PCR-DGGE技術(shù)分析不同包裝條件下魚肉表面優(yōu)勢(shì)菌的菌群變化

涂宗財(cái)，馬 達(dá)，王 輝，石 燕，沙小梅，黃小琴

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.江西師范大學(xué) 功能有機(jī)小分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330022）

PCR-DGGE技術(shù)分析不同包裝條件下魚肉表面優(yōu)勢(shì)菌的菌群變化

涂宗財(cái)1,2，馬 達(dá)1，王 輝1，石 燕1，沙小梅1，黃小琴2

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.江西師范大學(xué) 功能有機(jī)小分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330022）

采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-deformation gradient gel electrophoresis analysis，PCR-DGGE）技術(shù)研究3 種包裝（空氣、真空、氣調(diào)）結(jié)合鈷60輻照技術(shù)對(duì)魚肉表面優(yōu)勢(shì)菌菌群的影響，分別選擇6 種輻照劑量（0、2、4、6、8、10 kGy）照射4 ℃貯藏18 d后的魚肉表面優(yōu)勢(shì)腐敗菌群進(jìn)行研究。方法：采集第18天不同包裝不同劑量的草魚肉樣品，洗脫魚肉表面菌；提取DNA，擴(kuò)增16S rDNA的V3可變區(qū)，用PCRDG GE技術(shù)鑒定優(yōu)勢(shì)菌，割膠回收測(cè)序。結(jié)果表明：不同包裝魚肉表面優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)量和種類不同，在樣品中共同的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為假單胞菌，在空氣包裝中優(yōu)勢(shì)腐敗菌是假單胞菌、乳酸菌和沙雷菌，沙雷菌在輻照劑量高于8 kGy時(shí)被抑制。在真空包裝中優(yōu)勢(shì)腐敗菌是假單胞菌、沙雷菌、熱死環(huán)絲菌和耶爾森菌，沙雷菌輻照劑量高于6 kGy時(shí)被抑制，而耶爾森菌在2 kGy以上即被抑制，熱死環(huán)絲菌在6、8 kGy輻照條件下才出現(xiàn)，其具有很高的輻照抗性。在氣調(diào)包裝中優(yōu)勢(shì)腐敗菌是假單胞菌和乳酸菌，但乳酸菌僅在氣調(diào)包裝2 kGy輻照和氣調(diào)包裝8 kGy兩種輻照包裝條件下是優(yōu)勢(shì)腐敗菌。結(jié)果表明，PCR-DGGE技術(shù)可以很好地鑒別魚肉表面優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

草魚；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳；微生物；優(yōu)勢(shì)菌群；氣調(diào)包裝；輻照

魚類食物難以保存，極易受各種理化因素、微生物等影響而發(fā)生腐敗，研究表明凍結(jié)溫度以上的細(xì)菌活動(dòng)是引起魚類腐敗變質(zhì)的主要原因之一[1]。在適宜環(huán)境下，能在魚肉表面大量繁殖、并在種間競(jìng)爭(zhēng)中占優(yōu)勢(shì)的菌種即是優(yōu)勢(shì)菌種[2]。研究魚類優(yōu)勢(shì)腐敗菌生長(zhǎng)和繁殖規(guī)律、探究細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)變化并采取相應(yīng)有效抑制細(xì)菌增殖的保鮮和貯藏方式，對(duì)捕撈、加工、貯藏、運(yùn)輸、銷售過程中魚類產(chǎn)品品質(zhì)的保障和貨架期的延長(zhǎng)至關(guān)重要。常用的保鮮技術(shù)包括低溫保鮮、氣調(diào)保鮮、冰溫氣調(diào)保鮮、輻照保藏、化學(xué)保鮮等[3]，尤其是輻照保藏技術(shù)，因其具備降低食品病原體污染和保留食品完好風(fēng)味的 雙重優(yōu)點(diǎn)而廣受青睞，成為重要的保藏手段。氣調(diào)包裝（modified atmosphere packaging，MAP）保鮮技術(shù)是用一種或幾種氣體代替食品包裝袋內(nèi)的空氣，從而抑制產(chǎn)品腐敗、延長(zhǎng)食品保鮮期的一種新型保鮮技術(shù)[2]。在國(guó)內(nèi)外MAP技術(shù)已經(jīng)被開發(fā)用于生鮮肉、水產(chǎn)品、凝乳、鮮奶酪、果蔬和即食食品的保藏[4]。在我國(guó)，水產(chǎn)品氣調(diào)保鮮包裝在商業(yè)上的應(yīng)用仍處于研究和起步階段。結(jié)果表明MAP與低溫結(jié)合可以顯著地延長(zhǎng)水產(chǎn)品的貨架期，而且MAP對(duì)水產(chǎn)品的保鮮效果優(yōu)于相同條件下的空氣包裝和真空包裝[5]。

