響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波協(xié)同酶法提取杜仲葉多糖工藝

陳雪花,楊萬根(吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室,湖南張家界 427000)

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)是一種名貴的中藥材,在我國已有2000多年的藥用歷史[1],中國古代醫(yī)學(xué)典籍中就曾記載杜仲具有補(bǔ)腎、補(bǔ)肝虛、強(qiáng)筋骨、降血壓等功效[2]。杜仲全身都是寶,杜仲的莖、皮在臨床上可用于治療高血壓、陽痿、腰痛以及坐骨神經(jīng)痛,而杜仲葉可用于治療糖尿病或被制成增強(qiáng)體質(zhì)、預(yù)防疾病的功能性飲料或保健食品[3-4]。長期以來人們都是以杜仲皮入藥,但因杜仲樹生長緩慢,往往需要經(jīng)過多年的生長才能取皮入藥,故在市場上杜仲皮供不應(yīng)求[5]。研究證實,杜仲葉和杜仲皮的化學(xué)成分基本一致,富含綠原酸、黃酮類化合物、桃葉珊瑚甙、環(huán)烯醚萜及多糖等活性成分,功效基本相同,可以以葉代皮入藥[6-7]。2018年4月,國家衛(wèi)生健康委員會公布 “關(guān)于征求將黨參等9種物質(zhì)作為按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材物質(zhì)管理意見的函(國衛(wèi)辦食品函〔2018〕278號)”,杜仲葉作為9種物質(zhì)之一被列入其中?！八幨惩础苯o了杜仲葉一個新身份,在此背景下杜仲葉相關(guān)保健產(chǎn)品的市場需求將持續(xù)增大。

多糖有廣泛的藥理活性,在抗氧化[8]、抗腫瘤[9]、免疫調(diào)節(jié)[10]等方面有獨(dú)特的功效,并且基本對機(jī)體無毒害作用,而受到研究者越來越多的關(guān)注。熱水萃取是傳統(tǒng)的多糖提取方法,但其存在能耗高、效率低、環(huán)境污染嚴(yán)重等問題[11],因此相關(guān)學(xué)者一直在研究多糖的高效提取方法,出現(xiàn)了諸如超聲波輔助提取[12]、微波輔助提取[13]、酶法輔助提取[14]、超高壓輔助提取[15]、亞臨界提取[16]等新方法。關(guān)于杜仲多糖的提取已有較多的文獻(xiàn)報道,如孫曦曉等[17]以杜仲樹皮為原料,采用超聲輔助法提取杜仲多糖,多糖得率為1.94%。劉曉河等[18]研究了果膠酶、中性蛋白酶和纖維素酶對杜仲多糖提取率的影響,發(fā)現(xiàn)三種酶均能提高多糖提取率,其中以果膠酶提高多糖提取率效果最為顯著。但是這些報道均集中于杜仲多糖單一輔助提取技術(shù)研究,多糖得率不高。

目前國內(nèi)外還未見將超聲波和酶法輔助同時應(yīng)用于杜仲葉多糖提取的文獻(xiàn)報道,因此本文采用Plackett-Burman設(shè)計和響應(yīng)面法對超聲波-協(xié)同酶法提取杜仲葉多糖的工藝進(jìn)行研究。先通過單因素實驗考察復(fù)合酶添加量、pH等因素對多糖得率的影響,再通過Plackett-Burman實驗確定影響顯著因素,并對這些影響顯著因素進(jìn)行最陡爬坡實驗以逼近各因素的最大響應(yīng)區(qū)域,最后采用Box-Behnken實驗優(yōu)化提取工藝。本研究將為杜仲葉多糖的高效提取技術(shù)提供參考,對以杜仲葉多糖為主要原料的保健食品、藥品的開發(fā)和杜仲產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益的提高都具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲葉(2019年10月采摘于吉首大學(xué)林產(chǎn)化工湖南省重點實驗室杜仲基地),洗凈后于60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干,然后粉碎成粉末,過60目篩備用;木瓜蛋白酶(1×106U/g)、纖維素酶(5×105U/g)、果膠酶(5×105U/g) 浙江東進(jìn)生物科技有限公司;葡萄糖、乙酸、乙酸鈉、苯酚、濃硫酸、石油醚(60～90 ℃沸程)、無水乙醇、正丁醇、三氯甲烷、活性炭 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;所有有機(jī)溶劑 均為國產(chǎn)分析純。

