仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦混養(yǎng)下水體微生物組成和多樣性

關(guān)曉燕，王 擺，蔣經(jīng)偉，田甲申，董 穎，周遵春，王旭達(dá)

( 1.大連海事大學(xué)，環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧省海洋水產(chǎn)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023 )

水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境具有極高細(xì)菌豐度，這些細(xì)菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中發(fā)揮著重要作用[1]，其中有的能夠加速殘留餌料和糞便的分解[2]，有的能夠?qū)⒎请x子氨、亞硝態(tài)氮、硫化氫等有毒的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為低毒性或無毒性的物質(zhì)[3]，有的會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖動(dòng)物死亡[4]等。因此，研究水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境細(xì)菌群落的多樣性和組成結(jié)構(gòu)，在養(yǎng)殖過程中提高養(yǎng)殖效率、減少病害發(fā)生、控制環(huán)境污染等方面均有十分重要的意義。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的研究者開始使用高通量測(cè)序技術(shù)研究水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的不可培養(yǎng)微生物以及環(huán)境微生物的整體組成結(jié)構(gòu)，如凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)生長(zhǎng)過程中腸道菌群的變化規(guī)律、養(yǎng)殖池塘原核和真核微生物的組成及分類學(xué)差異和疾病發(fā)生與其腸道菌群結(jié)構(gòu)的關(guān)系等研究[5-7]。截至目前，針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境細(xì)菌群落的研究依然大多集中在單一養(yǎng)殖物種模式，對(duì)多物種混合養(yǎng)殖系統(tǒng)關(guān)注較少。

遼東灣位于渤海東北部，作為遼河和大凌河的入海口，適宜的氣候條件以及河流帶來的豐富營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)使其成為了發(fā)展海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的絕佳區(qū)域。由于具有環(huán)境友好、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可循環(huán)利用、經(jīng)濟(jì)效益高等特點(diǎn)，多品種的混合養(yǎng)殖目前已經(jīng)成為了遼東灣地區(qū)主要的養(yǎng)殖模式[8]。其中，仿刺參(Apostichopusjaponicus)—中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)—斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)(A.F.P)的混合養(yǎng)殖作為新興的一種養(yǎng)殖模式，在遼東灣地區(qū)得到了大力的發(fā)展和推廣，雖然該養(yǎng)殖模式在水產(chǎn)品產(chǎn)出和經(jīng)濟(jì)效益方面取得了成功，但是對(duì)于這種養(yǎng)殖模式的基礎(chǔ)理論研究，尤其是養(yǎng)殖環(huán)境微生物群落罕有研究。鑒于此，筆者通過高通量測(cè)序手段，分析仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦混合養(yǎng)殖過程中池塘水體細(xì)菌群落組成及其變化規(guī)律，旨在為更好地理解和改進(jìn)該養(yǎng)殖模式提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖池塘情況

試驗(yàn)池塘位于遼寧省遼東灣沿岸某水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，池塘養(yǎng)殖面積約3.33 hm2，養(yǎng)殖期間水深1.5 m。仿刺參采取輪放輪捕方式，每年5月投苗，放苗量525 kg/hm2；每年春季或秋季收獲1次，捕大留小，年產(chǎn)量約750 kg/hm2；中國(guó)明對(duì)蝦放苗時(shí)間為5月中旬，放苗密度為30 000尾/hm2；斑節(jié)對(duì)蝦放苗時(shí)間為5月底，放苗密度為7500尾/hm2。養(yǎng)殖期間不投餌。中國(guó)明對(duì)蝦和斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖進(jìn)行到9月底捕撈收獲，仿刺參養(yǎng)殖繼續(xù)進(jìn)行。

1.2 樣品采集和DNA提取

2018年6—9月，每月15日前后參照水生微生物采集方法[9]采集養(yǎng)殖池塘水體樣本1次，每次固定在池塘的中心采集表面下方10 cm處的水樣5 L，樣品采集后，立即置于冰盒中并于12 h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

