基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的茵陳五苓散防治肝纖維化機(jī)制研究

王錚 孫明瑜

摘要?目的：通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索茵陳五苓散防治肝纖維化的作用機(jī)制。方法：通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索茵陳五苓散的主要活性成分;通過(guò)檢索CTD數(shù)據(jù)庫(kù)選肝纖維化的疾病靶點(diǎn);匹配藥物-疾病靶點(diǎn)，應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò);運(yùn)用STRING軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并將結(jié)果可視化;使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路分析。結(jié)果：獲取茵陳五苓散防治肝纖維化主要活性成分46個(gè)，作用靶點(diǎn)84個(gè);網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)表明，茵陳的活性成分具有最大的總度值;GO功能富集分析和KEGG通路分析獲取GO條目35個(gè)，信號(hào)通路14條。結(jié)論：茵陳五苓散可能是通過(guò)Fc epsilon RI等信號(hào)通路調(diào)控IL6、TNF與PTGS2等靶點(diǎn)減輕炎性反應(yīng)并減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積發(fā)揮抗肝纖維化作用的，而中藥茵陳與活性成分槲皮素可能在這之中發(fā)揮主要作用。

關(guān)鍵詞?網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);茵陳五苓散;肝纖維化;經(jīng)方;中醫(yī)藥

Abstract?Objective：To explore the mechanism of Yinchen Wuling Powder on liver fibrosis based on network pharmacology. Methods：The main active ingredients of Yinchen Wuling Powder was searched through TCMSP database. The disease target of liver fibrosis was searched by the CTD database; the drug-disease target was matched， Cytoscape software was used to build a traditional Chinese medicine-component-target network; STRING software was used to build a protein interaction （PPI） network， and the results were visualized; DAVID database was used perform GO function enrichment analysis and KEGG pathway analysis. Results：A total of 46 main ingredients and 84 targets of Yinchen Wuling Powder were obtained; network data indicated that active compounds of Herba Artemisiae Scopariae had the highest degree in total; and there were 35 GO terms and 14 signaling pathways in the GO and KEGG pathway analysis. Conclusion：Yinchen Wuling Powder may regulate IL6， TNF， PTGS2， etc. via pathways like Fc epsilon RI signaling pathway to reduce extracellular matrix deposition having an anti-liver fibrosis effect， and Chinese medicine Herba Artemisiae Scopariae and the active ingredient quercetin may play a major role.

Keywords?Network pharmacology; Yinchen Wuling Powder; Liver fibrosis; Classical prescription; Traditional Chinese medicine

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.19.003

持續(xù)的肝損傷會(huì)導(dǎo)致肝內(nèi)膠原沉積，形成肝纖維化[1]。肝纖維化是肝硬化、肝癌等諸多重大肝病的必經(jīng)病理過(guò)程[2]。然而，目前臨床上尚無(wú)注冊(cè)適應(yīng)證為肝纖維化的特異性藥物[3]。但中醫(yī)藥在肝纖維化防治方面體現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。研究表明，經(jīng)方茵陳五苓散能夠改善大鼠肝纖維化模型的肝功能以及肝組織病理[4]。茵陳五苓散出自東漢張仲景所著《金匱要略》，由茵陳與五苓散（澤瀉、茯苓、豬苓、白術(shù)與桂枝）組成，常用于治療濕重于熱型黃疸。因此，本文擬從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度入手，探究茵陳五苓散防治肝纖維化的具體作用機(jī)制。

1?材料與方法

1.1?茵陳五苓散主要活性成分的篩選及作用靶點(diǎn)的確定?本研究通過(guò)檢索Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫(kù)獲取茵陳五苓散所有化學(xué)成分，并依照數(shù)據(jù)庫(kù)推薦方法，以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%&類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18作為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，得到主要活性成分[5-7]。然后，通過(guò)PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)繪制主要活性成分的三維結(jié)構(gòu)。最后，將三維結(jié)構(gòu)輸入SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）軟件，通過(guò)其二維或三維結(jié)構(gòu)相似性預(yù)測(cè)主要活性成分靶點(diǎn)[8]。

1.2?肝纖維化疾病靶點(diǎn)收集?通過(guò)以主題詞“Fibrosis，Liver”檢索Comparative Toxicogenomics Database（CTD，http：//ctdbase.org/），獲取目前已知的肝纖維化靶點(diǎn)列表[9]。

1.3?茵陳五苓散與肝纖維化靶點(diǎn)匹配及蛋白互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建?將茵陳五苓散作用靶點(diǎn)與肝纖維化靶點(diǎn)逐一進(jìn)行匹配，繪制Venn圖，獲取茵陳五苓散防治肝纖維化靶點(diǎn)列表。然后，將該列表各靶點(diǎn)輸入STRING v11（https：//string-db.org/）軟件，將Organism參數(shù)設(shè)置為“homo sapiens”，構(gòu)建蛋白互作用（Protein-protein Interactions，PPI）網(wǎng)絡(luò)，并將該網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape v3.8.0軟件進(jìn)行繪圖[10-11]。