監(jiān)測(cè)魚肉表面優(yōu)勢(shì)腐敗菌的方法有傳統(tǒng)培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒別法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-deformation gradient gel electrophoresis analysis，PCR-DGGE）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-溫度梯度凝膠電泳等[3,6]。在分子生物技術(shù)出現(xiàn)之前，人們了解魚肉表面腐敗微生物主要依靠純培養(yǎng)的方法。由于這些方法過于簡(jiǎn)單和表面化，無(wú)法提供全面有效的信息。魚肉的加工、貯藏、運(yùn)輸過程中的溫度不同，以及微生物需氧/好氧、適冷/適熱、革蘭氏陰性/革蘭氏陽(yáng)性、共生寄生等復(fù)雜因素影響，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式很難滿足魚肉貯藏過程中優(yōu)勢(shì)腐敗菌的鑒定，這給深入了解魚肉貯藏微生物的種類、特性等造成了障礙[7]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DGGE技術(shù)被越來(lái)越多的引進(jìn)微生物領(lǐng)域。PCR-DGGE技術(shù)直接利用DNA和RNA對(duì)微生物的組成遺傳特異性進(jìn)行表征，不但避免了傳統(tǒng)的培養(yǎng)菌種分離耗時(shí)耗力，而且還可以鑒定出利用傳統(tǒng)方法無(wú)法分離出來(lái)的菌種[8-9]。此外，PCR-DGGE方法直接從魚肉表面提取微生物的DNA，可以保持特定微生物多樣性的原始狀態(tài)，通過PCR大量擴(kuò)增DNA片段，得出魚肉表面微生物的群落結(jié)構(gòu)結(jié)果更精確[10]。本研究旨在運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)鑒定出輻照氣調(diào)技術(shù)保鮮冷藏終點(diǎn)（菌落總數(shù)大于等于1×106CFU）[11]，即冷藏18 d草魚的優(yōu)勢(shì)腐敗菌種類，以便于有針對(duì)性的選擇防腐劑，為延長(zhǎng)草魚的貨架期提供準(zhǔn)確有效的信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚 江西南昌天虹超市江大店；聚氯乙烯-聚乙烯薄膜、玻璃珠、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、0.5×TBE緩沖液（Tris 0.05 mol/L，硼酸0.04 mol/L，EDTA 1 mmol/L）、1×TAE緩沖液（Tris 0.04 mol/L，冰乙酸11.4 mL，EDTA 1 mmol/L）、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、去離子甲酰胺 北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞裂解液、苯酚、氯仿、無(wú)水乙醇、冰乙酸、異戊醇和異丙醇（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；RNA酶、Taq酶碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HZ-600型氣調(diào)包裝機(jī)（V（N2）∶V（CO2）=1∶1）上海青葩食品包裝機(jī)械有限公司；Primo R型超速離心機(jī)美國(guó)Thermo公司；DYCP型瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng) 北京六一儀器廠；S1000型PCR儀、750-0200型DGGE電泳儀美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 魚肉樣品的制備

