板栗種仁多糖的提取純化及體外抗腫瘤活性篩選

何俊平,李曉菁,孟 迪,宋磊肖,楊越冬,牛 奎(河北科技師范學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院,河北省天然產(chǎn)物活性成分與功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北秦皇島 066004)

天然多糖是一類結(jié)構(gòu)多樣的生物大分子,也是生物體內(nèi)重要的結(jié)構(gòu)材料和能量?jī)?chǔ)存單元。近幾十年來,由不同植物、動(dòng)物和微生物中分離出的多糖在抗氧化[1]、抗凝血[2]、抗腫瘤[3]和刺激免疫[4]等方面表現(xiàn)出的藥理學(xué)活性正逐漸引起關(guān)注。其中,香菇多糖[5]、云芝多糖[6]和裂褶菌多糖[7]等食用菌多糖已經(jīng)在體外、體內(nèi)和臨床試驗(yàn)中體現(xiàn)出顯著的抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)功效,相關(guān)的抗癌藥物也已在國(guó)內(nèi)外上市。而且多糖的來源也是促成其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的一個(gè)不可或缺的因素,因此發(fā)掘一種資源豐富、廉價(jià)易得且具有突出抗腫瘤生物活性的多糖將對(duì)抗癌天然藥物領(lǐng)域的開發(fā)和應(yīng)用產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。

作為山毛櫸科栗屬植物的典型代表,板栗(CastaneamollissimaBlume)含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和氨基酸等可供人體吸收和利用的營(yíng)養(yǎng)成分,是我國(guó)最重要的干果和木本糧食作物之一。不僅如此,板栗還具有良好的保健功能和藥用價(jià)值。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為多食板栗種仁可益氣健脾、補(bǔ)腎強(qiáng)筋、活血消腫,而板栗總苞、花、葉,以及栗樹皮和栗樹根常被民間用來治療折傷腫痛、反胃、泄瀉、凜癰等常見癥狀。目前,已有研究表明板栗不同植物組織中含有的小分子多酚類物質(zhì)具有抗氧化[8]、抗菌[9]、抗病毒[10]、抗腫瘤[11]、降血糖和降血脂[12]等生物活性。借助超聲輔助法提取的板栗多糖被證實(shí)具有優(yōu)異的抗氧化活性[13]和酪氨酸酶抑制活性[14],以熱水法提取的板栗多糖被證實(shí)具有抗疲勞作用[15]和促進(jìn)小鼠白細(xì)胞增長(zhǎng)的作用[16],而以亞臨界萃取法提取的板栗多糖具有較強(qiáng)的自由基清除活性[17]。

燕山板栗隸屬于我國(guó)的華北品種群,有著歷史悠久、栽培面積廣、總產(chǎn)量大的特點(diǎn),已成為燕山地區(qū)農(nóng)民增收的重要支柱產(chǎn)業(yè)。燕山板栗的種仁以其肉質(zhì)細(xì)膩、風(fēng)味香甜、糯性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)享譽(yù)國(guó)內(nèi)外。然而目前市場(chǎng)上的相關(guān)產(chǎn)品仍以糖炒板栗和板栗果脯為主,板栗產(chǎn)業(yè)面臨著精深加工產(chǎn)品少、產(chǎn)品附加值低的發(fā)展瓶頸。本研究擬采用加壓溶劑萃取法提取燕山板栗種仁中的多糖,優(yōu)化提取工藝并對(duì)多糖進(jìn)行性質(zhì)表征和抗腫瘤活性篩選。研究旨在發(fā)掘燕山板栗種仁多糖的生物活性,為實(shí)現(xiàn)燕山板栗在保健食品和特效藥物領(lǐng)域的高質(zhì)化利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

