天麻素治療缺血性腦卒中導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的作用機(jī)制研究

許 鑫，周 欣，楚世峰，李芳芳，鄭清煉，何宏媛，陳乃宏,

(1. 華南師范大學(xué)腦科學(xué)與康復(fù)醫(yī)學(xué)研究院，廣東 廣州 510631；2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所神經(jīng)科學(xué)中心, 天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100050;3. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617)

腦卒中是導(dǎo)致我國居民死亡的首位病因[1]，它具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率、高經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的特點(diǎn)[2]，溶栓藥組織型纖溶酶原激活劑(tPA)是唯一被FDA批準(zhǔn)的用于抗急性缺血性腦卒中的藥物[3]，但由于存在治療時(shí)間窗短，療效有限，易引發(fā)出血轉(zhuǎn)化等風(fēng)險(xiǎn)[4]，難以滿足需求。

神經(jīng)元死亡是腦卒中的核心病理環(huán)節(jié)，包括急性和遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，遲發(fā)性神經(jīng)元死亡通常表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，相關(guān)因子生存素(Survivin)能夠抑制線粒體介導(dǎo)的caspase系列引起的細(xì)胞凋亡作用，而且Survivin的抗凋亡作用需要乙肝病毒X蛋白結(jié)合蛋白(hepatitis B X-interacting protein，HBXIP)的協(xié)助，HBXIP/Survivin形成的復(fù)合物可以拮抗缺血性腦卒中導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡，改善缺血性腦卒中病變損傷。

天麻素(gastrodin，Gas)作為天麻的主要活性成分之一，對神經(jīng)衰弱、失眠、頭痛癥狀都有著緩解的作用，其結(jié)構(gòu)式如Fig 1?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Gas具有多種生物學(xué)活性，如楊根夢等[5]研究發(fā)現(xiàn)，Gas可減弱神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SHSY5Y)自噬，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，SHSY5Y細(xì)胞系被廣泛運(yùn)用于帕金森病發(fā)病機(jī)制的研究，表明Gas對帕金森病具有一定的影響。趙朝華等[6]研究發(fā)現(xiàn)，Gas能夠明顯抑制缺血/再灌注早期S100β的過表達(dá)，保護(hù)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞正常生長、繁殖和分化；杜亮等[7]研究發(fā)現(xiàn)Gas可明顯提高鈉離子、鉀離子和三磷酸腺苷酶的活性，促進(jìn)大腦細(xì)胞能量的代謝，有效清除自由基，減少腦缺血/再灌注造成的損傷；Zhang等[8-9]的研究發(fā)現(xiàn)Gas可抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的釋放，改善血腦屏障，減輕腦缺血后的炎癥反應(yīng)和缺血性腦損傷，這些可看出Gas對缺血性腦卒中的相關(guān)治療具有一定的基礎(chǔ),Gas具有多種藥理活性。

Fig 1 Chemical structure of gastrodin

然而上述研究均聚焦于卒中后24 h內(nèi)的研究，對于遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的影響未見報(bào)道。Survivin和HBXIP在Gas的保護(hù)作用中的變化尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，Gas可改善短暫性大腦中動脈阻塞(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)再灌注引發(fā)的大鼠遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，其機(jī)制與凋亡蛋白caspase-3、caspase-8和抗凋亡蛋白Survivin、HBXIP的表達(dá)有關(guān)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物♂SD大鼠，體質(zhì)量(260～280) g，購自斯貝福(北京)生物科技有限公司(清潔級，合格證編號：SCXK(京)2016-0002)，購入后飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所動物房，室溫維持在(26±2) ℃，相對濕度(55±5)%，12 h/12 h光照/避光循環(huán)，自由攝食與飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑Gas注射液(昆藥集團(tuán)股份有限公司，批號：110807-201809)；依達(dá)拉奉(Edaravone，Eda)注射液(南京先聲東元制藥有限公司，批號：80-190103)；Anti-β-actin抗體、羊抗鼠二抗(sigma公司)；Anti-caspase-3抗體(批號：J2815)、Anti-caspase-8抗體(批號：H0911)、Anti-HBXIP抗體(批號：A2715)(圣克魯斯生物技術(shù)公司)；Anti-Survivin抗體(abcam公司，批號：GR3211325-1)；Alexa FlureTM488 donkey anti-mouse二抗(批號：A5441)、Alexa FlureTM546 donkey anti-rabbit二抗(批號：AC026)(賽默飛世爾科技公司)；PVDF膜(孔徑0.22μm，美國Millipore公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器小動物呼吸麻醉機(jī)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；tMCAO栓線(北京西濃科技有限公司)；高速組織研磨儀(康濤科技)；激光共聚焦顯微鏡(Zesis公司)；生物分子成像儀(GE公司)；ECL發(fā)光儀(GE公司)；2K16型臺式低溫離心機(jī)(Sigma公司)；HR-120電子分析天平(A&D公司)；DYY-7C型垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置及蛋白電泳系統(tǒng)電源(北京六一儀器廠)；Milli-Q plus超純水儀(Millipore公司)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1.1Gas治療缺血性腦卒中的藥理學(xué)作用評價(jià) 為了檢測Gas是否具有抗腦缺血/再灌注損傷的作用，將SD大鼠分為6組，每組15只，分別為Sham組、Model組、Model+Gas(25 mg·kg-1)組、Model+Gas(50 mg·kg-1)組、Model+Gas(100 mg·kg-1)組、Model組+Eda(10 mg·kg-1)治療組。各組動物通過tMCAO處理后立即通過尾靜脈注射分別給予生理鹽水，不同劑量的Gas注射液，依達(dá)拉奉注射液。3 d后進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分，評分后立即處死大鼠，取腦進(jìn)行TTC染色，根據(jù)染色結(jié)果統(tǒng)計(jì)各組大鼠梗死率和水腫率評價(jià)Gas對腦缺血/再灌注3 d后腦卒中損傷的影響。