在南昌市天虹超市購(gòu)買鮮活草魚0 ℃貯藏1 d后，去皮去筋，將魚肉切成2 cm×2 cm×0.5 cm（長(zhǎng)×寬×高）規(guī)格的魚塊，并用氣調(diào)包裝機(jī)進(jìn)行包裝，每袋包裝兩塊魚塊（10 g左右），真空、氣調(diào)（V（N2）∶V（CO2）= 1∶1）和空氣包裝各6 袋，其中氣調(diào)和空氣的氣體體積為100 mL（1 atm）。再分別送去江西科苑輻照有限公司進(jìn)行輻照，輻照劑量為0、2、4、6、8、10 kGy包裝好并經(jīng)輻照照射的樣品，空氣包裝用0、2、4、6、8、10 kGy輻照；真空包裝用0、2、4、6、8、10 kGy輻照；氣調(diào)（V（N2）∶V（CO2）=1∶1）包裝用0、2、4、6、8、10 kGy輻照。

1.3.2 魚肉表面細(xì)菌DNA的提取、純化[12-13]

稱取魚肉樣品10 g，加50 mL PBS 50 mmol/L緩沖液進(jìn)行沖洗，3 000 r/min離心10min，取上清液于8 000 r/min離心10 min，用1 mL PBS沖洗沉淀。稱0.4 g玻璃珠，加600 μL的細(xì)胞裂解液，細(xì)胞破碎時(shí)間為45 s，10 000 r/min離心10 min，取上清液。加250 μL的0.5 mol/L的EDTA溶液，在－20 ℃的條件下靜置10 min。10 000 r/min離心10 min，取上清液。加入500 μL的苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）混勻后在8 000 r/min離心5 min，取上清液。加入同等體積的異丙醇，－20 ℃靜置80 min。10 000 r/min離心10 min，棄去上清液，加1 mL 75%乙醇洗滌，37 ℃消化4 h。用0.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行DNA條帶檢測(cè)，粗提DNA置于－20 ℃條件下保藏。DNA樣品在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳30 min，以0.5×TBE為緩沖液。

1.3.3 PCR擴(kuò)增

1.3.3.1 擴(kuò)增方法

純化后的基因組DNA作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模版，利用美國(guó)Bio-Rad公司的PCR儀擴(kuò)增V3可變區(qū)。

1.3.3.2 反應(yīng)體系[14]

10×PCR緩沖液5 μL、dNTP 4 μL、引物1為2 μL（10 mmol/L）、引物2為2 μL（10 mmol/L）、牛血清蛋白2 μL（3%）、模版2 μL（1 ng/mL）、去離子水50 μL。

1.3.3.3 反應(yīng)條件

預(yù)變性94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，溫度降至為4 ℃。用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，片段大小約為217 bp[15-16]。

1.3.4 變性凝膠電泳

DGGE膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍是35%～65%，在電壓140 V的條件下電泳10 h。跑膠結(jié)束后進(jìn)行銀染，加入少量的去離子水，然后照膠[17-18]。

1.3.5 圖譜分析

采用Quantity One軟件分析圖譜。分析每個(gè)泳道條帶數(shù)目，根據(jù)條帶的灰度值可以判斷灰度值大的條帶為優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)每條泳道中的優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行割膠回收[19]。

1.3.6 測(cè)序分析

割膠回收的DNA片段，并對(duì)該片段進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系和條件與1.3.3節(jié)擴(kuò)增V3可變區(qū)一致。擴(kuò)增片段送往北京華大生物技術(shù)有限公司進(jìn)行分析。

1.3.7 測(cè)序比對(duì)

測(cè)得的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，選擇同源性值最高的為測(cè)序的結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌16S rDNA V3可變區(qū)的擴(kuò)增結(jié)果

圖1 V3可變區(qū)的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of V3 variable region

圖1是以不同輻照劑量和包裝條件下魚肉所洗滌下來(lái)的細(xì)菌DNA為模板，對(duì)16S rDNA V3可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增以后經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳以后的成像圖。16S rDNA V3可變區(qū)的基因片段為217 bp[20]。由圖1可知所有18 個(gè)樣品都有與目標(biāo)片段一致的片段，片段大小為220 bp左右。

2.2 細(xì)菌DGGE圖譜主要條帶的DNA序列分析

圖2 泳道中標(biāo)記待測(cè)序的優(yōu)勢(shì)條帶Fig.2 Lane markers for sequencing of dominant bands