燕山“遵玉”板栗 采自河北省秦皇島市青龍滿族自治縣,經(jīng)過人工剝皮后,得到的栗仁于60 ℃充分干燥,再經(jīng)粉碎機(jī)細(xì)碎,將板栗粉過60目篩,置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆?AB-8大孔吸附樹脂 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;DEAE-52纖維素樹脂 英國(guó)Whatman公司;葡聚糖分子量標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)APSC公司;單糖分析標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma-Aldrich公司;BEL-7402人肝癌細(xì)胞株 美國(guó)ATCC細(xì)胞庫;HCT-116人結(jié)腸癌細(xì)胞株、HepG2人肝癌細(xì)胞株、BGC-823人胃癌細(xì)胞株、NCI-H1650人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株、A2780人卵巢癌細(xì)胞株、HL-60人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株、A-549人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心;實(shí)驗(yàn)用水(Milli-Q超純水) 美國(guó)Milli-Q Biocel系統(tǒng)制備;其他試劑(分析純) 梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

APLE-3000全自動(dòng)加壓溶劑萃取儀(配有100 mL萃取池) 北京吉天儀器有限公司;N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化器械株式會(huì)社;ALPHA 2-4 LD plus冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Marin Christ公司;UV-5500紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;SU8010場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司;TENSOR27傅立葉變換紅外光譜儀 德國(guó)Bruker公司;Agilent 1260 infinity高效液相色譜系統(tǒng)(配有示差折光檢測(cè)器) 美國(guó)Agilent公司;ICS-5000離子色譜系統(tǒng)(配有脈沖安培檢測(cè)器) 美國(guó)Thermo Fisher公司;PowerWave XS2全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 板栗種仁多糖的提取 將一定質(zhì)量的板栗粉與等體積的硅藻土混合,然后將混合物裝入100 mL不銹鋼萃取池中,用硅藻土填滿萃取池后置入加壓溶劑萃取儀。以水為溶劑,設(shè)定不同的提取溫度、壓力、時(shí)間和靜態(tài)萃取循環(huán)次數(shù)。萃取完成后將萃取液離心、過濾并記錄澄清液體積,將澄清液稀釋一定倍數(shù)后采用苯酚-硫酸法[18-19]測(cè)定粗提物中多糖的含量。配制11個(gè)濃度梯度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度范圍:0～0.1 mg/mL),得到多糖質(zhì)量濃度ρ和490 nm處吸光度(OD)值的線性回歸曲線,其方程為OD490 nm=7.7582ρ-0.0035,R2=0.9992。多糖的得率計(jì)算如下:

式中:Y表示多糖的得率,%;C表示對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的多糖質(zhì)量濃度,mg/mL;V表示澄清液體積,mL;N表示澄清液稀釋倍數(shù);m表示所稱取板栗粉的質(zhì)量,mg。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 以多糖的得率為指標(biāo),分別考查萃取投料量、萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間和循環(huán)次數(shù)五個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響。固定萃取溫度為60 ℃,萃取時(shí)間為8 min,萃取壓力為6 MPa,循環(huán)次數(shù)為3次,考察投料量(5、10、15、20、25 g)對(duì)多糖得率的影響;固定投料量為10 g,萃取溫度為60 ℃,萃取時(shí)間為8 min,萃取壓力為6 MPa,考查循環(huán)次數(shù)(1、2、3、4、5、6)對(duì)多糖得率的影響;固定投料量為10 g,萃取時(shí)間為8 min,萃取壓力為6 MPa,循環(huán)次數(shù)為3次,考查萃取溫度(40、50、60、70、80 ℃)對(duì)多糖得率的影響;固定投料量為10 g,萃取溫度為60 ℃,萃取壓力為6 MPa,循環(huán)次數(shù)為3次,考查萃取時(shí)間(4、6、8、10、12 min)對(duì)多糖得率的影響;固定投料量為10 g,萃取時(shí)間為8 min,萃取溫度為60 ℃,循環(huán)次數(shù)為3次,考查萃取壓力(4、5、6、7、8 MPa)對(duì)多糖得率的影響。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果、實(shí)際提取效率和原料利用率,固定萃取投料量為10 g、循環(huán)次數(shù)為3次,以多糖得率Y為響應(yīng)值,選擇萃取溫度(A)、萃取時(shí)間(B)和萃取壓力(C)為自變量,應(yīng)用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)。分別以-1、0、1來表示低、中、高3水平,每個(gè)因素的最優(yōu)條件作為中心點(diǎn),響應(yīng)面因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 板栗種仁多糖的純化 按照響應(yīng)面試驗(yàn)得到的最佳提取條件提取板栗種仁粗多糖。多糖的純化參考文獻(xiàn)[20]的方法并做適當(dāng)改進(jìn)。將粗多糖溶液與Sevag試劑(三氯甲烷∶正丁醇=4∶1,V/V)按1∶1的體積比在分液漏斗中混合、振蕩,靜置分層后除去變性蛋白和有機(jī)層,再加入與水層體積相同的Sevag試劑,反復(fù)多次,直至沒有蛋白沉淀出現(xiàn)為止。將上清液濃縮后,加入4倍體積的95%乙醇沉淀多糖,收集后經(jīng)冷凍干燥得到脫蛋白多糖。將脫蛋白多糖溶解于少量水中,以水為洗脫劑利用AB-8大孔吸附樹脂去除多糖中的色素,流速設(shè)定為1.0 BV/h,5.0 mL/管收集洗脫液并借助苯酚-硫酸法檢測(cè)各管多糖含量。將含有多糖的洗脫液合并、濃縮,用水反復(fù)透析并冷凍干燥,得到純化多糖。

1.2.5 YCP-H的分級(jí)制備 多糖的分級(jí)參考文獻(xiàn)[21]的方法并做適當(dāng)改進(jìn)。將純化多糖配成1.0 mg/mL的溶液,過0.45 μm濾膜后利用高效體積排阻色譜(HPSEC)分析多糖的分子量分布。葡聚糖標(biāo)樣:DXT3K、DXT20K、DXT102K、DXT300K、DXT1185K、DXT2500K和DXT5900K;色譜柱:Agilent PL aquagel-OH MIXED-H柱(300 mm×7.5 mm,8 μm,測(cè)量范圍:6～10,000 kDa);上樣量:20 μL;流動(dòng)相:水;流速:0.8 mL/min;柱溫:35 ℃。根據(jù)純化多糖分子量分布的測(cè)定結(jié)果,利用制備型高效體積排阻色譜(prep HPSEC)對(duì)多糖進(jìn)行分級(jí)。色譜柱:Agilent PL aquagel-OH MIXED-H column(300 mm×25 mm,8 μm);上樣量:200 μL;流動(dòng)相:水;流速:9.0 mL/min;柱溫:35 ℃。將高分子量組分合并收集、濃縮,經(jīng)冷凍干燥后得到白色絮狀多糖YCP-H。

1.2.6 板栗種仁多糖的理化性質(zhì)分析

1.2.6.1 掃描電鏡(SEM)觀察多糖形貌 將多糖粉末均勻涂覆在貼有雙面碳導(dǎo)電膠帶的電鏡進(jìn)樣臺(tái)上,真空條件下噴金處理后利用SEM進(jìn)行觀察。放大倍數(shù):500倍;加速電壓:10.0 kV。

1.2.6.2 紅外光譜(FTIR)分析 取1 mg多糖樣品與100 mg KBr粉末在研缽中混勻研磨,置于模具內(nèi)壓成1 mm厚透明薄片后測(cè)試。掃描范圍:500～4000 cm-1;掃描間隔:2 cm-1。

1.2.7 板栗種仁多糖的單糖組成分析

1.2.7.1 樣品的水解 取5 mg樣品加入1 mL 2 mol/L的三氟乙酸溶液,于120 ℃水解2 h。冷卻后通入氮?dú)獯蹈?加入2 mL甲醇清洗,再吹干。重復(fù)清洗3次后加入1 mL水溶解,轉(zhuǎn)入色譜瓶中待測(cè)。