1.4?中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建?逐一匹配中藥-成分-靶點(diǎn)關(guān)系，并將列表導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行繪圖，確定網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)、邊、度值等參數(shù)。

1.5?GO分析與KEGG通路分析?將靶點(diǎn)列表輸入Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery v6.8（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行基因本體學(xué)（Gene Ontology，GO）與Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析[12-13]。

2?結(jié)果

2.1?茵陳五苓散主要活性成分的篩選及作用靶點(diǎn)?本研究通過(guò)檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行篩選后，共獲取茵陳五苓散活性成分46個(gè)，茵陳含有其中14個(gè)，澤瀉含有8個(gè)，茯苓含有15個(gè)，豬苓含有10個(gè)，桂枝含有7個(gè)，白術(shù)含有7個(gè)，存在2種中藥共有相同成分的情況。見(jiàn)表1。經(jīng)過(guò)二維與三維結(jié)構(gòu)比對(duì)，預(yù)測(cè)茵陳五苓散存在藥物靶點(diǎn)共521個(gè)。

2.2?肝纖維化的疾病靶點(diǎn)篩選?在CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)共1 029個(gè)。去重后，共得到955個(gè)肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3?共同靶點(diǎn)篩選及互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建?通過(guò)繪制Venn圖，獲取茵陳五苓散與肝纖維化交集靶點(diǎn)84個(gè)。見(jiàn)圖1。然后，對(duì)此84個(gè)靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。見(jiàn)圖2。此網(wǎng)絡(luò)中，每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)靶點(diǎn)，每條邊代表一項(xiàng)靶點(diǎn)間互作用關(guān)系。此外，度值最高的3個(gè)節(jié)點(diǎn)分別為IL6（度值57）、TNF（度值49）與PTGS2（度值38）。見(jiàn)圖3。度值能夠表示一個(gè)節(jié)點(diǎn)在其所在網(wǎng)絡(luò)的重要性。

2.4?中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)?對(duì)茵陳五苓散組成中藥、所含主要活性成分與對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)筑。見(jiàn)圖4。其中紫色節(jié)點(diǎn)代表茵陳五苓散組成中藥，紅色節(jié)點(diǎn)代表主要活性成分，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。此網(wǎng)絡(luò)中度值最高的3個(gè)主要活性成分分別為Cerevisterin（啤酒甾醇，度值34）、Ergosterol Peroxide（過(guò)氧麥角甾醇，度值30）與6-demethoxycapillarisin（6-去甲氧基茵陳色原酮，度值25）;度值最高的3個(gè)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)分別為PTPN1（度值35），CYP17A1（度值31）與HMGCR（度值28）。見(jiàn)圖5。此外，計(jì)算表明，在茵陳五苓散中，茵陳的活性成分具有最高的總度值。同時(shí)，在各個(gè)中藥的活性成分中，Quercetin（槲皮素）與重要靶點(diǎn)對(duì)接次數(shù)最多。

2.5?GO分析與KEGG通路分析?應(yīng)用DAVID v6.8進(jìn)行GO與KEGG通路富集分析，并進(jìn)行可視化。GO分析獲取GO條目35個(gè)，其中生物過(guò)程（Biological Process，BP）的主要條目為蛋白質(zhì)水解（Proteolysis）、氧化還原過(guò)程（Oxidation-reduction Process）、炎性反應(yīng)（Inflammatory Response）等，細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）的主要條目為漿膜（Plasma Membrane）、細(xì)胞外外泌體（Extracellular Exosome）、細(xì)胞外間隙（Extracellular Space）等，分子功能（Molecular Function）的主要條目為受體結(jié)合（Receptor Binding）、酶結(jié)合（Enzyme Binding）、絲氨酸類型內(nèi)肽酶活性（Serine-type Endopeptidase Activity）等。見(jiàn)圖6A。KEGG通路分析獲取信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路14條，主要信號(hào)通路為Fc epsilon RI信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、Sphingolipid信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路等。見(jiàn)圖6B、圖7，表2。

3?討論

現(xiàn)代研究表明，茵陳五苓散能夠保肝利膽、降血脂與抗動(dòng)脈粥樣硬化，同時(shí)也具有抗過(guò)敏、抗炎、鎮(zhèn)痛，在肝炎、高血脂與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎等作用[14]。此外，也有研究表明茵陳五苓散具有抗肝纖維化潛力[4]。因此，本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)其抗肝纖維化的可能機(jī)制進(jìn)行了探索。

中藥復(fù)方成分復(fù)雜。本研究通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選已發(fā)現(xiàn)的茵陳五苓散成分，獲取易于人體利用的成分46個(gè)。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，相繼發(fā)現(xiàn)這些成分的作用靶點(diǎn)521個(gè)，以及潛在的抗肝纖維化靶點(diǎn)84個(gè)。