圖2A、B是魚肉表面優(yōu)勢(shì)腐敗菌的DGGE電泳條帶運(yùn)用Quantity One軟件分析前、后的圖，由于6泳道基因條帶數(shù)目最多，因此以其為基準(zhǔn)，其他泳道進(jìn)行匹配。橫線標(biāo)記表明匹配的條帶。圖中的灰度值與DNA含量呈正比，灰度值越大表示DNA含量越高，Quantity One會(huì)自動(dòng)根據(jù)灰度值識(shí)別條帶，當(dāng)灰度值不小于65%時(shí)，其顯示為圖2B。圖2A割膠分析圖，按圖中的順序，依次序割膠，整張圖片的灰度值大致是空氣包裝0～8 kGy灰度值大致變化不大；a10灰度值增大；v0～NC10灰度值逐漸下降，這可能的原因是隨著輻照劑量的增加細(xì)菌被抑制后，產(chǎn)生小部分變異的11、12、13 DNA的菌落，這3 種細(xì)菌繼而成為空氣處理10 kGy的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

對(duì)圖2A中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行分析，并比對(duì)割膠，割1～15號(hào)條帶，并用50 μL去離子水浸泡，并置于4 ℃過夜，PCR擴(kuò)增16S rDNA V3可變區(qū)。擴(kuò)增后經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖3。由圖3可示，條帶1～15的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果見表1。

圖3 回收DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 PCR amplification products of recycled DNA for identified sequences

2.3 冷藏18 d魚肉貯藏過程中優(yōu)勢(shì)菌的分析

表1 16S rDNA V3可變區(qū)基因序列比對(duì)結(jié)果圖Table1 Sequence alignment of V3 variable region of 16S rDNA gene

由表1可知，條帶1～4所代表的微生物分別是耶爾森菌（Yersinia sp.）、沙雷菌屬（Serratia sp.）、乳酸菌屬（Lactobacillus sp.），5～11、13、14為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），12為肺炎桿菌屬（Klebsiella pneumonia sp.），15為熱死環(huán)絲菌屬（Brochothrix thermosphacta sp.）。

2.3.1 耶爾森菌

DGGE圖譜中條帶的亮度大小代表微生物的數(shù)量多少，條帶越亮微生物的數(shù)量越多[21]。耶爾森菌（Yersinia sp.）是食物中的一種病原微生物，食品安全要求其在食品中不能被檢出。由圖2可見，耶爾森菌所對(duì)應(yīng)的條帶1在空氣包裝0、6、8 kGy；真空包裝0 kGy；氣調(diào)包裝6 kGy中出現(xiàn)是這幾種處理?xiàng)l件的優(yōu)勢(shì)腐敗菌?？諝夂驼婵盏臒o(wú)輻照樣品均出現(xiàn)條帶1，空氣包裝6、8 kGy也出現(xiàn)條帶1，可能是由于隨著輻照劑量的增加引起了不利變異從而產(chǎn)生了耶爾森菌，該菌能在低溫和較高輻照劑量下逐漸生長(zhǎng)，因此要求魚肉包裝貯藏時(shí)嚴(yán)格管理衛(wèi)生，降低病原微生物的污染。

2.3.2 沙雷菌

沙雷菌（Serratia sp.）是能產(chǎn)生非水溶性黃、紫和紅色素的革蘭氏染色陰性小桿菌，一般存在于土壤、水、植物、動(dòng)物以及人類的腸道和呼吸道中。DNA中的G＋C克分子含量為53%～59%，沙雷菌屬所對(duì)應(yīng)的條帶是2、3，由表2及圖2可知，a0、a2、a6、v0、v2、v4的優(yōu)勢(shì)菌都是沙雷菌屬，而且隨著輻照劑量的增大其條帶灰度值逐漸減小，但在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)關(guān)于魚肉優(yōu)勢(shì)腐敗菌中出現(xiàn)沙雷菌屬的報(bào)道幾乎沒有。因此，在本實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)該菌種，可能是由于魚肉在洗和包裝的過程中，腸道和呼吸道沒有用無(wú)菌水清洗干凈導(dǎo)致的沙雷菌污染所致。