1.2.7.2 標(biāo)準(zhǔn)母溶液的配制 取巖藻糖(Fuc)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、果糖(Fru)、核糖(Rib)標(biāo)準(zhǔn)品各100 mg溶解于8 mL水中,然后定容至10 mL,配制成10 mg/mL的混標(biāo)母液。將母液稀釋100倍后,再梯度稀釋至1、5、10、20、30、40、50、60 μg/mL。

1.2.7.3 測(cè)定方法 利用高效陰離子交換色譜-脈沖安培法(HPAEC-PAD)檢測(cè)樣品的單糖組成和含量,根據(jù)色譜峰的保留時(shí)間對(duì)單糖組成進(jìn)行定性,外標(biāo)法定量。離子色譜條件:色譜柱:DionexTMCarboPacTMPA20(150 mm×3 mm);檢測(cè)器:脈沖安培檢測(cè)器;電極:金電極;進(jìn)樣量:20 μL;流動(dòng)相:H2O,0.1 mol/L NaOH,0.1 mol/L NaOH/0.2 mol/L NaAC;流速:0.5 mL/min;柱溫:30 ℃;數(shù)據(jù)分析:Chromeleon 7.2色譜工作站。

1.2.8 體外抗腫瘤活性篩選

1.2.8.1 細(xì)胞培養(yǎng) 腫瘤細(xì)胞株用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(含青霉素100 U/mL,鏈霉素100 μg/mL)于37 ℃、含5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.8.2 MTT法細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞株制備細(xì)胞混懸液,顯微計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度,按1×103個(gè)/孔接種到96孔板,在37 ℃培養(yǎng)24 h。移除培養(yǎng)液,以PBS緩沖液沖洗3次。設(shè)置藥物組(樣品濃度分別為0.1、1、10、100和1000 μg/mL的系列溶液)、空白對(duì)照組(只加培養(yǎng)基)和陽性藥對(duì)照組(紫杉醇濃度分別為0.1、1、10、100和1000 μg/mL的系列溶液)。在96孔板中分別加入各組溶液,每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)。將各組樣品置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)96 h,棄去培養(yǎng)液,然后加入100 μL 0.4 mg/mL的MTT溶液,繼續(xù)孵育4 h。移除上清液,每孔加入150 μL二甲基亞砜,溫和振蕩10 min后用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處的OD值。采用下式計(jì)算各組抑制率(I):

式中:ODs表示藥物組或陽性藥對(duì)照組OD值的平均值;ODc表示空白對(duì)照組OD值的平均值。利用SPSS軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果取三次平行實(shí)驗(yàn)的平均值,數(shù)據(jù)表示為Mean±SD。響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行二次回歸分析及方差分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.0001表示差異高度顯著。采用SPSS 21.0和Origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 投料量對(duì)多糖得率的影響 如圖1所示,板栗種仁多糖的得率隨板栗粉投料量的增加呈總體下降趨勢(shì),當(dāng)投料量大于15 g時(shí)下降明顯。這是由于萃取池體積固定,投料量的增大會(huì)降低水料比,當(dāng)可溶性多糖在水中達(dá)到飽和后,溶劑的減少會(huì)導(dǎo)致多糖提取不徹底。綜合提取效率和原料的利用率,選取板栗粉的投料量為10 g進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖1 投料量對(duì)板栗種仁多糖得率的影響Fig.1 Effect of the amount of raw materials on the yield of polysaccharides in chestnut kernel

2.1.2 循環(huán)次數(shù)對(duì)多糖得率的影響 循環(huán)次數(shù)對(duì)多糖得率的影響見圖2,循環(huán)次數(shù)由1次增加至3次可以使多糖得率由14.31%大幅升至19.08%,而繼續(xù)增加循環(huán)次數(shù)對(duì)得率影響不大,結(jié)合實(shí)際提取效率選定循環(huán)次數(shù)為3次。

