Ghrelin早期干預改善急性心肌梗死后心肌重構和心臟功能

梅 勇，孫 楠，邢 文，王德國,劉銀華，劉表虎，呂 坤

[皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院(弋磯山醫(yī)院)1.老年醫(yī)學科、2. 病理科、3. 影像超聲科，4.安徽省高校非編碼RNA轉(zhuǎn)化研究重點實驗室(中心實驗室)，安徽 蕪湖 241001]

心肌梗死(myocardial infarction，MI)不能及時再灌注可導致慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)，在此過程中心交感神經(jīng)過度興奮起非常重要的作用。交感神經(jīng)遞質(zhì)能夠與心肌細胞β腎上腺素受體(β-adrenergic receptors，β-AR)結合產(chǎn)生心臟毒性，如心肌細胞增生和心臟重構1。CHF不但引起特定基因表達如心鈉肽(atrial natriuretic peptide，ANP)和腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)，也造成心肌細胞膜β腎上腺素受體表達改變[1- 2]。

Ghrelin是一種28個氨基酸多肽，首次發(fā)現(xiàn)在大鼠的胃細胞中。Ghrelin受體生長激素促分泌素受體(GHSR-1a)分布廣泛，參與多種病理生理功能[3]。研究表明補充外源性Ghrelin可以抑制交感神經(jīng)活性[4]，提高迷走神經(jīng)興奮性[4-5]，改善心肌缺血[6]，降低多種心肌損傷模型動物的死亡率[7]。因此，Ghrelin有可能減輕心肌缺血并防止其進展為CHF。在本研究中，我們首先建立MI模型，并早期使用合成的外源性Ghrelin連續(xù)干預，評價其對缺血大鼠心交感神經(jīng)活性以及左心室心肌細胞肥大、心肌纖維化、心肌細胞膜β腎上腺素受體表達的影響，從而探索心力衰竭治療的新途徑。

1 方法

1.1 實驗動物及分組30只SD大鼠，體質(zhì)量(180～210) g，♂,(南京青龍山實驗動物中心，許可證號為：SCXK2018-0001)隨機分成3組：假手術組(Sham組，n=6)；心肌梗死組(MI，n=12)；心肌梗死 + Ghrelin組(MI+Ghrelin組，n=12)。Ghrelin購自于上海生物多肽公司，合成序列：GSS(octanoyl)FLSPEHQRVQQRKESK KPPAKLQP。

1.2 動物模型建立及其干預建立大鼠心肌梗死模型[8-9]，即動物麻醉、固定、氣管插管呼吸機正壓通氣，潮氣量為40 L·g-1,將呼吸頻率調(diào)至70次·min-1，呼吸比2 ∶1。開胸暴露心臟，以眼科縫線沿左心耳下緣2 mm穿過冠狀動脈左前降支(LAD)，結扎引起LAD閉塞，Ⅱ?qū)?lián)心電圖顯示ST段抬高，Sham組僅穿縫線但不結扎。建模成功后，逐層縫合胸腔并排出胸腔內(nèi)氣體。大鼠清醒后隨后常規(guī)飼養(yǎng)，并在術后3 d肌肉注射10萬單位青霉素以防止傷口感染。MI+Ghrelin組給予Ghrelin皮下注射(100 μg·kg-1，每天2次)，連續(xù)4周；Sham組和MI組以同等量的容量的生理鹽水注射。

1.3 心臟彩超測定心臟功能術后第5周末，稱體質(zhì)量并麻醉大鼠，胸部備皮，按文獻報道的方法用高頻超聲探頭測定大鼠心臟功能[8]。根據(jù)左心室短軸面測定左室短軸舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVDd)和左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension，LVDs)，并計算出左室短軸縮短分數(shù)(left ventricular fractional shortening，LVFS)以及左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)。