2.3.3 乳酸菌

在真空和氣調(diào)包裝的條件下，乳酸菌屬（Lactobacillus sp.）數(shù)量明顯上升[22]，乳酸菌對(duì)應(yīng)的條帶是4，由圖2可知，乳酸菌是a2、a4、a6、a8、a10、NC2以及NC8的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。乳酸菌在以上包裝條件中條帶都很深，是其優(yōu)勢(shì)腐敗菌，乳酸菌是一種兼性厭氧菌，文獻(xiàn)報(bào)道乳酸菌在空氣和真空中數(shù)量迅速增長(zhǎng)，從圖2可見，氣調(diào)包裝乳酸菌也依然是優(yōu)勢(shì)腐敗菌，這可能是由于氣調(diào)中N2和CO2的比例不足以抑制乳酸菌的生長(zhǎng)。

2.3.4 假單胞菌屬

假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）是需氧型微生物、細(xì)菌一科，無(wú)核、革蘭氏陰性桿菌、不形成芽孢，化能有機(jī)營(yíng)養(yǎng)，嚴(yán)格好氧，呼吸代謝，從不發(fā)酵。文獻(xiàn)[22-23]報(bào)道假單胞菌是真空、空氣包裝的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。假單胞菌所對(duì)應(yīng)的條帶是5～11、13、14，其在各包裝條件中數(shù)量迅速增長(zhǎng)，尤其是在真空包裝和空氣包裝中，氣調(diào)包裝也有少量的假單胞菌，但條帶的顏色整體較淺，隨著輻照劑量的增加假單胞菌的亞種和數(shù)量都在明顯的減少，這與文獻(xiàn)[24]中報(bào)道的一定劑量輻照可以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)結(jié)論一致。

2.3.5 肺炎桿菌

肺炎桿菌（Klebsiella pneumonia sp.）是一種病原微生物，在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中還沒有魚肉貯藏過程中出現(xiàn)肺炎桿菌的報(bào)道，肺炎桿菌所對(duì)應(yīng)的條帶是12，由圖2可知，肺炎桿菌僅出現(xiàn)在v0中且條帶較淺，可認(rèn)定其不是優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

2.3.6 熱死環(huán)絲菌

熱死環(huán)絲菌（Brochothrix thermosphacta）是革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)胞無(wú)莢膜，不運(yùn)動(dòng)、不生孢子。熱死環(huán)絲菌是兼性厭氧菌，主要出現(xiàn)于肉產(chǎn)品，廣泛分布于環(huán)境中[25]。由圖2可知，熱死環(huán)絲菌所對(duì)應(yīng)的條帶是15，并在v4、v8、v10中出現(xiàn)，且在v4、v10條帶很深，也就意味著細(xì)菌數(shù)量較多，可認(rèn)定為是v4、v10的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

3 討論與結(jié)論

本研究運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)鑒別不同包裝和輻照劑量魚肉在貯藏過程中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌種類和分布的研究，結(jié)果表明不同包裝和輻照劑量的冷藏魚肉中優(yōu)勢(shì)菌分布呈現(xiàn)以下不同的變化。

在空氣包裝中，假單胞菌和乳酸菌隨著輻照劑量的增加，DGGE條帶越深， 說明這兩種細(xì)菌對(duì)輻照有好的抗性；沙雷菌在0～6 kGy劑量下是優(yōu)勢(shì)腐敗菌，但在8 kGy以上便被抑制，條帶逐漸變淺并消失；耶爾森菌在6～8 kGy劑量下是優(yōu)勢(shì)腐敗菌，它可能由其他細(xì)菌在輻照下變異所產(chǎn)生，并在高劑量（10 kGy）輻照條件下被殺滅，具體原因還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