1.3 樣品處理與DNA提取

水體樣品運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室之后，立即使用0.22 μm微孔濾膜真空過濾收集其中的細(xì)菌細(xì)胞。將過濾后的濾膜保存在5 mL離心管中，液氮速凍3～5 min，轉(zhuǎn)移至冰箱中-80 ℃保存?zhèn)溆?，接著將濾膜充分剪碎(使樣品表面菌群更好地與裂解液接觸)置于1.5 mL滅菌離心管中，加入裂解液，使其釋放DNA，隨后使用PowerWater?DNA Isolation Kit (MOBIO，USA)按照說明書的步驟提取濾膜上富集細(xì)菌的DNA，提取得到的DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，同時(shí)使用NanoPhotometer?Classic Launched (IMPLEN，GER)測(cè)定其含量和純度，所有提取成功的DNA樣品-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序

應(yīng)用含有Illumina接頭和barcode序列的引物341F-806R[10]擴(kuò)增所有提取DNA樣品中的16S rRNA基因的V3～V4可變區(qū)，所有的PCR反應(yīng)體系均為30 μL，其中包括15 μL的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs)、0.2 μmol/L的引物和1 μL的模板DNA。PCR反應(yīng)過程如下：98 ℃預(yù)變性1 min；之后98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)。用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，使用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, GER)通過切膠回收的方式純化400～450 bp規(guī)格的PCR產(chǎn)物主帶，純化后的PCR產(chǎn)物應(yīng)用NanoPhotometer?Classic Launched (IMPLEN, GER)測(cè)定其含量和純度，之后每一個(gè)樣品對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物根據(jù)其含量進(jìn)行等量混合構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。使用Qubit?2.0 Fluorometer (Thermo Scientific)和Agilent Bioanalyzer 2100 system檢測(cè)文庫(kù)的質(zhì)量，最后應(yīng)用IlluminaHiseq測(cè)序平臺(tái)以PE250 bp策略對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

首先對(duì)測(cè)序得到的原始序列進(jìn)行質(zhì)量控制，去除質(zhì)量得分低于20、含有模糊堿基、引物出現(xiàn)錯(cuò)配或者長(zhǎng)度少于150 bp的序列，剩余的序列根據(jù)barcode識(shí)別其所屬的樣品隨后去除barcode和引物序列。應(yīng)用FLASH軟件[11]將重疊區(qū)域大于10 bp并且沒有任何堿基錯(cuò)配的paired-end序列拼接為tags，使用QIIME軟件[12]對(duì)tags進(jìn)行聚類，相似度大于97%的tags歸屬于同一個(gè)運(yùn)算分類單元(OTU)，應(yīng)用默認(rèn)的參數(shù)從每個(gè)運(yùn)算分類單元中挑選其代表序列，之后使用Ribosomal Database Project (RDP) classifier根據(jù)Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分類學(xué)注釋，最后根據(jù)每一個(gè)運(yùn)算分類單元所包含的序列數(shù)目及其分類學(xué)注釋結(jié)果計(jì)算各樣品細(xì)菌群落中從門至屬水平的組成及其相對(duì)豐度。

1.6 生物信息學(xué)分析

應(yīng)用PAST v3.0軟件[13]計(jì)算各個(gè)樣品細(xì)菌群落的α-多樣性指數(shù)，包括Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)。使用QIIME計(jì)算各樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的加權(quán)Unifrac距離并進(jìn)行非加權(quán)配對(duì)平均法聚類(UPGMA)以評(píng)估各樣品細(xì)菌群落的整體差異。使用R語(yǔ)言平臺(tái)的“ggplot2”軟件包繪制各樣品從門至屬水平主要物種的相對(duì)豐度柱形圖。

2 結(jié) 果

2.1 仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘水體中細(xì)菌群落的分類學(xué)注釋和α-多樣性分析