1.4 交感神經(jīng)放電的測定將麻醉大鼠仰臥位固定，逐層剝離頸部皮膚和肌肉尋找到頸部星狀神經(jīng)節(jié)[10]，其形態(tài)為米粒狀半透明結節(jié)。玻璃神經(jīng)分離針分開0.5 ～ 1 cm交感神經(jīng)束并輕柔剝離外層神經(jīng)束外膜。以自制鉑絲電極勾住該段交感神經(jīng)，液體石蠟油滴在神經(jīng)表面以便與周圍組織電絕緣，連接電生理儀(RM6240多道生理記錄儀，成都儀器廠)并記錄交感神經(jīng)放電并存儲在微機中。實驗結束后電腦分析交感神經(jīng)放電情況，根據(jù)報道的方法分析交感神經(jīng)放電幅度以評價交感神經(jīng)活性(sympathetic nerve activities，SNA)[10]。

1.5 HE染色評估心肌細胞肥厚和心肌纖維化實驗結束后，取心臟標本進行病理學觀察[10]，即經(jīng)主動脈以4%多聚甲醛逆向灌洗心臟，并切除結扎線下小塊的心肌組織在4%多聚甲醛中固定。隨后常規(guī)處理標本并石蠟組織包埋。隨后由病理科專業(yè)技術人員進行常規(guī)切片，HE和Masson染色。按我們既往方法測定心肌細胞直徑[10- 11]，即于40倍放大光鏡下，每張切片隨機選取10個細胞測量直徑，取平均值作為該切片心肌細胞的直徑；高倍視野下以ImageJ軟件分析心肌梗死面積和非梗死區(qū)心肌膠原容積積分(collagen volume fraction，CVF)，CVF/%=心肌膠原面積/所測視野面積×100%。

1.6 蛋白免疫印跡分離心臟蛋白質(zhì)并以BCA法測定蛋白質(zhì)濃度[11]，14% SDS-PAGE電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。常規(guī)處理后以不同抗體(一抗)在4 ℃下孵育過夜(ANP，BNP和β1-AR，1 ∶1 000，Santa Cruz公司；β2-AR，1 ∶ 2 000，Abbkine公司)，沖洗后再與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1 ∶2 000; Sigma)檢測抗體結合，隨后沖洗，并使用ECL試劑盒顯色，在Quantity One(Bio-Rad)中定量分析。

2 結果

2.1 Ghrelin對心梗后心臟功能的影響大鼠心臟超聲檢查提示心肌梗死后第5周，大鼠LVDs和LVDd增高(LVDs：6.15±0.64 mmvs4.56±0.37 mm；LVDd：7.23±0.85 mmvs4.82±0.57 mm；P<0.01)，而Ghrelin干預可以明顯減輕心肌梗死引起的LVDs和LVDd異常(LVDs：5.37±0.46 mmvs82.1±4.16.15±0.64 mm；LVDd：5.98±0.67 mmvs7.23±0.85 mm;P<0.01 )。MI組大鼠LVEF(46.2%±6.5%vs82.1%±4.1%，P<0.01)和LVFS(20.1%±3.7%vs45.8±4.6%，P<0.01)明顯降低，而Ghrelin干預可以明顯改善心肌梗死引起的LVEF(65.10±3.91vs46.2%±6.5%，P<0.01 )和LVFS(32.00%±3.51%vs20.1%±3.7%，P<0.01)異常。見Fig 1。

Fig 1 Effects of Ghrelin on cardiac function post myocardial infarction by echocardiographic MI=Myocardial infarction; LVDs= left ventricular end-systolic dimension; LVDd= left ventricular end-diastolic dimension; LVEF= left ventricular ejection fraction; LVFS=left ventricular fractional shortening. **P<0.01 vs Sham; ##P<0.01 vs MI group.

