超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定減肥類保健食品中10種非法添加利尿類及瀉下類藥物

李 卓,陳玉龍，孫 曉,饒雅琨,董曼曼,王蓓蓓,賈寒冰,王 濤,梁紅月，張亞鋒(.西安市食品藥品檢驗(yàn)所,陜西西安 70054；.陜西省藥品技術(shù)審查查驗(yàn)中心，陜西西安 70065)

隨著人們生活水平的提高,對美麗、健康等方面有了更多的要求,眾多減肥類保健食品產(chǎn)品應(yīng)運(yùn)而生。然而許多不法分子在這些利益驅(qū)使下,追求短暫減肥效果和高額利潤,在保健品中非法添加利尿類和下瀉類藥物,這些藥物作為處方藥有嚴(yán)格的服用劑量要求,患者在不知情的情況下長期服用這些產(chǎn)品時,可能會因?yàn)閿z入過量引起嚴(yán)重的不良反應(yīng),與有些藥物同服還會發(fā)生藥物相互作用,導(dǎo)致難以預(yù)測的嚴(yán)重后果,使得廣大消費(fèi)者在身體上受到不同程度的傷害。

隨著高精密儀器的發(fā)展,現(xiàn)已出現(xiàn)了許多針對違法添加藥物的分析方法[1],有薄層色譜法[2]、高效液相色譜法[3-6]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7-16]、超高效液相色譜-靜電場軌道肼質(zhì)譜[17-18]、超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜法[19-21]等。顯而易見,液質(zhì)已成為了違法添加藥物檢測的主流方法。目前國內(nèi)外有關(guān)保健食品的違法添加藥物測定報(bào)道較多,但尚無針對減肥類保健食品同時測定10種非法添加藥物(氯噻嗪、氫氯噻嗪、氯噻酮、甲氯噻嗪、吲達(dá)帕胺、酚酞、蘆薈大黃素、比沙可啶、大黃酚、大黃素)的液質(zhì)方法。本實(shí)驗(yàn)擬采用甲醇提取,電噴霧電離源,建立多種減肥類非法添加藥物的超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)測定方法,以便市場監(jiān)管部門在此類監(jiān)測檢查中能發(fā)現(xiàn)更多的非法添加物,為廣大群眾的身體健康做出更安全的保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氯噻嗪(CAS號:58-94-6,純度100%)、氫氯噻嗪(CAS號:58-93-5,純度99.7%)、氯噻酮(CAS號:66258-76-2,純度99.5%)、甲氯噻嗪(CAS號:135-07-9,純度99.6%)、吲達(dá)帕胺(CAS號:26807-65-8,純度97.7%)、酚酞(CAS號:77-09-8,純度100%)、蘆薈大黃素(CAS號:481-72-1,純度98.3%)、比沙可啶(CAS號:603-50-9,純度100%)、大黃酚(CAS號:481-74-3,純度99.2%)、大黃素(CAS號:518-82-1,純度98.7%) 中國食品藥品檢定研究院;樣品采集13批減肥類保健食品 均抽自百貨商店、藥店;甲醇、乙腈 色譜純,Fisher;甲酸 質(zhì)譜級,aladin。

Ulimate3000-TSQ Quantiva超高液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 配有Trace Finder數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國賽默飛科技有限公司;KQ-700VDB雙頻數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器公司;Milli-Q Integral 5 制水機(jī) 美國Millipore公司;ME204E 萬分之一電子天平、MS105十萬分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;臺式離心機(jī) 美國Sigma。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 分別精密稱取10種藥物標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg于10 mL量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,制成1 mg/mL單一成分標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于4 ℃避光保存3個月。

分別取上述配制好的單一標(biāo)準(zhǔn)品儲備液各0.5 mL,置于50 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制成10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,備用。取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,用甲醇配制系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品溶液制備 精密稱取0.5 g樣品(顆粒劑、片劑取適量研細(xì);膠囊劑取內(nèi)容物適量研細(xì);口服液充分搖勻、軟膠囊取適量內(nèi)容物混勻;蜜餞取可食部分研細(xì))于25 mL量瓶中,加甲醇適量,渦旋振蕩,超聲(頻率80 kHz;功率700 W)處理30 min,放冷至室溫,加甲醇定容至刻度,搖勻,6000 r/min離心5 min,取上清液1 mL,用甲醇稀釋10倍,用0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜濾過,待測。

1.2.3 色譜-質(zhì)譜條件 色譜條件:Thermo Hypersil GOLD色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm);柱溫30 ℃;流速0.2 mL/min;進(jìn)樣體積2 μL;流動相為水(A)-乙腈(B),梯度程序洗脫為0～5 min,15% B;5～12 min,15%～60% B;12～15 min,60% B;15～17 min,60%～90% B;17～20 min,90% B;20～21 min,90%～15% B;21～25 min,15% B。