應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)研究了仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦混養(yǎng)系統(tǒng)完整養(yǎng)殖周期的細(xì)菌群落變化，結(jié)果見圖1。在配對(duì)序列拼接和質(zhì)量控制之后，共得到了191 956條tags用于細(xì)菌群落組成的分析，各樣品tags的數(shù)目為43 228～52 975條，平均每個(gè)水體樣品tags 47 989條。這些測(cè)序得到的tags按照97%的相似性被聚類為運(yùn)算分類單元(每個(gè)運(yùn)算分類單元代表1個(gè)不同的菌屬)，共聚類得到1332個(gè)運(yùn)算分類單元，各樣品運(yùn)算分類單元的數(shù)目為753～1003，平均每個(gè)水體樣品含有882個(gè)運(yùn)算分類單元。根據(jù)每個(gè)運(yùn)算分類單元的代表序列，對(duì)其進(jìn)行了從門至屬水平的分類學(xué)注釋，這些檢測(cè)到的細(xì)菌分別屬于35個(gè)門、70個(gè)綱、110個(gè)目、187個(gè)科和336個(gè)屬。

圖1 仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘水體微生物群落高通量測(cè)序得到的序列數(shù)目和運(yùn)算分類單元數(shù)目Fig.1 Statistics of sequences and OTUs of different samples in the polyculture of sea cucumber with Chinese shrimp and tiger shrimp, A.F.P. systemPJ3w. Jun, PJ3w. July, PJ3w. Aug, PJ3w. Sep分別指6、7、8、9月采集的仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘水樣，下同.PJ3w refers to the water samples from the A.F.P. polyculture system, and Jun, Jul, Aug, and Sep refer to the sampling time, respectively.

仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘水體樣品細(xì)菌群落的α-多樣性指數(shù)結(jié)果見表1。在計(jì)算得到的α-多樣性指數(shù)中，Chao1和ACE用于評(píng)估樣品細(xì)菌群落的物種豐富度，而Shannon和Simpson用于評(píng)價(jià)細(xì)菌群落的多樣性。物種豐富度是指細(xì)菌群落中含有多少種細(xì)菌，其并不計(jì)算各個(gè)細(xì)菌在群落中所占的比例[14]，多樣性指數(shù)在計(jì)算的過程中同時(shí)考慮了物種的豐富度和各細(xì)菌在群落中的豐度[15]。無論是豐富度還是多樣性指數(shù)，6月和7月的水體樣本均低于8月和9月，即養(yǎng)殖后半段(8—9月)的池塘水體具有更高的細(xì)菌種類和更均一的細(xì)菌豐度分布。

表1 仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦混養(yǎng)池塘水體微生物群落α-多樣性指數(shù)表Tab.1 α-diversity indices of microbial communities in water in the A.F.P. polyculture system

2.2 仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化

2.2.1 仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)聚類和主要門水平微生物相對(duì)豐度

通過基于加權(quán)Unifrac距離的UPGMA聚類評(píng)估了不同時(shí)間樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的整體差異，結(jié)果見圖2。試驗(yàn)結(jié)果表明，養(yǎng)殖前半段(6—7月)樣品的細(xì)菌群落聚為一類，而養(yǎng)殖后半段(8—9月)樣品的細(xì)菌群落聚為另外一類，這與α-多樣性指數(shù)的結(jié)果相同，說明養(yǎng)殖前半段和養(yǎng)殖后半段池塘水體細(xì)菌群落具有明顯的差異。

此外，仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中主要細(xì)菌為變形菌門 (51.5%)，其次為放線菌門(23.6%)、擬桿菌門(11.3%)和厚壁菌門(9.1%)。養(yǎng)殖前半段水環(huán)境中變形菌門的豐度要明顯高于養(yǎng)殖后半段，在6—7月樣品中變形菌門的豐度分別為57.7%和61.9%，而在8—9月樣品中則降至47.3%和39.2%。放線菌門在仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦池塘水體中的豐度僅次于變形菌門，其在6月至9月的樣品中，豐度依次為21.9%、15.1%、26.6%和30.8%，呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)。擬桿菌門是豐度排名第3的細(xì)菌門，在6月至9月的樣品中，其豐度分別為12.0%、14.9%、8.9%和9.5%，與放線菌門相反，擬桿菌門的豐度呈先升高后降低的趨勢(shì)。此外，在養(yǎng)殖后半段的水體中，厚壁菌門的豐度明顯高于養(yǎng)殖前半段，其豐度由6月至9月依次為5.4%、5.3%、11.1%和14.6%。