2.1.2Gas對缺血性腦卒中相關(guān)因子表達(dá)的影響 為了探究Gas對缺血性腦卒中相關(guān)因子表達(dá)的影響，將SD大鼠分為6組，每組6只，分別為Sham組、Model組、Model+Gas(25 mg·kg-1)組、Model+Gas(50 mg·kg-1)組、Model+Gas(100 mg·kg-1)組、Model組+Eda(10 mg·kg-1)治療組，各組動物進(jìn)行tMCAO模型處理，再灌注后立即通過尾靜脈注射分別給予生理鹽水，不同劑量的Gas注射液，依達(dá)拉奉注射液。連續(xù)給藥3 d，3 d后各組分別取3只進(jìn)行灌流取腦，另外3只取缺血側(cè)海馬體和皮層組織，用于檢測β-actin、caspase-3、caspase-8、Survivin和HBXIP蛋白的表達(dá)。

2.2 實(shí)驗(yàn)動物模型的制備動物模型采用線栓法來制備。大鼠適應(yīng)1周后，術(shù)前禁食12 h，自由飲水。首先放入麻醉箱中麻醉后稱體質(zhì)量，仰臥位于操作臺上固定四肢，帶上麻醉面罩。用酒精棉潤濕消毒脖頸處皮毛，手術(shù)剪小心分開皮下肌肉和脂肪，尖鑷仔細(xì)分開并充分暴露出右側(cè)頸總動脈(common carotid artery，CCA)，頸外動脈(external carotid artery，ECA)和頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)；將ECA結(jié)扎后并灼斷，用動脈夾夾閉CCA和ICA部位，在ECA灼斷處和活結(jié)之間剪一小口，插入線栓到顱腔內(nèi)，在感覺到有阻力系緊活結(jié)，縫合頸部皮膚；缺血60min后剪開皮膚，拔出線栓恢復(fù)供血，縫合皮膚完成缺血/再灌注造模實(shí)驗(yàn)。

2.3 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分再灌注3 d后，對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分，評分方法為Zea Longa’s test法，評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0=無障礙；1=不能完全伸展左側(cè)前肢；2=向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3=向左側(cè)傾倒；4=無自主活動或陷入深度昏迷中。

2.4 TTC檢測大鼠梗死率和水腫率行為學(xué)評分結(jié)束后，立即用10%水合氯醛麻醉后斷頭取腦，切成6個(gè)腦片后置于3%的TTC溶液中，37 ℃下避光孵育15 min后放入4%多聚甲醛溶液中，浸泡24 h后將腦切片按順序排列整齊并拍照保存，用Image-Pro Plus 6.01圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)腦切片的梗死面積，患側(cè)面積以及健側(cè)面積。腦梗死率/%=梗死面積/(健側(cè)面積×2)×100%；水腫率/%=(損傷側(cè)面積-健側(cè)面積)/(健側(cè)面積×2)×100%