TF-650CT型多用途恒溫超聲波提取機(jī) 上海拓紛機(jī)械設(shè)備有限公司;RE-501A型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 鄭州特爾儀器設(shè)備有限公司;GZX-9246MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;PHSJ-4A型實驗室pH計 上海雷磁精科有限公司;TG165型臺式高速離心機(jī) 長沙平凡儀器儀表有限公司;JA2003型電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 杜仲葉粉的預(yù)處理 取杜仲葉粉于60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重,用5倍體積的石油醚(W/V)于80 ℃恒溫水浴浸提2 h除去杜仲膠和脂類,重復(fù)3次,過濾、晾干。濾渣再用5倍體積的80%乙醇(w/V)于80 ℃恒溫水浴浸提取2 h除去小分子單糖、雙糖、寡糖等物質(zhì),重復(fù)3次,過濾、晾干,置于干燥器中備用。

1.2.2 杜仲葉多糖提取 精確稱取2.0 g預(yù)處理后的杜仲葉干粉,以蒸餾水為提取溶劑,按照工藝研究中的不同參數(shù)設(shè)定超聲波協(xié)同酶法提取條件進(jìn)行多糖的提取。提取結(jié)束后,4000 r/min離心10 min,上清液即為多糖提取液。多糖提取液于-0.09 MPa、60 ℃條件下真空減壓濃縮至原體積的十分之一,室溫條件下往濃縮液中加入95%乙醇至溶液乙醇濃度達(dá)80%,4 ℃靜置12 h后,4000 r/min離心10 min,棄去上清液,將得到的沉淀用無水乙醇洗2次,晾干后即得到杜仲葉粗多糖。用蒸餾水將多糖充分溶解并定容至1000 mL,測多糖含量,計算多糖得率。

1.2.3 杜仲葉多糖含量的測定及多糖得率計算 用苯酚-硫酸法[19]測多糖含量。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:取葡萄糖于105 ℃干燥至恒重,精確稱取20 mg,加蒸餾水溶解,定容至500 mL。分別吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液,置于10 mL試管中,各加蒸餾水補(bǔ)足至2 mL,加入6%苯酚1 mL搖勻,迅速滴加濃硫酸5 mL,搖勻,室溫放置5 min,置沸水浴中加熱20 min,迅速冷卻至室溫,于490 nm處測吸光度A。以蒸餾水為空白,標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖質(zhì)量濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出回歸方程:A=0.0108C-0.0114,R2=0.9991。精密吸取1.0 mL定容后的杜仲葉多糖液樣品,加蒸餾水補(bǔ)足至2 mL,測吸光度A。以蒸餾水為空白,重復(fù)測定三次,取平均值。按下式計算杜仲葉多糖得率(Y):

式中:C為待測樣品液中的多糖質(zhì)量濃度(mg/mL);V為待測樣品液的體積(mL);n為樣品液的稀釋倍數(shù);m為杜仲葉粉的質(zhì)量(g)。

1.2.4 單因素實驗 精確稱取2.0 g預(yù)處理后的杜仲葉粉,預(yù)設(shè)4%復(fù)合酶(木瓜蛋白酶∶纖維素酶∶果膠酶=1∶1∶1[20])添加量,pH4.0,提取溫度50 ℃,超聲波功率100 W,液料比 20∶1 mL/g,提取時間20 min為單因素實驗中的常規(guī)量。以復(fù)合酶添加量(3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%)、pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)、提取溫度(35、40、45、50、55、60 ℃)、超聲波功率(40、60、80、100、120、140 W)、液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL/g)、提取時間(5、10、15、20、25、30 min)6個因素變量替換實驗中的常規(guī)量。按1.2.2與1.2.3中的方法提取、測定并計算多糖得率,每組重復(fù)三次。

1.2.5 Plackett-Burman實驗 以單因素實驗為基礎(chǔ),利用Plackett-Burman實驗篩選出顯著影響杜仲葉多糖得率的關(guān)鍵因素。每個因素取高(+1)和低(-1)兩個水平,共12組實驗。實驗因素與水平取值見表1。

表1 Plackett-Burman實驗的因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiment

1.2.6 最陡爬坡實驗 根據(jù)Plackett-Burman實驗得到的一次擬合方程,設(shè)計各關(guān)鍵因素的爬坡方向和步長。通過最陡爬坡實驗使關(guān)鍵因素的取值逼近最大響應(yīng)區(qū)域,確定響應(yīng)面實驗的0水平,以便建立有效的響應(yīng)面擬合方程[21]。

1.2.7 響應(yīng)面優(yōu)化實驗 根據(jù)Plackett-Burman實驗和最陡爬坡實驗結(jié)果,對篩選出的復(fù)合酶添加量、pH和超聲波功率3個關(guān)鍵因素進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken實驗(見表2)。對Box-Behnken實驗結(jié)果建立數(shù)學(xué)回歸模型并分析。