圖2 仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)UPGMA聚類(左)和主要門水平微生物相對(duì)豐度(右)Fig.2 UPGMA cluster (left) and relative abundance of bacteria at phylum level (right) in water in A.F.P. polyculture

2.2.2 仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中細(xì)菌群落主要綱水平微生物相對(duì)豐度

對(duì)仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦池塘水體綱水平微生物相對(duì)豐度進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。試驗(yàn)結(jié)果表明，α-變形菌綱和γ-變形菌綱是變形菌門的主要組成成分，養(yǎng)殖前半段α-變形菌綱的豐度較高，其在6月和7月樣品中的豐度分別為30.0%和40.5%，而在8月和9月樣品中則只有23.9%和24.7%，這也是變形菌門養(yǎng)殖前半段豐度較高的原因。γ-變形菌綱與α-變形菌綱不同，其在9月的水體中豐度最低，只有10.0%，而在其余時(shí)間的樣品中豐度為18.4%～22.3%。放線菌門中酸微菌綱在養(yǎng)殖后半段豐度突然上升，從6月和7月的1.9%與2.1%上升至8月和9月的13.4%與18.2%。擬桿菌門中黃桿菌綱的豐度從6月樣品中的8.1%降至其他時(shí)間樣品中的約3%，而7月樣品中1種未被鑒定的擬桿菌綱富集(9.9%，其他時(shí)間只有1.2%～2.9%)，二者共同造成了擬桿菌門豐度前高后低的變化規(guī)律。

圖3 仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中細(xì)菌群落主要綱水平微生物相對(duì)豐度Fig.3 The relative abundance of bacteria at class level in water in A.F.P. polyculture

2.2.3 仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中細(xì)菌群落主要屬水平微生物相對(duì)豐度

對(duì)仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中細(xì)菌群落主要屬水平微生物相對(duì)豐度進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果見圖4。試驗(yàn)結(jié)果表明，α-變形菌綱中豐度最高的屬為遠(yuǎn)洋桿菌屬(Pelagibacter)，其在7月樣品中所占的豐度明顯高于其他時(shí)間(7月樣品為23.0%，其余時(shí)間僅約為10%)。養(yǎng)殖前3個(gè)月γ-變形菌綱的豐度較高，但不同時(shí)間水體中γ-變形菌綱的組成并不相同，6月樣品中的γ-變形菌綱主要是Halioqlobus，其豐度為7.7%，而在其余時(shí)間只有不到1%；7月樣品中的γ-變形菌綱主要為假交替單胞菌(Pseudoalteromonas)，其豐度為7.8%，在其余時(shí)間只占0.1%～1.3%；8月樣品中的γ-變形菌綱主要為假單胞菌(Pseudomonas)和不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)，豐度分別為4.5%和4.0%，而這2種細(xì)菌在其余時(shí)間樣品中均未檢出。

圖4 仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中細(xì)菌群落主要屬水平微生物相對(duì)豐度Fig.4 The relative abundance of bacteria at genus level in water in A.F.P. polyculture

