高血壓、繼發(fā)性高脂血癥者；③有嚴(yán)重的心、肝、腎等并發(fā)癥；④精神病者；⑤孕婦及哺乳期婦女⑥半年前有使用抗生素史。

1.6 健康對(duì)照人群：在健康體檢人群中篩選。剔除標(biāo)準(zhǔn)：有糖尿病、高血壓、高血脂、冠心病、腦血管病、惡性腫瘤及慢性感染病史；有明顯的血糖、血脂、血常規(guī)及肝腎功能異常者。

1.7 四診資料采集：根據(jù)《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)·中醫(yī)臨床診療術(shù)語(yǔ)》，制定規(guī)范量表，做到四診資料規(guī)范化。由2名（內(nèi)分泌科主治或主治以上的醫(yī)師）經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)且合格中醫(yī)專業(yè)人員按規(guī)范的方法收集四診資料。

1.8 證的要素提?。罕狙芯恐袣馓撎禎嶙C組是指痰和氣虛的病理積分同時(shí)≥100分者；而非氣虛痰濁證組是指患者可能存在一定程度的痰的病理變化，但尚未構(gòu)成真正意義的痰證，具體地說，即痰和氣虛的病理積分＜100分者。每一癥狀的輕重，以中等程度為準(zhǔn)，若該癥狀重時(shí)，其定量診斷值乘1.5，若該癥狀輕時(shí)，乘0.7。

1.9 糞便樣本DNA抽提和檢測(cè)：樣本中微生物DNA的提取采用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒（QIAGEN，Hilden，Germany）。提取方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA的完整性。

1.10 細(xì)菌16SrDNA序列擴(kuò)增和MiSeq測(cè)序：選取16S rDNA的 V4-V5區(qū)序列進(jìn)行高通量測(cè)序分析。采用兩步PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。將純化的DNA作為模板，利用 16SrDNA V4-V5區(qū)通用引物 515F(5’-GTGCCAGC‐MGCCGCGG-3’)和926R（5’-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3’）PCR擴(kuò)增目的片段16S rDNA V4-V5區(qū)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用t檢驗(yàn)對(duì)不同分組間基本資料進(jìn)行差異分析。分類學(xué)分析采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析。檢測(cè)組間物種顯著豐度差異采用Kruskal-wilcox非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌群物種注釋分析：在97%相似水平下對(duì)OTU進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)聚類，得到579個(gè)OTU，根據(jù)序列繪制聚類韋恩圖，其中痰證組（A1）與健康組（C）標(biāo)本包含的數(shù)目分別為570、385個(gè)，2種標(biāo)本共有的OTU數(shù)目為376個(gè)（圖1）。

圖1 OTU韋恩圖

2.2 菌群結(jié)構(gòu)組成分析：對(duì)兩組研究對(duì)象樣本進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)組成分析，圖2為兩組標(biāo)本分別在門、綱、目、科、屬、種分類等級(jí)的物種相對(duì)豐度柱狀圖。圖3為群落在各分類水平上的Heatmap圖。門水平上IGT痰證患者（A1）與健康人（C）腸道中菌群優(yōu)勢(shì)物種極其相似，痰證組與健康組的優(yōu)勢(shì)菌群中軟壁菌門的相對(duì)豐度差異較大，痰證組軟壁菌門的相對(duì)豐度顯著高于健康組（見圖3A）。綱水平上以擬桿菌綱、梭菌綱、γ-變形菌綱、Nneg‐ativicute為優(yōu)勢(shì)菌群；痰證組（A1）與健康組（C）腸道中優(yōu)勢(shì)菌所占比例不同（圖2B）：痰證組與健康組中梭菌綱、桿狀菌綱、α-變形菌綱、梭桿菌綱的相對(duì)豐度差異明顯，痰證組桿狀菌綱、α-變形菌綱、梭桿菌綱的相對(duì)豐度高于健康組（見圖3B）。圖2C為兩組標(biāo)本分別在目分類等級(jí)的物種相對(duì)豐度柱狀圖，痰證組與健康組中梭菌目、乳桿菌目、梭桿菌目的相對(duì)豐度差異較大，痰證組中梭菌目的相對(duì)豐度明顯低于健康人，乳桿菌目、梭桿菌目的相對(duì)豐度明顯較健康人高（圖3C）?？扑缴咸底C組（A1）與健康組（C）的優(yōu)勢(shì)菌群存在差異，圖2D為兩組標(biāo)本分別在科分類等級(jí)的物種相對(duì)豐度柱狀圖。痰證組與健康組中乳桿菌科、普雷沃氏菌科、梭桿菌科的相對(duì)豐度差異較大，均高于健康組（圖3D）。圖2E為兩組標(biāo)本分別在屬分類等級(jí)的物種相對(duì)豐度柱狀圖，其中乳桿菌屬、普雷沃氏菌屬、梭桿菌屬、腸球菌屬的相對(duì)豐度痰證組較健康組高，雙歧桿菌屬、瘤胃球菌屬、罕見小球菌屬痰證組較健康組低（圖3E）