質(zhì)譜條件:采用多反應(yīng)檢測(MRM);霧化氣N2;碰撞氣Ar;霧化溫度300 ℃;離子傳輸管溫度350 ℃;毛細(xì)管電壓3.5 kV;鞘氣流速4.57 L/min;輔助氣流速11.36 L/min。各目標(biāo)化合物監(jiān)測離子對及相關(guān)參數(shù)設(shè)定見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用針泵流動注射連續(xù)進(jìn)樣的方式進(jìn)行質(zhì)譜全掃描檢測,分別在正、負(fù)離子模式下考察了10種目標(biāo)藥物的一級質(zhì)譜響應(yīng),發(fā)現(xiàn)氯噻嗪、氫氯噻嗪、氯噻酮、甲氯噻嗪、吲達(dá)帕胺、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素的[M-H]-峰響應(yīng)強(qiáng)度大且穩(wěn)定,酚酞、比沙可啶的[M+H]+峰響應(yīng)強(qiáng)度大且穩(wěn)定,故選擇正負(fù)離子分段掃描模式進(jìn)行檢測。然后給予母離子不同的碰撞能量進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描,對子離子進(jìn)行優(yōu)化,每個化合物選擇2個響應(yīng)值高且穩(wěn)定的子離子,最終在優(yōu)化條件下確定響應(yīng)較強(qiáng)的離子作為定量離子,另一離子作為定性離子,結(jié)果詳見表1。

表1 10種化合物的保留時間及質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention time and spectrometric parameters of 10 compounds

2.2 色譜條件的優(yōu)化

比較了水-甲醇、水-乙腈、0.01%甲酸水-乙腈三種體系的流動相,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在水-甲醇體系中無論是以80∶20為初始流動相,還是以90∶10為初始流動相,由于溶劑效應(yīng)的影響,氯噻嗪和氫氯噻嗪均為分叉峰,且都無法達(dá)到保留時間分離。在0.01%甲酸水-乙腈體系中,氯噻嗪、氫氯噻嗪、氯噻酮、甲氯噻嗪、吲達(dá)帕胺、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素的峰響應(yīng)強(qiáng)度有不同程度減弱。在水-乙腈體系中,10個目標(biāo)化合物均有良好的峰形,且通過調(diào)節(jié)梯度洗脫程序使質(zhì)荷比在3個道爾頓以內(nèi)的氯噻嗪和氫氯噻嗪、蘆薈大黃素和大黃素均可達(dá)到保留時間分離,從而保證了10種目標(biāo)物的準(zhǔn)確測定。提取離子流圖見圖1。

圖1 10種化合物的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖(100 ng/mL)Fig.1 Multiple reaction monitoring(MRM)chromatogram of the 10 compounds(100 ng/mL)

2.3 基質(zhì)效應(yīng)考察及消除

保健食品基質(zhì)比較復(fù)雜,常常會干擾目標(biāo)物的檢測,會對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。因此,在建立液質(zhì)檢測方法時應(yīng)對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評價,并采取消除措施,以保證結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。

基質(zhì)效應(yīng)[22-24]是指基質(zhì)成分和目標(biāo)化合物在進(jìn)行離子化時相互競爭而導(dǎo)致目標(biāo)化合物信號強(qiáng)度有不同程度的增強(qiáng)或減弱的現(xiàn)象,包括基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)選用了陰性液體基質(zhì)和陰性固體基質(zhì)樣品,各采用未用甲醇10倍稀釋的空白樣品溶液(BL1、BS1)、空白樣品溶液(BL2、BS2)、甲醇10倍稀釋空白樣品溶液(BL3、BS3)加入10種藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成各3種混合標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)溶液,再用甲醇(A)配制同一濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,通過 MS/MS分析測定,按照式(1)計(jì)算MEx:

式(1)

式中:MEx表示基質(zhì)效應(yīng)的大小,大于100%為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),小于100%為基質(zhì)抑制效應(yīng)。A、Bx分別為待測標(biāo)物在純?nèi)軇┖驮诓煌瑯悠啡芤褐械姆迕娣e。

由表2可知,在BL1溶液中,氯噻嗪、氫氯噻嗪、大黃素有不同程度的基質(zhì)減弱效應(yīng),其中氯噻嗪、氫氯噻嗪基質(zhì)減弱較強(qiáng),比沙可啶有一定程度的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。

表2 10種化合物在不同稀釋體積基質(zhì)溶液中的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effects(ME)of the 10 compounds in different diluent