圖2 循環(huán)次數(shù)對(duì)板栗種仁多糖得率的影響Fig.2 Effect of cycle times on the yield of polysaccharides in chestnut kernel

2.1.3 萃取溫度對(duì)多糖得率的影響 如圖3所示,多糖得率隨萃取溫度的升高先增加后減小。當(dāng)溫度為60 ℃時(shí),多糖得率達(dá)到試驗(yàn)最大值。這是因?yàn)檫m當(dāng)升高溫度能夠提高傳質(zhì)速度并且增加多糖的溶解度,而溫度過高可能導(dǎo)致多糖的降解,從而降低了多糖的浸出率[22-23]。

圖3 萃取溫度對(duì)板栗種仁多糖得率的影響Fig.3 Effect of extracting temperature on the yield of polysaccharides in chestnut kernel

2.1.4 萃取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 圖4給出了萃取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響,萃取時(shí)間4～8 min內(nèi)對(duì)多糖得率影響較大,隨提取時(shí)間延長(zhǎng),多糖得率顯著增加(P<0.05),而萃取時(shí)間8～12 min內(nèi)多糖得率隨時(shí)間增加呈現(xiàn)減小的趨勢(shì)。分析原因可能是萃取時(shí)間的適當(dāng)延長(zhǎng)有利于多糖的充分溶出,但提取時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)引起多糖降解,使得多糖得率出現(xiàn)下降[24-25]。

圖4 萃取時(shí)間對(duì)板栗種仁多糖得率的影響Fig.4 Effect of extracting time on the yield of polysaccharides in chestnut kernel

2.1.5 萃取壓力對(duì)多糖得率的影響 從圖5中可以看出,提高萃取壓力使多糖得率先增加后減小,壓力為6 MPa時(shí)達(dá)到最大值。這是由于壓力的提升能提升溶劑分子對(duì)板栗種仁細(xì)胞壁的破壞作用,同時(shí)增大多糖的溶解度,而過高的壓力會(huì)致使種仁微粉聚集,減小其與溶劑接觸的比表面積,從而降低多糖的得率[26-27]。

圖5 萃取壓力對(duì)板栗種仁多糖得率的影響Fig.5 Effect of extracting pressure on the yield of polysaccharides in chestnut kernel

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)進(jìn)行17組試驗(yàn),對(duì)應(yīng)多糖得率Y的試驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值見表2。利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析,并對(duì)各因素進(jìn)行回歸擬合后,得到多糖得率對(duì)萃取溫度(A)、萃取時(shí)間(B)和萃取壓力(C)的三元二次回歸方程:Y=19.72+0.18A+1.04B-0.46C-0.21AB+0.25AC+0.062BC-1.49A2-2.08B2-2.78C2

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的自變量水平與對(duì)應(yīng)的多糖得率Table 2 Variable levels of Box-Behnken design and the response values for the extraction yield of polysaccharides

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

由模型方程得到的響應(yīng)曲面和等高線圖能夠直觀反映各因素及其交互作用對(duì)最終響應(yīng)值的影響。圖6分別展示了萃取壓力、萃取時(shí)間和萃取溫度位于中心水平時(shí),其他兩因素的交互作用對(duì)多糖得率的影響。由圖6可知,多糖得率隨其他兩因素的增加都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),即均存在與方程極大值對(duì)應(yīng)的響應(yīng)面最高點(diǎn)。與圖6c相比,圖6a和圖6b中響應(yīng)曲面的坡度相對(duì)較緩,說明與萃取時(shí)間和萃取壓力的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響相比,萃取時(shí)間與萃取溫度、萃取壓力與萃取溫度的交互作用對(duì)多糖得率的影響相對(duì)較小[28-29]。從圖6a和圖6b中沿坐標(biāo)軸的等高線密度可知,沿萃取時(shí)間和萃取壓力軸向等高線的密度均比沿溫度軸向等高線的密度大,同樣說明萃取溫度的變化對(duì)多糖得率的影響相對(duì)較小[30-31]。而圖6c中沿時(shí)間軸向等高線的密度比沿壓力軸向等高線的密度大,說明與萃取壓力相比,萃取時(shí)間的變化對(duì)多糖得率的影響較大。由響應(yīng)面和等高線圖所得結(jié)論與表3一致。