2.2 Ghrelin對心肌梗死面積及心機纖維化的影響急性心肌梗死后第5周大鼠心臟出現(xiàn)透壁性心肌梗死，Masson染色可見心室前壁全層藍色膠原組織(Fig 2A)， Ghrelin治療可以明顯縮小梗死面積(20.75%±3.54%vs34.4%±4.58%，P<0.01)(Fig 2C)。非梗死區(qū)域的心肌區(qū)域的心肌組織間隙呈現(xiàn)顯著地膠原增生(Fig 2B)，以CVF定量分析發(fā)現(xiàn)MI組比正常組明顯增加(13.17%±2.44%vs2.98%±1.028%，P<0.01)，Ghrelin治療可明顯降低CVF(8.04%±1.52%vs13.17%±2.44%，P<0.01)(Fig 2D)。

Fig 2 Effects of Ghrelin on infarct size and collagen volume fraction (CVF) post myocardial (A) Representative micrographs showing the cross-section of a heart stained with Masson’s staining in heart from Sham，MI and MI+Ghrelin group; (B) Representative amplified field in non-infarct area in different groups. (C) Summary data of infarction size (%); (D) Collagen volume fraction (CVF%) in different groups. MI=Myocardial infarction; **P<0.01 vs Sham; ##P<0.01 vs MI group.

2.3 Ghrelin對心梗后心肌細胞肥大的影響如Fig 1所示，高倍鏡下可見清晰觀察到心肌細胞形態(tài)及其間質(zhì)。Sham組心肌細胞形態(tài)及大小正常，心肌纖維排列也比較整齊致密。而MI組的心肌細胞呈現(xiàn)增生肥大改變，細胞不夠致密，而且細胞間質(zhì)增多。MI+Ghrelin組心肌細胞的肥大改善，排列也相對整齊，細胞間質(zhì)也有所改善。以心肌細胞的直徑作進行定量分析可見，MI組心肌細胞直徑以及MI+Ghrelin組心肌細胞直徑明顯高于Sham組(20.01±1.06vs14.04±0.82，P<0.01)；MI+Ghrelin組直徑明顯小于CHF組(16.24±0.97vs20.01± 1.06，P<0.01)，這種形態(tài)學觀察表明早期注射外源性Ghrelin可明顯改善心梗后心肌細胞增生重構。

2.4 Ghrelin對心梗后心衰心肌ANP及BNP蛋白表達的影響心梗后心肌重構可引起多種胚胎蛋白表達，與心肌細胞肥大相關。如Fig 3所示，心梗5周大鼠左心室心肌組織ANP和BNP相對蛋白表達量明顯增加(ANP: 3.84±0.23vs1.05±0.08; BNP:4.48±0.45vs1.09±0.11;P<0.01)；而心肌梗死后早期使用Ghrelin干預可以明顯降低心梗后心肌組織ANP和BNP相對蛋白表達(ANP:1.56±0.18vs3.84±0.23; BNP:2.18±0.32vs4.48±0.45;P<0.01)。這表明早期注射外源性Ghrelin可明顯改善心梗后心肌重構相關蛋白的表達。

Fig 3 Effects of Ghrelin on cardiomyocyte hypertrophy post myocardial infarctionRepresentative micrographs of left ventricular tissue stained with hematoxylin-eosin (HE) staining in heart from Sham (A)，MI (B) and MI+Ghrelin (C) group. (D) Summary data of cardiomyocyte diameter (CMD) in left ventricular MI，Myocardial infarction; **P<0.01 vs Sham; ##P<0.01 vs MI group.