2.5 實(shí)驗(yàn)動物灌流取腦每組選取3只大鼠，用10%水合氯醛麻醉(3 mL·kg-1)，仰臥位于解剖臺上，沿著腹部兩邊向上剪，向上拉開胸部皮膚充分暴露出大鼠心臟，將灌注針插入左心室，止血鉗夾緊灌注針和心臟，鑷子挑破右心耳，開始灌注PBS溶液(pH 7.4)，肝臟變白后換成4%多聚甲醛溶液繼續(xù)灌注，直到大鼠肝臟變硬，四肢和尾巴僵直且不易彎折后即可取腦，放于4%多聚甲醛溶液中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 尼氏染色觀察缺血側(cè)神經(jīng)元形態(tài)將灌流后的大腦進(jìn)行石蠟切片，石蠟切片常規(guī)脫蠟后脫水(二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各15 min，然后梯度乙醇脫水：100%Ⅰ、100%Ⅱ、95%、90%、80%、70%各5 min)；蒸餾水沖洗3次，每次5 min；然后置于60 ℃孵箱用焦油紫染色30 s；蒸餾水洗凈染料后，分別置于70%、80%和95%以及100%乙醇中脫水，再用二甲苯透明；最后用中性樹膠封片。正置顯微鏡下觀察拍照，并用Image-Pro Plus 6.01圖像分析軟件分析尼氏體累積光密度值。

2.7 免疫熒光染色檢測Survivin和HBXIP的表達(dá)每組取6張石蠟切片，將石蠟切片組織脫蠟，二甲苯15 min×2，梯度酒精進(jìn)行水化：100%乙醇10 min×2，95%乙醇5 min×1，80%乙醇5 min×1，70%乙醇5 min×1，60%乙醇5 min×1，雙蒸水5 min×2，PBS溶液5 min×3；切片放入抗原修復(fù)液中煮沸10 min，自然冷卻至室溫，然后PBS溶液5 min×3；將切片放入含有0.5% Triton X-100(曲拉通)的PBS溶液中，透化10 min后PBS溶液5 min×3；擦干腦組織外的水跡，用組化筆畫圈，滴加50 μl 5%BSA后，在濕盒中室溫下封閉30 min；擦干組織周圍，滴加50一抗Survivin(1 ∶250)和HBXIP(1 ∶250)，4 ℃過夜；取出濕盒復(fù)溫30 min，PBST溶液10 min×3；避光條件下，加二抗稀釋液和Hoechst 33342(比例1 ∶1 000)，室溫孵育2 h；PBST溶液10 min×3，90%甘油封片后蓋上蓋玻片，用指甲油封住固定。

2.8 海馬體和皮層蛋白的提取分別稱取海馬體和皮層組織約80 mg，加入800 μL預(yù)冷的組織裂解液，超聲破碎儀中勻漿，冰上裂解30 min后于4 ℃ 12 000 r·min-1離心30 min，取上清，取5 μL上清通過BCA法測定蛋白含量，其余上清按比例加入SDS上樣緩沖液并于100 ℃沸水浴中煮沸10 min變性，-80 ℃保存。

2.9 Western blot檢測caspase-3、caspase-8和Survivin、HBXIP蛋白的表達(dá)采用SDS-PAGE 凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用5% BSA 封閉2 h 后孵育一抗，加入一抗β-actin(1 ∶5 000)、caspase-3(1 ∶1 000)、caspase-8(1 ∶1 000)、Survivin(1 ∶2 500)、HBXIP(1 ∶2 500)，4 ℃孵育過夜。搖床室溫孵育二抗2 h。PVDF 膜用TBST 洗滌10 min×3次后，加ECL 顯色劑，用凝膠成像系統(tǒng)檢測，以β-actin為內(nèi)參，分析目的條帶/對應(yīng)內(nèi)參的相對表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 Gas對tMCAO大鼠梗死率、水腫率以及神經(jīng)行為學(xué)評分的影響如Fig 2所示，Sham組未見梗死區(qū)和水腫，無神經(jīng)功能缺損。當(dāng)大鼠缺血/再灌注3 d后，相比于Sham組、Model組、缺血側(cè)大腦白色梗死區(qū)和水腫范圍明顯增加(P<0.01)，神經(jīng)缺損功能評分增加(P<0.01)；與Model組相比，Gas(50、100 mg·kg-1)和Edaravone(10 mg·kg-1)治療組的大腦梗死率、水腫率和神經(jīng)行為學(xué)評分明顯減少，差異具有顯著性(P<0.01)。