圖2 IGT痰證組與健康組菌群在各分類水平上的豐度柱狀圖

2.3 菌群物種差異分析：為檢測(cè)兩組微生物群落在各個(gè)分類水平中表現(xiàn)出的豐度差異，并用柱形圖展示出來(lái)（圖3）。在屬水平上，痰證組普雷沃氏菌、梭桿菌的豐度顯著高于健康組，罕見小球菌屬、勞特氏菌屬、副薩特氏等屬的豐度顯著低于健康組（圖3E）；種水平上，痰證組普雷沃氏菌、乳桿菌、加德納菌、韋榮氏球菌豐度顯著高于健康組（圖3F）。

圖3 IGT痰證組與健康組菌群在各分類水平上 Heatmap的圖

2.4 群落多樣性分析：以shannon指數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)腸道微生物的多樣性，shannon指數(shù)越大表明群落多樣性越強(qiáng)，將兩組樣本的shannon指數(shù)通過秩和檢驗(yàn)得出兩組樣本的shannon指數(shù)的P值為0.043，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4），IGT痰證患者腸道菌群群落的多樣性顯著低于健康人。

圖4 痰證組與健康組shannon指數(shù)線箱圖

3 討論

在IGT發(fā)病過程中，胰島素抵抗（insulin resis‐tance，IR）被認(rèn)為是始動(dòng)和中心環(huán)節(jié)。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，腸道微生態(tài)的改變?cè)贗GT和2型糖尿病發(fā)病中起著重要作用。[3-5]本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣本腸道菌群的16S rRNA V4-V5區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析，兩組人群的腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)差別主要體現(xiàn)在某些具體種類的菌群其數(shù)量占比的改變以及相對(duì)豐度的改變。本研究中觀察組的普氏菌相對(duì)豐度明顯要高于對(duì)照組，Ruminococ‐caceae（瘤胃菌）的相對(duì)豐度較正常組顯著下降，既往研究發(fā)現(xiàn)普氏菌與腸道的通透性相關(guān)，具有抵御病原菌防止炎癥的發(fā)生和調(diào)節(jié)血糖的重要作用[6-7]。國(guó)外最新一項(xiàng)研究探討了腸道菌群代謝組與胰島素抗性之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在胰島素抗性個(gè)體中脂多糖和支鏈氨基酸(BCAA)生物合成的潛力增大。這表明，由腸道菌群失調(diào)的血清代謝組變化有可能導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生發(fā)展。普氏菌和普通擬桿菌參與經(jīng)證實(shí)腸道細(xì)菌生物合成BCAA，為了在機(jī)制上測(cè)試腸道細(xì)菌是否真的導(dǎo)致胰島素耐受性，研究人員小鼠喂食人體普氏菌。喂食人體普氏菌的小鼠血中BCAA明顯升高，而且產(chǎn)生胰島素耐受性和葡萄糖不耐受性。研究人員還發(fā)現(xiàn)，瘤胃菌科的微生物家族與血管硬化關(guān)系密切，瘤胃菌的多樣性低，血管硬度水平高[8]。

綜上，我們認(rèn)為痰證是導(dǎo)致代謝綜合征、IGT等多種代謝疾病的一種病理因素，此次研究我們初步推測(cè)，痰證IGT患者普氏菌豐度的增加以及瘤胃菌科豐度值下降，可能是導(dǎo)致IGT痰證的潛在因素。補(bǔ)充和調(diào)節(jié)瘤胃菌、普氏菌的豐度值可能是靶向治療和預(yù)防IGT痰證患者的有效途徑之一，但由于本文中16SrRNA基因測(cè)序技術(shù)的局限性以及納入的研究對(duì)象數(shù)量有限，后續(xù)研究可考慮應(yīng)用宏基因組測(cè)序技術(shù)并增大研究樣本量，找出差異基因，以進(jìn)一步探討普氏菌和瘤胃菌科相互作用于IGT的內(nèi)在機(jī)制。