表2 Box-Behnken實驗因素與編碼水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiment

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有實驗都進(jìn)行3次重復(fù)操作,運(yùn)用minitab 17軟件設(shè)計Plackett-Burman實驗,Design-Expert.8.0.6軟件設(shè)計Box-Behnken實驗,SPSS 23和Origin 9.0軟件進(jìn)行ANOVA分析和圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 復(fù)合酶添加量對杜仲葉多糖得率的影響 復(fù)合酶添加量對杜仲葉多糖得率的影響見圖1。當(dāng)復(fù)合酶的添加量從3.0%增加到4.0%時,杜仲葉多糖得率快速提高,在4.0%達(dá)到最大值4.09%±0.02%,但當(dāng)添加量大于4.0%時,得率呈緩慢下降趨勢。這可能是因為隨著酶的量增加,酶與底物的接觸機(jī)會增大,加速了細(xì)胞壁的溶解,有利于多糖的溶出[22]。但是,過高的酶添加量會造成蛋白酶自溶和其他兩種酶的水解,從而使底物的水解速度下降。因此,確定4.0%作為復(fù)合酶的最佳添加量。

圖1 復(fù)合酶添加量對多糖得率的影響Fig.1 Effects of multienzyme complex dose on the yield of polysaccharide

2.1.2 pH對杜仲葉多糖得率的影響 pH對杜仲葉多糖得率的影響見圖2。隨著pH的增大,杜仲葉多糖得率先快速上升,然后急速下降,在pH為4.0時達(dá)到最大值4.21%±0.04%。pH能改變酶的構(gòu)象和影響酶的生物活性[23],不同種類的酶有各自最適作用pH,但在復(fù)合使用時,各類酶對某一特定底物的綜合作用效果最大時為該復(fù)合酶的最佳pH。圖2顯示,pH4.0是復(fù)合酶的最佳pH。此外,有研究顯示酶輔助提取法對果膠酶有很大的依賴性,而果膠酶的最適作用pH為4.0[24]。故確定pH4.0作為最適pH。

圖2 pH對多糖得率的影響Fig.2 Effects of pH on the yield of polysaccharide

2.1.3 提取溫度對杜仲葉多糖得率的影響 提取溫度對杜仲葉多糖得率的影響見圖3。當(dāng)提取溫度從35 ℃升高到45 ℃時,杜仲葉多糖的得率迅速提高,然后隨著溫度的進(jìn)一步升高而降低,在45 ℃時達(dá)到最大值4.37%±0.03%。溫度的升高會提高酶的活性和分子運(yùn)動,加速細(xì)胞內(nèi)多糖的釋放和溶劑的進(jìn)入[25],但溫度過高則會使酶變性,酶活降低[26],從而導(dǎo)致多糖得率下降。

圖3 提取溫度對多糖得率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on the yield of polysaccharide

2.1.4 超聲波功率對杜仲葉多糖得率的影響 超聲波功率對杜仲葉多糖得率的影響見圖4。多糖得率隨著超聲波功率的增大先緩慢上升然后下降,在100 W時達(dá)到最大值4.49%±0.02%。這是因為超聲波產(chǎn)生的空洞效應(yīng)和振動可以促進(jìn)細(xì)胞破碎,有利于多糖的溶解和擴(kuò)散,但是過高的功率可能會導(dǎo)致多糖降解[27]。因此,100 W被選為最佳超聲波功率。

圖4 超聲波功率對多糖得率的影響Fig.4 Effects of ultrasonic power on the yield of polysaccharide

2.1.5 液料比對杜仲葉多糖得率的影響 液料比對杜仲葉多糖得率的影響見圖5。隨著液料比的增加,杜仲葉多糖的得率增加,在20∶1 mL/g時達(dá)到最大值4.60%±0.03%。這是因為較大的液料比可以提高溶劑在細(xì)胞中的擴(kuò)散速率,并從材料中溶解更多的多糖[28-29]。而當(dāng)液料比大于20∶1 mL/g時多糖得率反而下降,這可能是因為酶與底物接觸機(jī)會降低,細(xì)胞壁降解減慢所致。考慮到提取效率和后繼濃縮的成本,液料比選擇20∶1 mL/g為宜。

圖5 液料比對多糖得率的影響Fig.5 Effects of ratio of liquid to solid on the yield of polysaccharide