2.5 Ghrelin對心梗后心衰大鼠心交感神經(jīng)活性的影響為明確心梗后心衰大鼠及Ghrelin干預對交感神經(jīng)功能的影響，通過直接記錄心臟交感神經(jīng)放電并評估心肌梗死后心交感神經(jīng)活性。如Fig 3A所見， MI組大鼠在梗死后5周時科記錄到增強的交感神經(jīng)放電，而MI+Ghrelin組交感神經(jīng)放電減弱。對交感神經(jīng)放電強度定量分析顯示，MI 組SNA幅度明顯增高(50.8±5.83vs19.9±3.5，P<0.01)，而Ghrelin干預明顯抑制心肌梗死后心交感神經(jīng)過度激活(34.3±4.6vs50.8±5.83，P<0.01 )。

2.6 Ghrelin對心梗后心衰大鼠心肌細胞β受體蛋白表達的影響為了明確心衰大鼠及Ghrelin干預對特定腎上腺素受體亞型的影響，以蛋白免疫印跡測定梗死后心肌組織勻漿中β1和β2腎上腺素受體表達。 如Fig 4所示，與Sham組的勻漿相比，MI 組心臟的心室勻漿含β1和β2腎上腺素受體蛋白表達明顯降低(β1-AR: 0.26±0.09vs1.08±0.08; β2-AR：0.43±0.09vs1.15±0.12;P<0.01)，然而Ghrelin干預明顯增加心梗后心臟的心室勻漿含β1和β2腎上腺素受體蛋白表達(β1-AR: 0.96±0.11vs0.26±0.09; β2-AR: 0.89±0.16vs0.43±0.09;P<0.01)。

Fig 4 Effects of Ghrelin on natriuretic peptide expression in left ventricular tissue post myocardial infarctionA: Representative Western blot of BNP，BNP and GAPDH; B: Summary data of BNP and ANP expression relative to ANP：atrial natriuretic peptide；BNP：brain natriuretic peptide. **P<0.01 vs Sham; ##P<0.01 vs MI group.

Fig 5 Effects of Ghrelin on cardiac sympathetic activities (SNA) post myocardial infarctionA: Representative trace of cardiac B: Summary data of cardiac SNA in rats from different groups. MI，Myocardial infarction; **P<0.01 vs Sham; ##P<0.01 vs MI group.

Fig 6 Effects of Ghrelin on β-adrenergic receptor expression in left ventricular tissue post myocardial infarction(A) Representative Western blot of β1-AR and β2-AR. (B) Summary data of β1-AR and β2-AR expression relative to MI，Myocardial infarction; **P<0.01 vs Sham; ##P<0.01 vs MI group.

3 討論

急性MI后CHF是嚴重威脅人們的生命健康，早期治療是避免或延緩進展為CHF的關鍵。防止和逆轉(zhuǎn)心臟重構是當前治療的共識，例如抑制交感神經(jīng)過度激活、阻斷腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)等是當前CHF治療基石[13]。作為一種內(nèi)源性氨基酸多肽，Ghrelin參與多種病理生理功能[3]。既往研究顯示，Ghrelin不但能夠保護急性MI大鼠的心臟功能[4]，也能改善MI后期心臟重塑引起的CHF[6]。本研究觀察到MI后5周大鼠左心室內(nèi)徑擴大，收縮力減弱，Ghrelin治療可以明顯改善MI后心衰大鼠的心臟功能，提示在MI早期使用Ghrelin可能減少后期形成CHF的風險。

心交感神經(jīng)過度激活是導致心衰進展的重要因素，抑制交感神經(jīng)活性及阻斷其受體效應可以保護衰竭心臟[13-14]。無論是皮下注射還是腦室內(nèi)給予Ghrelin治療，均可以抑制急性MI引起的交感神經(jīng)活性增強，即便切斷了雙側(cè)迷走神經(jīng)，Ghrelin仍能進一步抑制交感神經(jīng)活性，表明Ghrelin主要通過中樞神經(jīng)通路抑制交感活性，而迷走神經(jīng)傳入通路則部分則協(xié)同抑制MI誘導的交感神經(jīng)過度激活[4]。Shirai等[4]發(fā)現(xiàn)Ghrelin治療2周可以將MI誘導的血漿甲腎上腺素濃度抑制到與假手術組水平，并降低了實驗動物心率，改善了自主神經(jīng)功能。Jense等[13]研究表明經(jīng)外周靜脈使用Ghrelin也可以穿過血腦屏障并作用于腦內(nèi)的Ghrelin受體，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響發(fā)揮抗抑郁作用。在本研究中，通過直接記錄心交感神經(jīng)放電活動，實驗觀察到心肌梗死后心衰時交感神經(jīng)過度激活，心肌梗死早期使用Ghrelin干預可明顯抑制心交感神經(jīng)活性。表明MI后經(jīng)靜脈早期Ghrelin治療能夠抑制過度激活的交感神經(jīng)活性，但其具體的作用機制還不清楚，可能與Ghrelin在中樞和外周神經(jīng)共同作用的結果。