而在BL2和BL3溶液中,各化合物ME值在98.1%～108.7%之間,可忽略基質(zhì)效應(yīng)。在BS1溶液中,氯噻嗪、氫氯噻嗪、甲氯噻嗪、吲達(dá)帕胺、酚酞、蘆薈大黃素、比沙可啶、大黃素、大黃酚均有大幅度的基質(zhì)減弱效應(yīng),氯噻酮有較弱的基質(zhì)減弱,可忽略基質(zhì)效應(yīng)。而在BS2和BS3溶液中,各化合物ME值在82.4%～106.4%之間,可忽略基質(zhì)效應(yīng)。故為消除基質(zhì)效應(yīng)帶來的定量影響,最終選擇樣品在甲醇超聲提取定容后,用甲醇十倍稀釋后上機(jī)為本實(shí)驗(yàn)在前處理方法。

2.4 線性關(guān)系考察

取“1.2.1”項(xiàng)下系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定,以質(zhì)量濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,10種藥物的回歸方程及線性范圍,見表3。

2.5 檢測限和定量限

精密稱取空白樣品1份,加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,按照“1.2.2”項(xiàng)下同法處理樣品,按“1.2.3”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行測定,以3倍信噪比(S/N)時為方法的檢出下限;以10倍信噪比(S/N)時為方法的定量下限,結(jié)果見表3。

表3 10種藥物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)及方法檢出限、定量限Table 3 Limits of detection,limits of quantitative,linear range,regression equation and correlation coefficient of 10 drugs

2.6 儀器精密度試驗(yàn)

精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2 μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積,計(jì)算氯噻嗪、氫氯噻嗪、氯噻酮、甲氯噻嗪、吲達(dá)帕胺、酚酞、蘆薈大黃素、比沙可啶、大黃酚、大黃素的峰面積的RSD(n=6)分別為0.69%、0.57%、0.84%、2.00%、2.21%、2.98%、2.52%、1.25%、1.28%、1.79%均符合要求。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取固體制劑和液體制劑空白樣品各9份,加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,并用氮?dú)獯蹈?制成高、中、低三濃度三平行的加標(biāo)回收樣品,然后按照“1.2.2”項(xiàng)下同法處理該18份樣品。按“1.2.3”項(xiàng)下檢測條件進(jìn)行測定,計(jì)算各組分的回收率和RSD,結(jié)果見表4。結(jié)果表明無論在固體基質(zhì)還是液體基質(zhì)中,10種化學(xué)成分的平均回收率均在70%～125%之間,回收率良好。

表4 10種藥物回收率(n=3)Table 4 Recoveries of 10 drugs(n=3)

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取固體制劑和液體制劑陰性樣品各6份(n=6),加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備 6 份樣品溶液,按“1.2.3”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行測定,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算含量,結(jié)果10中目標(biāo)化合物的RSD在0.16%～8.28%,重復(fù)性較好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取空白樣品1份,加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,按照“1.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液,分別保存0、2、4、8、12、24、48 h測定10種藥物的含量見圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn),氯噻酮在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好,含量變化小于4.36%,待12 h后含量變化大于10%,酚酞、甲氯噻嗪在12 h穩(wěn)定性良好,含量變化小于5.93%,其余8種藥物在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好,含量變化小于6.64%。

圖2 48 h內(nèi)10種藥物的含量Fig.2 Content of the 10 durgs within 48 h

2.10 樣品測定

取13批保健食品,按照“1.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液,分別按“1.2.3”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定,如果樣品中的質(zhì)量色譜峰保留時間與標(biāo)準(zhǔn)工作液中的某種組分一致(變化范圍在±2.5%之內(nèi));試樣中定性離子對的相對豐度與濃度相當(dāng)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的相對豐度一致,相對豐度偏差不超過最大允許偏差[15]規(guī)定的范圍,則可判定為試樣中存在該組分。結(jié)果3批檢出非法添加酚酞(含量分別為534、1880、127 μg/kg)、2批檢出非法添加氫氯噻嗪(含量分別為1284、462 μg/kg),陽性率為38%,其中有碧生源牌常菁茶和纖纖梅兩個樣品中檢出少量蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素,由于產(chǎn)品原料中含有決明子,還需根據(jù)配料進(jìn)一步計(jì)算以確定其是否為非法添加還是帶入。某陽性樣品的總離子流圖和提取離子流圖詳見圖3、圖4。

圖3 樣品A的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of sample A

圖4 樣品A的提取離子流圖(酚酞)Fig.4 Extracted ion chromatogram(phenolphthalein)of sample A

3 結(jié)論

本文建立了一種減肥類保健食品中10種非法添加利尿類及瀉下類藥物的超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。該方法靈敏度高,專屬性好,較好地降低了基質(zhì)效應(yīng)帶來的定量影響,適用于減肥類保健食品的非法添加藥物的測定,為市場監(jiān)管部門在此類監(jiān)測檢查中能發(fā)現(xiàn)更多的非法添加物提供參考。