在PPI分析中，重要的靶點(diǎn)有IL-6、TNF與PTGS2等。IL（interleukin，白細(xì)胞介素）-6是一種重要的細(xì)胞因子，能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化與特異性基因的表達(dá)，并且在肝纖維化中發(fā)揮重要作用[15]。IL-6通過(guò)Fas通路促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，加重肝纖維化程度[16]。TNF（tumor necrosis factor，腫瘤壞死因子）-α是巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞分泌的多效性細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展[17]。而炎性反應(yīng)的存在會(huì)導(dǎo)致過(guò)度的肝再生，分泌過(guò)剩的細(xì)胞外基質(zhì)，從而加重肝纖維化。PTGS2，其編碼蛋白COX（cyclooxygenase，環(huán)氧化酶）-2屬于誘導(dǎo)型酶，在受到各種刺激的情況下才會(huì)發(fā)生誘導(dǎo)表達(dá)。而COX-2抑制劑能夠通過(guò)抑制這個(gè)途徑參與炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖、血管增生等纖維化相關(guān)生理病理過(guò)程[18]。因此，茵陳五苓散可能是通過(guò)調(diào)節(jié)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)改善肝臟炎性反應(yīng)以發(fā)揮其抗纖維化效果的。

值得注意的是，在茵陳五苓散中，茵陳的活性成分具有最高的總度值，這提示在此方劑中，茵陳可能發(fā)揮主要作用。茵陳本身具有顯著抗肝纖維化作用，其能夠改善大鼠血清丙二醛與肝羥脯氨酸水平[19]。此外，茵陳具有良好的抗炎作用，其能夠抑制COX-2活性，組織巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧。也有研究表明，茵陳也能通過(guò)下調(diào)TLR4抑制NF-κB信號(hào)通路，從而發(fā)揮其抗炎作用[19]。同時(shí)，與關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接次數(shù)最多的活性成分為槲皮素。既往研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads與PI3K/Akt通路抑制肝星狀細(xì)胞激活并減少其自噬作用發(fā)揮抗肝纖維化作用[20]。此外，槲皮素在多種纖維化疾病中均有一定防治作用[21-23]。

GO分析也表明，茵陳五苓散靶點(diǎn)與炎性反應(yīng)、細(xì)胞外外泌體、細(xì)胞外間隙、受體結(jié)合等條目相關(guān)。乙醇、肝炎病毒等對(duì)肝臟造成損傷后，肝臟會(huì)啟動(dòng)名為肝再生的損傷修復(fù)[1]。這一過(guò)程中，活化的肝星狀細(xì)胞會(huì)分泌細(xì)胞外基質(zhì)以修復(fù)受損的肝臟。若病因持續(xù)存在，細(xì)胞外基質(zhì)則會(huì)分泌過(guò)剩，造成膠原沉積，引起肝纖維化[24-25]。因此GO分析結(jié)果能夠在一定程度上驗(yàn)證茵陳五苓散防治肝纖維化的有效性，并較為明確地指出了其具體作用環(huán)節(jié)與位置。

KEGG通路分析結(jié)果提示茵陳五苓散防治肝纖維化作用機(jī)制與Fc epsilon RI信號(hào)通路相關(guān)。茵陳五苓散可能參與調(diào)控該通路中Fyn、Vav、p38、cPLA2等節(jié)點(diǎn)。這一通路參與調(diào)控IL-3、4、5、13等多種細(xì)胞因子，并與花生四烯酸代謝、MAPK信號(hào)通路等密切相關(guān)，而這些細(xì)胞因子與通路均在肝纖維化以及相關(guān)炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[26-28]。

綜上所述，茵陳五苓散具有防治肝纖維化的潛力，其具體機(jī)制可能是通過(guò)減輕肝臟炎性反應(yīng)并減少細(xì)胞外基質(zhì)分泌從而發(fā)揮其抗纖維化作用。其中發(fā)揮主要防治作用的中藥與活性成分可能為茵陳與槲皮素。

本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步探索了茵陳五苓散防治肝纖維化的有效活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)、作用機(jī)制及可能通路。結(jié)果顯示，茵陳五苓散可能通過(guò)Fc epsilon RI等信號(hào)通路調(diào)控IL-6、TNF與PTGS2等靶點(diǎn)，減輕炎性反應(yīng)并減少細(xì)胞外基質(zhì)分泌發(fā)揮其抗肝纖維化作用，提示茵陳五苓散具有作為防治肝纖維化藥物的潛力。而在茵陳五苓散中，中藥茵陳以及活性成分槲皮素可能發(fā)揮主要作用，因此，槲皮素有望以單體的形式成為肝纖維化的防治藥物。本文研究結(jié)果具有局限性，需要?jiǎng)游锛芭R床試驗(yàn)驗(yàn)證其有效性與可靠性。

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（2020-09-10收稿?責(zé)任編輯：王明）