豬肺炎支原體山西株的分離與鑒定

張欣榮，岳偉東，張警文，任高雅，孫 錚，岳美杉，劉怡慧，范小瑞，賀俊平

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

豬支原體肺炎（Mycoplasma pneumonia ofswine，MPS）俗稱豬氣喘病[1]，是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）引起的慢性消耗性呼吸道傳染病。豬被感染后呼吸系統(tǒng)免疫力下降，會(huì)繼發(fā)感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬圓環(huán)病毒 2 型（Porcine circovirus type 2，PCV2）或豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）[2]，豬的出欄率、生長率和飼料轉(zhuǎn)化率降低，大大影響?zhàn)B豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。目前，主要通過飼料飲水添加抗生素來控制豬肺炎支原體對呼吸道的感染，但抗生素使用不當(dāng)會(huì)使多種病原產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)會(huì)存在獸藥殘留問題，導(dǎo)致豬肉品質(zhì)降低[3]。病豬康復(fù)后可以產(chǎn)生自身免疫保護(hù)力，提示治療MPS 有效的措施是注射疫苗[4]，但目前國內(nèi)市場上的滅活疫苗均是進(jìn)口疫苗，其與山西地方病原存在差異，而且滅活疫苗以體液免疫為主，免疫效力較低，需多次注射才能產(chǎn)生預(yù)期的保護(hù)效果[5]，而多次注射又會(huì)增加養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)成本，免疫所產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)效益還需考慮[6]。國產(chǎn)疫苗168 弱毒苗“支必寧”使用范圍最廣，但其對一些支原體敏感的豬品種不適用[7]，因?yàn)槠湓季陙碜蕴i中的二臉花豬，可能存在地域局限并不適用于對北方地方菌株的治療。Mhp 在全國各地區(qū)均為高感染率，而山西地區(qū)感染較為嚴(yán)重。在對新疆北部地區(qū)16 個(gè)規(guī)?；i場的456 份豬血清樣品中檢測出Mhp 抗體陽性率為50.4%，感染陽性率為68.75%[8]。對山東地區(qū)豬支原體流行性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)Mhp 抗體檢測陽性率為56.48%[9]。對山西境內(nèi)非免疫豬群抽檢發(fā)現(xiàn)，豬肺炎支原體血清抗體陽性率為36.5%以上[10]，在山西省太原和晉中2 個(gè)區(qū)域7 個(gè)200 頭基礎(chǔ)母豬規(guī)模以上的豬場，發(fā)現(xiàn)各豬場母豬血清陽性率高達(dá)100%[11]。Mhp 有組織嗜性，能在活體豬肺中長期滯留，難以根除[12]。目前，缺乏山西豬肺炎支原體地方株有效菌株信息和相關(guān)病原學(xué)研究。

本研究對豬肺炎支原體山西地方株進(jìn)行分離與鑒定，在晉中市進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，并采集病料，從采集到具有典型病理特征的肺臟中分離出豬肺炎支原體山西地方株，以期補(bǔ)充豬肺炎支原體山西地方株的菌株信息，同時(shí)為后續(xù)相關(guān)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)和方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集 2019 年在晉中市各豬場進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，并進(jìn)行PCR 鑒定。隨機(jī)抽取出現(xiàn)咳嗽、氣喘、腹式呼吸等典型豬支原體肺炎臨床癥狀的豬，病理解剖呈“蝦肉樣”、“胰樣”，經(jīng) PCR 鑒定患有豬支原體肺炎的豬肺臟，其中，一部分放到Bouin's 液中固定，一部分放入液氮中保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 豬肺炎支原體168 活疫苗（乾元浩生物股份有限公司），KM2 培養(yǎng)基（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院），支原體固體平板培養(yǎng)基及輔助液（北京中海生物科技有限公司），細(xì)菌基因組提取試劑盒（天根生化科技(北京)有限公司），2×PCR Mix（康為世紀(jì)生物科技有限公司）和DNA Marker（中科瑞泰（北京）生物科技有限公司），孔徑為0.22 μm和 0.45 μm 的濾菌器（美國 Millipore），瑞氏染色液（北京索萊寶科技有限公司），組織基因組提取試劑盒（北京聚合美生物科技有限公司），石蠟（上海華申康復(fù)器材有限公司）。