3.2 Gas對tMCAO大鼠神經(jīng)元形態(tài)學(xué)損傷的影響如Fig 3A-C所示，Sham組大鼠海馬CA1區(qū)和皮層中錐體細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，排列緊密，胞質(zhì)核仁清晰，存在大量的神經(jīng)元；缺血/再灌注3 d后，Model組大腦海馬CA1區(qū)和皮層中神經(jīng)元細(xì)胞較少，輪廓模糊不清，尼氏小體明顯減少，細(xì)胞排列紊亂(P<0.01)；Gas(50、100 mg·kg-1)和Edaravone(10 mg·kg-1)治療組大腦海馬CA1區(qū)和皮層中錐體細(xì)胞排列較為緊密，細(xì)胞邊界較為清晰，尼氏小體數(shù)量增加，神經(jīng)元密度增加(P<0.01)。

3.3Gas可抑制缺血/再灌注后相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)如Fig 4 A，B所示，通過蛋白免疫印跡法檢測大腦缺血側(cè)海馬CA1區(qū)和皮層中caspase-3蛋白表達(dá)增加。缺血/再灌注后72 h，與sham組相比,Model組中caspase-3的表達(dá)明顯增加；與Model組相比，Gas(50、100 mg·kg-1)和Eda(10 mg·kg-1)藥物治療后海馬CA1區(qū)和皮層中缺血側(cè)caspase-3蛋白表達(dá)減少(P<0.05)；大腦缺血側(cè)海馬CA1區(qū)和皮層中caspase-8蛋白的表達(dá)表現(xiàn)出同樣的趨勢。

3.4 Gas可促進(jìn)tMCAO大鼠神經(jīng)元中Survivin和HBXIP蛋白的表達(dá)如Fig 5 A所示，通過蛋白免疫印跡法檢測大腦缺血側(cè)皮層中Survivin和HBXIP蛋白表達(dá)增加。缺血/再灌注后72 h，與sham組相比,Model組中Survivin和HBXIP的表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與Model組相比，Gas(100 mg·kg-1)和Eda(10 mg·kg-1)藥物治療后缺血側(cè)皮層中Survivin和HBXIP蛋白表達(dá)增加(P<0.01)。

如Fig 5 B、C所示，免疫熒光染色顯示，相比于Sham組大腦海馬和皮層組織內(nèi)的Survivin和HBXIP熒光表達(dá)水平增加；相比于Model組，Gas給藥組和依達(dá)拉奉給藥組Survivin和HBXIP熒光表達(dá)增加。其趨勢與Survivin和HBXIP蛋白表達(dá)相一致。

Fig 5 Effect of gastrodin on expressions of Survivin,HBXIP in brain of rats induced by tMCAOA: Protein levels of Survivin and HBXIP in brains 72 h after tMCAO in rats B: Immunofluorescence showed the expression of Survivin in hippocampus CA1 and cortex of 72 h after tMCAO in rats; C: Immunofluorescence showed the expression of HBXIP in hippocampus CA1 and cortex of 72 h after tMCAO in rats.#P<0.05 vs sham group,*P<0.05,**P<0.01 vs model group.

Fig 4 Effect of gastrodin on expressions of caspase-3,caspase-8 in brain of rats induced by tMCAOA: Protein levels of caspase-3 and caspase-8 in hippocampus 72 h after tMCAO in rats; B: Protein levels of caspase-3 and caspase-8 in cortex 72 h after tMCAO in rats vs sham group,*P<0.05,**P<0.01 vs model group.

Fig 3 Effect of gastrodin against hippocampus CA1 neuronal and cortex neuronal injury in rats with tMCAO

Fig 2 Effect of gastrodin on ischemia-reperfusion injury in tMCAO ratsA: Representative photographs of TTC-stained brain sections; B: Cerebral infarct volume and edema volume examined of rats in each group,and Ldonga's test score to evaluate neurological deficits vs Sham group,*P<0.05,**P<0.01 vs Model group.