圖6 不同因素相互作用對(duì)板栗種仁多糖得率的響應(yīng)曲面和等高線Fig.6 Response surfaces and contours showing the interactive effects of different factors on yield of polysaccharides in chestnut kernel

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化預(yù)測(cè),得到提取板栗種仁多糖的最佳工藝參數(shù)為:萃取溫度60.68 ℃、萃取時(shí)間8.98 min、萃取壓力5.84 MPa,對(duì)應(yīng)多糖得率的最大預(yù)測(cè)值為19.87%。考慮到儀器設(shè)備的可操作性,將最佳提取工藝參數(shù)調(diào)整為:萃取溫度60 ℃、萃取時(shí)間9 min、萃取壓力6 MPa。在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),得到的多糖得率為19.78%±0.27%,與模型預(yù)測(cè)值較接近。與其他提取方法相比,加壓溶劑提取法有著較高的多糖得率[32-33],這可能是由于高壓條件提高了水對(duì)細(xì)胞的穿透力和破壞力,加速水分子突破板栗種仁細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu),從而有效加快多糖的釋放。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析的結(jié)果表明,借助該響應(yīng)面模型優(yōu)化得到的提取參數(shù)基本準(zhǔn)確可靠,對(duì)實(shí)際應(yīng)用具有較高的參考價(jià)值。

2.3 分子量的測(cè)定

在最佳工藝參數(shù)下提取板栗種仁粗多糖,經(jīng)過去蛋白、脫色素、透析后得到純化多糖。圖7給出了純化多糖的HPSEC洗脫曲線以及葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(重均分子量Mw分別為3.65,20.1、102、291.6、1185、2500、5900 kDa)的標(biāo)準(zhǔn)矯正曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間(t)及Mw,以lg Mw對(duì)t作圖,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程lg Mw=-0.9388t+13.3165,其中R2=0.9950,表明葡聚糖對(duì)照品的Mw在3.65～5900 kDa的范圍內(nèi)與t呈良好的線性關(guān)系。由樣品的HPSEC洗脫曲線可知,板栗種仁純化多糖的分子量分布較寬,最高分子量大于5900 kDa,這可能是由于與傳統(tǒng)的熱水提取、酸堿提取等方法相比,加壓溶劑萃取法的條件相對(duì)溫和,可以有效地避免板栗種仁中高分子量多糖的降解,因此能夠最大限度地萃取各水溶性多糖組分[34]。在標(biāo)準(zhǔn)曲線的可測(cè)范圍內(nèi)檢測(cè)到t1=7.86 min與t2=9.85 min兩個(gè)主要的多糖峰,響應(yīng)信號(hào)最大值對(duì)應(yīng)的Mw分別為866和12 kDa。依據(jù)HPSEC的測(cè)定結(jié)果,實(shí)驗(yàn)借助prep HPSEC對(duì)純化多糖進(jìn)行分級(jí),收集t在6.97～8.50 min內(nèi)的高分子量多糖級(jí)分,冷凍干燥后制備YCP-H。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算可得YCP-H的Mw分布范圍為217～5900 kDa。

圖7 HPSEC的標(biāo)準(zhǔn)矯正曲線和板栗種仁純化多糖的HPSEC洗脫曲線Fig.7 Standard calibration curve of HPSEC and the HPSEC elution profile of the purified polysaccharides in chestnut kernel