組織包埋機(jī)（浙江省益迪醫(yī)療設(shè)備廠），切片機(jī)（浙江省益迪醫(yī)療設(shè)備廠），展片機(jī)（浙江省益迪醫(yī)療設(shè)備廠），烤片機(jī)（浙江省益迪醫(yī)療設(shè)備廠），光學(xué)顯微鏡（德國 Leica），PCR 儀（美國 Bio-RAD）。

1.2 方法

1.2.1 臨床癥狀與組織病理變化觀察 將具有典型臨床癥狀的豬剖殺，取其肺組織進(jìn)行PCR 鑒定，為陽性的肺組織經(jīng)Bouin's 液固定后制作石蠟切片（厚度為6 μm），肺組織切片通過HE 染色觀察組織病理變化。

1.2.2 病原體分離 其按照參考文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。無菌采集肺臟病健交界處組織1～2 g，剪成米粒大小，放入KM2 液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)；對培養(yǎng)基變色明顯的進(jìn)行PCR 檢測，陽性結(jié)果立即傳代，陰性結(jié)果放棄培養(yǎng)，待其生長滴度穩(wěn)定后接種至固體培養(yǎng)基上。

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察 將固體平板培養(yǎng)基置于倒置顯微鏡下，觀察菌落的形態(tài)，取液體培養(yǎng)物12 000 g離心5 min，將沉淀物制成涂片進(jìn)行瑞氏染色。

1.2.4 生化特性鑒定 將臨床分離株進(jìn)行尿素酶活性測定、葡萄糖水解試驗(yàn)、精氨酸水解試驗(yàn)、七葉苷水解試驗(yàn)、甘露醇分解試驗(yàn)，生化試驗(yàn)按參考文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行。

1.2.5 分離株P(guān)CR 鑒定

1.2.5.1 16S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中Mhp 16S rRNA 基因的保守序列設(shè)計(jì)1 對特異性引物 F：5′-GGGTGAGTAACACGTACCTAAC-3′，R：5′-ACCGCGGCTGCTGGCACATAGT-3′。預(yù)期擴(kuò)增片段436 bp，擴(kuò)增體系為：2×Taq PCR Master Mix 5 μL，上游引物（10 μmol/L）0.4 μL，下游引物（10 μmol/L）0.4 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 3.2 μL，總體系 10 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共 30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min，4 ℃保存。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.5.2 P36 基因 PCR 擴(kuò)增 根據(jù) GenBank 中報(bào)道的P36 全基因序列設(shè)計(jì)2 條擴(kuò)增引物P1：5′-TT AGTGTCTCCCGTTATG-3′，P2：5′-GAAATCCGTAT TCTCCTC-3′。預(yù)期擴(kuò)增大小為 621 bp，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2×Taq PCR MasterMix 5 μL，引物 P1（10 μmol/L）0.4 μL，引物 P2（10 μmol/L）0.4 μL，DNA 模板 1.5 μL，ddH2O 2.7 μL，總體系 10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃8 min，4 ℃保存。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.6 菌落PCR 鑒定 用槍頭蘸取數(shù)個(gè)平板培養(yǎng)基上的支原體菌落，代替1.2.5.2 反應(yīng)體系中的DNA 提取物進(jìn)行菌落P36 基因PCR 擴(kuò)增，其中，ddH2O 用量改為7 μL，反應(yīng)條件同1.2.5.2。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.7 測序及序列分析 將電泳產(chǎn)物送至華大公司進(jìn)行測序，并同GeneBank 和現(xiàn)有的其他菌種進(jìn)行序列同源性分析和比對，利用MEGA 5.2 軟件對其進(jìn)行分子進(jìn)化上的親緣關(guān)系分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織病理變化結(jié)果