3 討 論

3.1 不同養(yǎng)殖品種混養(yǎng)水體中微生物群落組成和多樣性差異

近年來，不同養(yǎng)殖品種混養(yǎng)水體中微生物群落的組成成分的研究已有較多報(bào)道。Li等[16]測(cè)定了江蘇省連云港市沿海地區(qū)對(duì)蝦、螃蟹和貝類混養(yǎng)池塘水體中微生物群落組成，證實(shí)該養(yǎng)殖模式中主要微生物依次為變形菌門、綠彎菌門、放線菌門、厚壁菌門和酸桿菌門；林玉榮等[17]測(cè)定了福建省莆田市海水蝦蛤混養(yǎng)池塘水體中微生物群落組成，結(jié)果顯示，該養(yǎng)殖模式中以放線菌門、變形菌門和擬桿菌門為主；Zhao等[18]分析了遼東灣沿海斑節(jié)對(duì)蝦、海蜇(Rhopilemaesculenta)和菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)養(yǎng)殖池塘水體微生物群落組成，發(fā)現(xiàn)變形菌門、放線菌門、酸桿菌門和嗜熱菌門是占優(yōu)勢(shì)地位的微生物；Gao等[19]在遼東灣另一種中國(guó)明對(duì)蝦、海蜇、縊蟶(Sinonovaculaconstricta)混養(yǎng)池塘的水體微生物群落中測(cè)定發(fā)現(xiàn)，豐度排名前三的微生物分別為變形菌門、放線菌門和擬桿菌門。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦混養(yǎng)水體的微生物群落組成中，主要的微生物依次為變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和厚壁菌門。上述研究表明，在不同的水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，變形菌門均為豐度最高的微生物，但其他微生物的種類和豐度會(huì)受到養(yǎng)殖物種、養(yǎng)殖操作方式以及養(yǎng)殖地域等因素的影響，從而導(dǎo)致不同養(yǎng)殖系統(tǒng)中微生物群落的組成結(jié)構(gòu)各不相同。

此外，在仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦混養(yǎng)水體中，微生物群落聚為兩類，養(yǎng)殖前半段和養(yǎng)殖后半段的微生物群落組成結(jié)構(gòu)和物種豐富度及多樣性具有明顯差異。本試驗(yàn)前期針對(duì)遼東灣地區(qū)斑節(jié)對(duì)蝦—海蜇—菲律賓蛤仔混養(yǎng)進(jìn)行了研究[18]，該養(yǎng)殖模式與仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦類似，均是在每年5月底投放蝦苗直至9月收獲，該養(yǎng)殖模式水體微生物群落的多樣性和組成結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律與本研究不同，在斑節(jié)對(duì)蝦—海蜇—菲律賓蛤仔養(yǎng)殖模式中，不同時(shí)間水體微生物群落的組成結(jié)構(gòu)各不相同，同時(shí)，其水體微生物群落的豐富度和多樣性指數(shù)沒有明顯的養(yǎng)殖時(shí)間特征，其豐富度指數(shù)在養(yǎng)殖過程中沒有明顯變化，多樣性指數(shù)也只是在8月有所提升。以上研究結(jié)果表明，養(yǎng)殖池塘內(nèi)的微生物群落組成及其變化規(guī)律，具有養(yǎng)殖品種特異性。

3.2 仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖模式微生物群落組成參與控制水體富營(yíng)養(yǎng)化

在海水池塘養(yǎng)殖過程中，養(yǎng)殖水體的富營(yíng)養(yǎng)化以及藻類的大量繁殖可能對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物的生存造成威脅。在仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦混養(yǎng)水體中，遠(yuǎn)洋桿菌屬是豐度最高的微生物屬。據(jù)報(bào)道，遠(yuǎn)洋桿菌是海洋環(huán)境中一種常見的典型貧營(yíng)養(yǎng)微生物，主要生活在低營(yíng)養(yǎng)水平的環(huán)境中，以溶解性的有機(jī)碳和有機(jī)氮為底物進(jìn)行生長(zhǎng)和繁殖[20-21]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在養(yǎng)殖進(jìn)行到7月時(shí)，仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦混養(yǎng)水體中遠(yuǎn)洋桿菌的豐度達(dá)到了峰值，預(yù)示著此時(shí)養(yǎng)殖水體中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量可能較低。此外，假交替單胞菌在仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖進(jìn)行到7月時(shí)也出現(xiàn)了明顯的富集。眾所周知，假交替單胞菌主要附著于高等真核生物，尤其是藻類等海洋植物表面[22]，能夠分泌胞外酶、毒素、抗生素、多糖等多種胞外生物活性物質(zhì)，抑制藻類孢子萌發(fā)、降解藻類細(xì)胞、分解植物多糖[23]，因此，假交替單胞菌在仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘內(nèi)的富集同樣有助于過量藻類的降解。Aquiluna是一種含有肌動(dòng)蛋白的光能異養(yǎng)型微生物，有研究檢測(cè)到在藻類大量暴發(fā)的水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中，通常也伴隨著Aquiluna豐度的明顯上升[24]。在仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中，其水體微生物群落中Aquiluna的豐度呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)，這一結(jié)果也間接表明了仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘中的微生物群落組成能夠有效地抑制藻類的大量繁殖。然而，需要說明的是，雖然從仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中水體微生物群落的變化能夠推測(cè)到養(yǎng)殖過程中富營(yíng)養(yǎng)化相關(guān)的信息，但是由于仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦混養(yǎng)是一種新興的養(yǎng)殖模式，目前關(guān)于該養(yǎng)殖模式的相關(guān)研究非常有限，尚未見有關(guān)于養(yǎng)殖過程中池塘水環(huán)境營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及藻類水平的相關(guān)報(bào)道，有待于后續(xù)針對(duì)仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖模式進(jìn)行更為深入和全面的研究。