2.1.6 提取時間對杜仲葉多糖得率的影響 提取時間對杜仲葉多糖得率的影響見圖6。杜仲葉多糖的得率隨著提取時間的延長而上升,在15 min達(dá)到最大值4.72%±0.03%,超過15 min得率下降。溶劑的滲入以及多糖的溶出都需要一定時間,但提取時間過長可能會導(dǎo)致多糖遭到超聲波的破壞,影響多糖得率[30]。因此選擇最佳提取時間為15 min。

圖6 提取時間對多糖得率的影響Fig.6 Effects of extraction time on the yield of polysaccharide

2.2 Plackett-Burman實驗結(jié)果

Plackett-Burman實驗結(jié)果及各因素的效應(yīng)評價如表3、表4所示。

表3 Plackett-Burman實驗結(jié)果Table 3 Results of Plackett-Burman experiment

由表4可知,影響多糖得率的顯著因素為復(fù)合酶添加量、pH和超聲波功率,根據(jù)其P值大小可知重要性依次為:pH(B)>超聲波功率(D)>復(fù)合酶添加量(A),其中pH對杜仲葉多糖得率的影響達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。提取溫度、液料比和提取時間為非顯著影響因素,故選擇pH、超聲波功率和復(fù)合酶添加量開展下一步的響應(yīng)面優(yōu)化實驗?？紤]到提取效率與節(jié)約成本,在響應(yīng)面優(yōu)化實驗中將提取溫度、液料比和提取時間分別固定為45 ℃、20∶1 mL/g和15 min。

表4 Plackett-Burman實驗各因素效應(yīng)評價Table 4 Effect evaluation of factors of Plackett-Burman experiment

2.3 最陡爬坡實驗結(jié)果

對表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得到一次擬合方程:Y=0.031042+0.001258A-0.002508B+0.000792C-0.001475D+0.000825E+0.000425F。根據(jù)該擬合方程中各因素的系數(shù)設(shè)計最陡爬坡實驗的方向,系數(shù)如果為正值,爬坡實驗中各因素水平值為由小變大,反之,則由大變小。步長根據(jù)單因素實驗結(jié)果進(jìn)行設(shè)計。表5為最陡爬坡實驗設(shè)計與結(jié)果。結(jié)果表明表5中第4號實驗的多糖得率最大,故選擇第4號實驗中的實驗條件作為后面Box-Behnken實驗的0水平。

表5 最陡爬坡實驗結(jié)果Table 5 Results of steepest climb experiment

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面實驗結(jié)果

Box-Behnken響應(yīng)面實驗結(jié)果見表6。

表6 Box-Behnken響應(yīng)面實驗結(jié)果Table 6 Results of Box-Behnken experiment

對實驗結(jié)果進(jìn)行回歸擬合,得到顯著影響杜仲葉多糖得率(Y)因素的二元回歸方程:

Y=-0.6+0.58475A+0.054625B+0.75475C+4.125×10-3AB-1.70553×10-6AC+4.125×10-3BC-0.122A2-4.3625×10-4B2-0.157C2

表7 回歸模型方差分析結(jié)果Table 7 Results of variance analysis of response surface quadratic model

將一個因素固定在0水平,其余兩因素間交互作用對多糖得率影響的響應(yīng)面圖見圖7。圖7(A)和圖7(C)的響應(yīng)面坡度較陡,說明pH與超聲波功率、超聲波功率與復(fù)合酶添加量間交互作用顯著,而圖7(B)的響應(yīng)面坡度較前面兩個小,即pH與復(fù)合酶添加量間交互作用不顯著。

圖7 兩因素間交互作用響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plots of interaction between two factors

3 結(jié)論

本實驗對超聲波-協(xié)同酶法提取杜仲葉多糖工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,通過Plackett-Burman實驗篩選出三個顯著影響多糖得率的因素:pH、超聲波功率和復(fù)合酶添加量,其重要性依次為:pH>超聲波功率>復(fù)合酶添加量。超聲波-協(xié)同酶法提取杜仲葉多糖的最佳工藝條件為復(fù)合酶添加量3.7%、pH4.0、超聲波功率100 W、提取溫度45 ℃、液料比20∶1 mL/g和提取時間15 min,在此條件下杜仲葉多糖的實際得率為4.79%±0.02%,與理論得率4.87%接近,且得率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的水浸提法。研究結(jié)果表明,與傳統(tǒng)提取方法相比,超聲波-協(xié)同酶法輔助提取法能高效提取杜仲葉多糖,有利于降低生產(chǎn)成本,對杜仲葉多糖的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。但是,超聲波物理場作用下的生產(chǎn)規(guī)模如何放大、如何通過酶的篩選進(jìn)一步提高提取效率等問題還有待進(jìn)一步的研究。