病豬體型消瘦，出現(xiàn)明顯的腹式呼吸，被毛粗亂，精神沉郁，生長發(fā)育遲緩，消瘦少食（圖1）；剖殺后眼觀病肺兩側(cè)有不同程度腫大，病健界限明顯，病變部位組織對稱性實(shí)變，實(shí)變區(qū)大小不一，呈斑塊形分布，質(zhì)度硬實(shí)，缺乏彈性，呈典型的“蝦肉樣變”（圖2）；鏡檢可見細(xì)支氣管周圍大量淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞浸潤，形成“管套”，管腔內(nèi)纖毛脫落，有大量的炎性細(xì)胞和脫落的上皮細(xì)胞，肺泡腔可見巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、脫落的肺泡上皮細(xì)胞和少量的漿液，肺泡隔因增生，炎性浸潤而增厚，呈典型的間質(zhì)性肺炎特征。病肺組織損傷程度提示豬肺中的豬肺炎支原體毒力較強(qiáng)，嚴(yán)重影響豬的呼吸功能（圖3）。

2.2 分離培養(yǎng)結(jié)果

培養(yǎng)基在3～5 d 后由紅色變?yōu)榈S色，提示變色后的培養(yǎng)物中含有豬肺炎支原體。變色后液體培養(yǎng)基顏色由紅色變?yōu)榈S色，培養(yǎng)液澄清透亮，無沉淀，不渾濁，提示培養(yǎng)基中含有豬肺炎支原體、且無雜菌污染（圖4）。

2.3 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

固體培養(yǎng)基上可見多數(shù)呈圓形以及中間暗、邊緣光滑的菌落（圖5），與支原體菌落相符。液體培養(yǎng)物涂片用瑞氏染色后，經(jīng)油鏡觀察到點(diǎn)狀、兩極狀等大小在0.2 μm 左右的菌體（圖6），與支原體大小相符。

2.4 生化特性分析

本試驗(yàn)的分離菌株生化特性符合支原體特性，與標(biāo)準(zhǔn)菌株168 相同，提示分離株為豬肺炎支原體（表 1）。

表1 分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果

2.5 PCR 鑒定結(jié)果

16S rRNA PCR 擴(kuò)增結(jié)果提示，分離物中含有支原體；1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)菌株168 基因擴(kuò)增出與預(yù)計(jì)大小一致的片段，證明該引物有效，同時(shí)分離株基因擴(kuò)增出的條帶大小與陽性對照 168 株一致（圖 7）。

物種特異性P36 基因擴(kuò)增結(jié)果提示，培養(yǎng)物中含有豬肺炎支原體，培養(yǎng)物基因擴(kuò)增出與預(yù)計(jì)大小一致的特異性條帶，與陽性對照一致（圖8）。

2.6 序列比對結(jié)果

測序結(jié)果通過與GenBank 中登錄的168 株（中國江蘇）、168-L 株（中國江蘇）、NCTC10127 株（瑞士）、J 株（巴西）、F7.2C 株（比利時(shí)）、7422 株（巴西）、7448 株（巴西）進(jìn)行比對，使用 MEGA 5.2 構(gòu)建NJ（Neighbor Jioning）樹，采用 Bootstrap 檢驗(yàn)方法，重復(fù)次數(shù)為1 000，得到進(jìn)化樹如圖9 所示，該分離株與J 株、NCTC10127 株同源性較高，從分子水平上證明了分離株為豬肺炎支原體。

3 結(jié)論與討論

本研究從豬支原體肺炎典型病理特征的豬肺中通過液體培養(yǎng)基盲傳培養(yǎng)獲得1 株支原體，瑞氏染色結(jié)果顯示，該菌株大小在0.2 μm 左右，菌落形態(tài)呈典型的“煎蛋樣”，邊緣光滑。P36 基因PCR 測序結(jié)果與 168 株（中國江蘇）、168-L 株（中國江蘇）、NCTC10127 株（瑞士）、J 株（巴西）、F7.2C 株（比利時(shí)）、7422 株（巴西）、7448 株（巴西）進(jìn)行比對，確認(rèn)分離的支原體菌株為豬肺炎支原體，命名為JZ01 株。