過度增加的交感神經(jīng)激素可以與心肌細胞膜β-AR結合產(chǎn)生心肌細胞毒性[14]，并造成β-AR表達的異常[1]。CHF時心肌細胞膜表面的β1-AR表達明顯下調(diào)，從而引起G蛋白偶聯(lián)受體后信號傳導通路異常，參與CHF的病理生理機制[1]。目前有關Ghrelin與心臟β1-AR相關研究較少，有研究發(fā)現(xiàn)急性MI時微小動脈擴張而促進非缺血區(qū)的冠狀動脈灌注，β-AR阻滯(普萘洛爾)則抑制了心臟微小血管的擴張，Ghrelin則可以防止β-AR阻滯劑的小血管不良作用。這一研究表明ghrelin可以與常規(guī)的β-AR阻斷劑聯(lián)合使用，從而協(xié)同改善冠狀動脈血流和心臟功能[15]。有研究認為心肌細胞中Ghrelin及其受體(growth hormone secretagogue receptor subtype 1a，GHS-R1a)與β-AR間存在交互作用，Ghrelin對β-AR有增敏效應，Ghrelin可以促進異丙腎上腺素的正性肌力和冠脈擴張效應。本研究發(fā)現(xiàn)MI后心衰心臟中β-AR表達下調(diào)，Ghrelin早期干預可以防止心肌細胞β-AR的降低。Ghrelin對MI后心肌β-AR的上調(diào)作用可能有助于保護缺血心臟的功能。有必要進一步的研究以探討Ghrelin激活GHS-R1a時心臟β-AR的活性變化的具體機制及效應。

MI后心力衰竭可表現(xiàn)為心肌重構和利鈉肽系統(tǒng)的表達升高。二者對心衰病理生理過程有一定代償作用，既能夠增強心臟收縮功能，同時也是心衰發(fā)生發(fā)展的重要標志[2]。有效的抗心衰治療可以明顯地減輕心肌細胞肥大，也降低心臟和循環(huán)中ANP和BNP的水平[2，11]。過去有研究表明Ghrelin可降低MI后心臟膠原增生和左心室肥大。本研究也觀察到,Ghrelin早期干預可以縮小梗死面積、降低非梗死區(qū)的膠原增生、減輕MI導致的心肌細胞肥大并降低心肌組織的ANP和BNP蛋白表達。表明Ghrelin可能通過抑制心梗后心臟重塑而發(fā)揮心臟保護作用。然而，Ghrelin 抗MI后心肌重塑的機制尚不清楚，可能與Ghrelin抑制交感神經(jīng)活性有關[6]。

綜上所述，在MI早期Ghrelin干預可以(1)改善心梗后心衰動物的心臟功能；(2)減輕心肌細胞重構和相關基因表達；(3)調(diào)節(jié)心衰心臟的β腎上腺素受體表達；(4)抑制MI后交感神經(jīng)過度激活。本研究表明在心肌梗死早期使用Ghrelin可以減輕心梗后心肌重塑并預防心力衰竭，其作用機制可能通過抑制交感神經(jīng)過度激活并減少腎上腺素心肌毒性實現(xiàn)。