4 討論

缺血/再灌注后使大腦出現(xiàn)病理性變化，隨后出現(xiàn)一系列生理改變，包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞程序性死亡等，從而引起神經(jīng)細(xì)胞功能障礙和神經(jīng)元死亡。有研究發(fā)現(xiàn)，Gas可以在分子水平與機(jī)體纖維蛋白原結(jié)合，可通過血腦屏障，靜脈注射可快速進(jìn)入大腦，故本實(shí)驗(yàn)選擇尾靜脈注射給藥的方式來探究。研究結(jié)果顯示，Gas可明顯減少tMCAO大鼠的神經(jīng)行為學(xué)異常，腦梗死和腦水腫癥狀，表明Gas具有改善缺血/再灌注損傷的作用。

由于腦缺血會導(dǎo)致神經(jīng)元壞死或凋亡，本研究還觀察了與缺血性腦卒中密切相關(guān)的大腦海馬CA1區(qū)和皮層神經(jīng)元損傷情況[10-12]。尼氏小體是神經(jīng)元合成蛋白的主要場所，其變化能反映神經(jīng)元功能情況，是神經(jīng)細(xì)胞功能活性的形態(tài)指標(biāo)。當(dāng)受損神經(jīng)元功能修復(fù)后，已經(jīng)破碎并逐漸消失的尼氏小體可重新出現(xiàn)。尼氏染色結(jié)果顯示，Gas治療明顯增加增加尼氏小體數(shù)量，明顯促進(jìn)神經(jīng)元功能的恢復(fù)。

細(xì)胞凋亡是遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的主要形式，一般發(fā)生在缺血/再灌注3～4 d。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，細(xì)胞色素C從線粒體釋放后與凋亡相關(guān)因子1(apoptosis protein activating factor，Apaf-1)結(jié)合形成多聚體，并促使caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體，激活caspase-3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而激活的caspase-8能間接誘導(dǎo)細(xì)胞色素C從線粒體釋放進(jìn)入胞質(zhì)，從而把死亡受體通路和線粒體通路聯(lián)系起來，有效地?cái)U(kuò)大了凋亡信號。另外由于酶原形式的pro-caspase-3和pro-caspase-8本身不具備催化活性，故而實(shí)驗(yàn)中通過檢測活化后的caspase-3和caspase-8來表明細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，Gas可明顯抑制caspase-3和caspase-8凋亡因子的表達(dá)，提示本實(shí)驗(yàn)中，Gas具有抑制細(xì)胞凋亡通路激活的功效。

細(xì)胞的凋亡不僅僅是凋亡因子表達(dá)參與的結(jié)果，而是細(xì)胞內(nèi)抗凋亡因子與促凋亡因子表達(dá)失衡導(dǎo)致的結(jié)果。有文獻(xiàn)顯示，Survivin能夠抑制線粒體中由凋亡蛋白活化因子1結(jié)合細(xì)胞色素c和活化Pro-caspase-9，酶解Pro-caspase-3 使之激活從而執(zhí)行的細(xì)胞凋亡[13]。Survivin還可通過p21抑制caspase活化而抗凋亡。在神經(jīng)系統(tǒng)中，2005年有文獻(xiàn)報(bào)道從胚胎d 10.5開始進(jìn)行Survivin的條件敲除，新生小鼠突變體顯示出嚴(yán)重的多灶性凋亡，腦體積明顯縮小，表明Survivin對于發(fā)育中的中樞神經(jīng)細(xì)胞的存活很重要。當(dāng)大腦受到缺血/再灌注損傷后，Survivin在神經(jīng)組織細(xì)胞中會大量的表達(dá)，而且參與遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的過程[14]。而HBXIP作為Survivin分子伴侶，可與Survivin形成復(fù)合物，增強(qiáng)Survivin的抗凋亡作用。

HBXIP是一種因可與乙肝病毒X蛋白的C端特異性結(jié)合而得名的蛋白質(zhì)，參與DNA的復(fù)制、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等過程，與Survivin結(jié)合后可抑制線粒體內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)的凋亡。2017年文獻(xiàn)表示HBXIP和Survivin復(fù)合物可拮抗全腦缺血/再灌注后損傷中的神經(jīng)元凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)通過蛋白質(zhì)印跡法和免疫熒光染色法觀察發(fā)現(xiàn)，Survivin和HBXIP蛋白的表達(dá)在Gas治療下得到明顯的提升。表明Gas不僅通過抑制凋亡因子的表達(dá)，而且促進(jìn)抗凋亡因子的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對缺血性腦卒中神經(jīng)元的保護(hù)作用。

本課題研究進(jìn)一步闡明Gas對缺血性腦卒中的相關(guān)作用機(jī)理，有助于豐富和發(fā)展缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制的假說，為尋找新型潛在的抗缺血性腦卒中具有重要的意義。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)研究工作在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥理實(shí)驗(yàn)室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室的老師和同學(xué)！)