2.4 微觀形貌分析

將板栗種仁多糖在不同純化階段所得到的樣品進(jìn)行掃描電鏡觀察,放大500倍后的電鏡照片見圖8。由圖8a可以看出,粗多糖由大量形態(tài)不規(guī)則、尺寸不均一的顆粒組成,顆粒間有著明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象。圖8b顯示,經(jīng)過去蛋白、脫色素和透析后的純化多糖顆粒尺寸相對(duì)均一,且團(tuán)聚現(xiàn)象減輕。相比之下,圖8c則表明樣品YCP-H中存在大量的纖維狀聚集態(tài)結(jié)構(gòu),部分纖維顆粒的長(zhǎng)度可以達(dá)到100 μm以上。

圖8 板栗種仁多糖的掃描電鏡照片(500×)Fig.8 SEM photographs of polysaccharides in chestnut kernel(500×)注:a:粗多糖;b:純化多糖;c:YCP-H(板栗多糖的高分子量組分)。

2.5 紅外光譜測(cè)試

圖9所示為樣品YCP-H的紅外光譜。YCP-H具有典型的多糖特征吸收峰,其中,位于3388 cm-1處較寬的吸收帶代表多糖中O-H的伸縮振動(dòng),位于2934和1418 cm-1處的吸收峰分別來自于多糖中C-H的伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)[35]。位于1616 cm-1處較尖銳的吸收峰對(duì)應(yīng)于羧基中C=O的不對(duì)稱伸縮振動(dòng),同時(shí)1366 cm-1處出現(xiàn)了質(zhì)子化羧基中C-O的伸縮振動(dòng)峰,1262 cm-1處出現(xiàn)了羧基中O-H的彎曲振動(dòng)峰,證實(shí)了多糖中糖醛酸的存在。在800～1200 cm-1的多糖指紋區(qū),1046 cm-1處的吸收峰來自于糖苷鍵中C-O的伸縮振動(dòng),而1018 cm-1處的吸收峰則對(duì)應(yīng)吡喃糖環(huán)中C-O-C的特征吸收。光譜中在926 cm-1處出現(xiàn)了吡喃糖β-端基差向異構(gòu)的C-H變角振動(dòng)峰,在770 cm-1處則出現(xiàn)了吡喃環(huán)的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰,由此可以判斷YCP-H中含有β-吡喃糖苷鍵[36]。此外,位于866和814 cm-1處的吸收峰與甘露糖的特征吸收一致[37],而616 cm-1處的吸收峰對(duì)應(yīng)O-H的面外彎曲振動(dòng),550 cm-1處的吸收峰來自C-C-O的彎曲振動(dòng)。YCP-H的紅外光譜證實(shí)了該多糖是具有β-吡喃構(gòu)型的酸性多糖,單糖組成中可能含有甘露糖。

圖9 YCP-H的紅外光譜圖Fig.9 FTIR spectrum of YCP-H

2.6 單糖組成測(cè)試

將YCP-H在酸性條件下水解后,利用HPAEC-PAD法分析該多糖的單糖組成,標(biāo)樣和所測(cè)樣品的色譜曲線見圖10。通過對(duì)比YCP-H和標(biāo)樣的保留時(shí)間,可知YCP-H中含有6種單糖,分別為巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖。定量分析得到上述單糖的摩爾比分別為1.00∶36.06∶34.93∶15.12∶10.05∶3.16。結(jié)果表明,YCP-H主要由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖組成,另外含有少量的巖藻糖和甘露糖。