在真空包裝中，假單胞菌一直存在并且是其優(yōu)勢(shì)腐敗菌；沙雷菌在v0～v4劑量下是優(yōu)勢(shì)腐敗菌，但隨著輻照劑量的增加，沙雷菌被抑制；耶爾森菌在v0條件下是優(yōu)勢(shì)腐敗菌但隨著輻照劑量的增加，其被抑制直至消失；熱死環(huán)絲菌出現(xiàn)在v4、v8、v10輻照劑量下，證明熱死環(huán)絲菌對(duì)于高輻照有很強(qiáng)的抗性。

在氣調(diào)包裝，6 種劑量輻照后，魚肉表面菌群的16S rDNA DGGE條帶顏色都較淺，假單胞菌是6 種劑量輻照后魚肉表面的優(yōu)勢(shì)腐敗菌；乳酸菌在NC2和NC8中出現(xiàn)，是其優(yōu)勢(shì)腐敗菌；耶爾森菌出現(xiàn)在NC6，耶爾森菌在其他劑量中都沒有出現(xiàn)，其是不是NC6的優(yōu)勢(shì)腐敗菌需進(jìn)一步證實(shí)。

PCR-DGGE技術(shù)能夠很好地鑒別魚肉表面優(yōu)勢(shì)腐敗菌，鑒別結(jié)果表明輻照合并氣調(diào)包裝魚肉表面細(xì)菌抑制效果要好于空氣包裝和真空包裝，不同輻照劑量合并空氣和氣調(diào)包裝中優(yōu)勢(shì)菌是乳酸菌和假單胞菌；不同輻照劑量合并真空包裝中優(yōu)勢(shì)菌是假單胞菌、熱死環(huán)絲菌。

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PCR-DGGE Analysis of Dominant Bacterial Populations on the Surface of Grass Carp Meat under Different Packaging Conditions

TU Zong-cai1,2, MA Da1, WANG Hui1, SHI Yan1, SHA Xiao-mei1, HUANG Xiao-qin2
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. Key Laboratory of Functional Small Organic Molecule, Ministry of Education, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)

Changes in dominant bacterial populations (DBP) on the surface of grass carp meat packaged under three different atmospheric conditions (air, vacuum and modified atmosphere packaging environment) and then irradiated by Co-60 gamma ray at six different doses (0, 2, 4, 6, 8, and 10 kGy) after subsequent storage at 4 ℃ for 18 days were investigated by polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis analysis (PCR-DGGE). The bacteria on the surface of fish meat samples were washed and collected, and their DNA was then extracted. The V3 variable region of 16S rDNA was amplified with PCR. Identification of DBP was performed with DGGE. The amounts and species composition of DBP varied with the type of packaging. Pseudomonas sp. was dominant on all fish samples. Lactic acid bacteria and Serratia sp. were also dominant on air-packaged samples, and Serratia sp. was inhibited when the irradiation rose was more than 8 kGy. Pseudomonas sp., Serratia sp., Brochothrix thermosphact, and Yersinia sp. were identified as the dominant bacteria on vacuum-packaged samples; Serratia sp. was inhibited when the irradiation dose was above 6 kGy, Yersinia sp. could be inhibited even when the irradiation dose exceeded 2 kGy, and B. thermosphact exhibited high irradiation resistance for its occurrence even at doses of 6 and 8 kGy. For modified atmosphere packaged fish, the DPB were Pseudomonas sp. and Lactobacillus sp.; however, lactic aci bacteria were dominant only when the irradiation dose was 2 or 8 kGy. In conclusion, PCR-DGGE provides a good way to analyze dominant bacterial populations on the surface of grass carp meat.

grass carp; polymerase chain reaction-deformation gradient gel electrophoresis analysis (PCR-DGGE); microorganisms; dominant bacterial population; modified atmosphere package; irradiation

TS201.2

A

1002-6630（2014）20-0143-05

10.7506/spkx1002-6630-201420029

2013-10-25

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）項(xiàng)目（2012CB126314）；江西省重大科技創(chuàng)新研究項(xiàng)目（20124ACB00600）

涂宗財(cái)（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭澄镔Y源開發(fā)與高效利用。E-mail：tuzc_mail@aliyun.com