本研究開展普查時(shí)對具有消瘦、氣喘、明顯的腹式呼吸、食欲不振等臨床癥狀的豬群中體型偏小的“僵豬”進(jìn)行剖殺，選取經(jīng)PCR 鑒定為陽性及病理組織學(xué)檢查為間質(zhì)性肺炎的肺臟作為病料來源，在培養(yǎng)的過程中，3～5 d 培養(yǎng)基顏色變黃。培養(yǎng)基中的酚紅起到指示劑的作用，培養(yǎng)液由紅色變?yōu)榈S色，其可作為觀察有無支原體生長的一種直觀簡便的方法[15]。由于臨床病肺中含有多種病原，Mhp 對生長環(huán)境要求苛刻，生長速度慢，在分離過程中不屬于生長優(yōu)勢菌極易被其他雜菌干擾，研磨后的濾液通過0.45 μm 濾器，但仍有部分細(xì)菌可透過濾膜[16]。本試驗(yàn)采用多點(diǎn)取樣，用液體培養(yǎng)基連續(xù)盲傳的方法，培養(yǎng)液通過0.22 μm 濾器過濾不但能使分離株適應(yīng)人工培養(yǎng)，而且能達(dá)到富集的目的，并利用物理方法有效去除細(xì)菌性病原。

16S rRNA 是所有原核生物蛋白質(zhì)合成必需的核糖體RNA，可以用來標(biāo)志生物的進(jìn)化距離和親緣關(guān)系，其具有高度穩(wěn)定的保守區(qū)和可變區(qū)，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物可以有效區(qū)別豬肺炎支原體和其他細(xì)菌[17]。本研究使用16S rRNA 保守序列設(shè)計(jì)引物對分離株的基因進(jìn)行擴(kuò)增，確認(rèn)了分離菌株為支原體。

P36 基因控制Mhp 產(chǎn)生乳酸脫氫酶，其表面存在種屬特異性抗原決定簇，因此，P36 蛋白產(chǎn)生的抗體也具有種屬特異性[18]，采用Mhp 的P36 基因設(shè)計(jì)引物對豬肺炎支原體J 株、豬鼻支原體、絮狀支原體和雞毒支原體進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，只有豬肺炎支原體被擴(kuò)增出來[10]，Mhp 感染后產(chǎn)生針對P36蛋白特異的抗體，與其他支原體無交叉反應(yīng)[19]，提示P36 基因用于區(qū)分Mhp 和其他病原微生物具有高度的特異性。P36 基因PCR 擴(kuò)增在檢測典型豬支原體肺炎的病變肺臟中陽性率為100%，檢測豬氣管拭子敏感性為100%，特異性為93.3%[15]。本研究使用P36 基因序列設(shè)計(jì)引物對分離株的基因進(jìn)行擴(kuò)增，確認(rèn)了分離株為豬肺炎支原體；通過對P36基因PCR 陽性產(chǎn)物測序并與NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫登錄的豬肺炎支原體菌株進(jìn)行序列比對，結(jié)果顯示，JZ01 株與J 株同源性較高但存在差異，提示目前豬肺炎支原體山西地方株發(fā)生變異，已對豬支原體肺炎滅活疫苗（J 株）產(chǎn)生免疫耐受性，滅活疫苗（J 株）無法提供全面的免疫保護(hù)。同時(shí)JZ01 株與國外致病株7448 株、7422 株的同源性比與國內(nèi)168株高，提示JZ01 株可能由國外毒株進(jìn)化而來，豬場在引進(jìn)豬群時(shí)要提高檢測水平，自繁自養(yǎng)是凈化豬肺炎支原體的有效策略[20]。P36 基因序列含有大量的腺嘌呤和胸腺嘧啶，測序結(jié)果的突變堿基以A 和T 為主，堿基A、T 可能影響JZ01 株的毒力大小。

綜上所述，本試驗(yàn)從最近發(fā)病的豬場成功分離到豬肺炎支原體山西地方株JZ01 株，一定程度上補(bǔ)充了山西地方株的菌株信息，并為深入研究豬肺炎支原體的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。