3.3 仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖模式微生物群落參與水質(zhì)凈化過程

假單胞菌具有很強(qiáng)的有機(jī)物分解和轉(zhuǎn)化能力，因此其在環(huán)境污染生物修復(fù)中的應(yīng)用已成為近年來的研究熱點(diǎn)問題[25-26]。例如，銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)YY24可以提高凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中的存活率和質(zhì)量增加率，同時(shí)還能夠凈化水質(zhì)，提高水體pH，降低氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮的含量[27]。銅綠假單胞菌OP2能夠分解不溶于水的含磷物質(zhì)，使其成為可溶性磷，更加便于養(yǎng)殖動(dòng)物吸收，還能有效去除水體中殘留的氨氮和亞硝態(tài)氮[28]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖后期，水體中假單胞菌屬豐度的上升，可能有利于養(yǎng)殖動(dòng)物的存活和生長(zhǎng)及凈化水質(zhì)。

此外，梭狀芽孢桿菌(Clostridium)的豐度在仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖后半段出現(xiàn)了明顯富集。據(jù)報(bào)道，丁酸梭狀芽孢桿菌(C.butyricum)可以有效地幫助日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)抵抗亞硝態(tài)氮所造成的壓力，同時(shí)能夠明顯提升其超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性[29]，這預(yù)示著仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中的梭狀芽孢桿菌可能有助于提升養(yǎng)殖對(duì)蝦抵抗亞硝態(tài)氮的能力，保證養(yǎng)殖后半段對(duì)蝦健康快速生長(zhǎng)。

除了梭狀芽孢桿菌，在仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦模式養(yǎng)殖后半段微酸菌綱豐度出現(xiàn)了明顯的上升，水環(huán)境中微酸菌綱的分布及其豐度要明顯高于其他環(huán)境介質(zhì)[30]。有研究發(fā)現(xiàn)，部分微酸菌綱的微生物在重金屬污染的酸性環(huán)境中大量繁殖，并且參與利用鐵離子還原介導(dǎo)的氨氧化過程[31]。這說明在仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖后半段富集的微酸菌綱可能與假單胞菌共同參與水環(huán)境中氨氮的轉(zhuǎn)化過程，對(duì)于去除養(yǎng)殖池塘內(nèi)過量的氮、凈化水體、提高養(yǎng)殖物種存活率具有十分重要的意義。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)通過16S rRNA擴(kuò)增子的高通量測(cè)序考察了仿刺參—中國(guó)明對(duì)蝦—斑節(jié)對(duì)蝦混合養(yǎng)殖池塘水體細(xì)菌群落的多樣性及豐度變化，發(fā)現(xiàn)其中主要的細(xì)菌為變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、和厚壁菌門。養(yǎng)殖前半段和后半段池塘水體細(xì)菌群落具有明顯的差異。后半段，池塘水體微生物群落的豐富度和多樣性均出現(xiàn)了明顯的上升；變形菌門的豐度和擬桿菌門的豐度在養(yǎng)殖前半段要明顯高于養(yǎng)殖后半段，放線菌門的豐度呈先降后升的趨勢(shì)，而厚壁菌門在養(yǎng)殖后半段的豐度要明顯高于養(yǎng)殖前半段。