圖10 YCP-H的單糖組成及含量Fig.10 Composition and content of monosaccharide in YCP-H

2.7 體外抗腫瘤活性篩選

利用MTT法測(cè)試YCP-H對(duì)8種腫瘤細(xì)胞株的體外抗腫瘤活性。在培養(yǎng)時(shí)間為96 h的條件下,不同濃度YCP-H對(duì)8種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率影響見圖11a。由圖11a可知,YCP-H對(duì)8種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用均隨著濃度的升高而增強(qiáng),體現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。在1000 μg/mL的較高濃度時(shí),YCP-H對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率達(dá)到了94.5%,對(duì)其他腫瘤細(xì)胞的抑制率也超過了36%,顯示出一定程度的廣譜抗腫瘤效果。當(dāng)濃度為0.1 μg/mL時(shí),YCP-H僅對(duì)HCT-116人結(jié)腸癌細(xì)胞、HepG2人肝癌細(xì)胞和A-549人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞具有良好的體外抗腫瘤活性。以濃度對(duì)細(xì)胞的抑制率作圖可得到劑量反應(yīng)曲線,從中求出YCP-H對(duì)上述3種腫瘤細(xì)胞的IC50值分別為15.1、0.08和17.1 μg/mL。對(duì)照組紫杉醇對(duì)8種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率見圖11b,其對(duì)上述3種腫瘤細(xì)胞的IC50值分別為0.04、0.03和0.04 μg/mL。結(jié)果顯示,YCP-H對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞的增殖抑制活性接近紫杉醇,并且YCP-H對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116和肺癌細(xì)胞A-549的增殖也有較強(qiáng)的抑制作用。

圖11 不同濃度YCP-H和紫杉醇對(duì)8種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率Fig.11 Inhibition rates against growth of 8 kinds tumor cell lines with YCP-H and taxol at different concentrations注:a. YCP-H(藥物組);b. 紫杉醇(對(duì)照組)。

3 結(jié)論

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析,優(yōu)化得到了加壓溶劑萃取法提取板栗種仁多糖的工藝條件。當(dāng)投料量為10 g,靜態(tài)提取次數(shù)為3次時(shí),設(shè)置溫度為60 ℃、時(shí)間為9 min、壓力為6 MPa,多糖得率可高達(dá)19.78%±0.27%。高壓條件可以加速水分子對(duì)板栗種仁細(xì)胞壁的破壞作用,加快多糖釋放的同時(shí)增大多糖的溶解度,因此多糖得率較高。板栗粗多糖經(jīng)純化、分級(jí)后,其高分子量組分YCP-H的重均分子量范圍為217～5900 kDa,說明加壓溶劑萃取法的提取條件相對(duì)溫和,可以有效避免高分子量多糖的降解。

YCP-H是具有β-吡喃構(gòu)型的酸性多糖,由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和巖藻糖6種單糖組成,物質(zhì)的量比依次為1.00∶36.06∶34.93∶15.12∶10.05∶3.16。板栗粗多糖和純化多糖由形態(tài)不規(guī)則的顆粒組成,而YCP-H中存在大量的纖維狀聚集體,推測(cè)分級(jí)前后的多糖樣品在溶液中有著不同的聚集態(tài)結(jié)構(gòu)。YCP-H在較高濃度時(shí)顯示出一定程度的廣譜抗腫瘤效果,在低濃度時(shí)對(duì)A-549人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞、HepG2人肝癌細(xì)胞和HCT-116人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用。其中,YCP-H對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞的IC50值可低至0.08 μg/mL,其活性接近陽性藥紫杉醇。

本研究首次發(fā)現(xiàn)了燕山板栗多糖的抗腫瘤活性,為增加燕山板栗產(chǎn)品的附加值、延長(zhǎng)燕山板栗食品加工的鏈條化、實(shí)現(xiàn)燕山板栗的高質(zhì)化利用奠定了基礎(chǔ)。然而,板栗的品種多樣,板栗種仁多糖的結(jié)構(gòu)、抗腫瘤活性與具體品種是否相關(guān)還需要進(jìn)行進(jìn)一步拓展研究。另一方面,多糖抗腫瘤作用的構(gòu)效關(guān)系較為復(fù)雜,板栗種仁多糖的糖苷鍵連接方式、糖鏈分支度乃至聚集形態(tài)等結(jié)構(gòu)特征還需要進(jìn)一步解析。