SAHA靶定組織蛋白酶V誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞自噬

周 慧，韓 翰, 周偉強(qiáng)

(沈陽醫(yī)學(xué)院 1. 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室、2. 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室、3. 病原生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110034)

癌癥已經(jīng)嚴(yán)重威脅全世界人類生存和社會(huì)發(fā)展，據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究所發(fā)布的最新報(bào)告顯示，乳腺癌是全球女性最常見的癌癥，其發(fā)病率在女性癌癥中位居首位。2018年，全球約有209萬乳腺癌病例和62.7萬因乳腺癌而死亡病例[1]。三陰乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是乳腺癌中一類高度異質(zhì)性的疾病，因無特異性治療靶點(diǎn)，故其主要治療手段仍是化療[2]，但是，化療藥物在臨床上存在藥物種類少、副作用大、耐藥性強(qiáng)等缺點(diǎn)[3-4]，因此亟待進(jìn)一步探索更有效的治療藥物。

辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)作為第二代組蛋白去乙?；敢种苿?，通過抑制組蛋白去乙?；富钚?，誘導(dǎo)組蛋白過乙?；?，從而改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞分化、調(diào)亡、自噬和壞死等一系列生物學(xué)效應(yīng)[5]。

組織蛋白酶V (cathepsin V，CTSV )是一種溶酶體蛋白水解酶，屬于半胱胺酸蛋白酶體系，是11種人半胱氨酸組織蛋白酶(B、C、F、H、L、K、O、S、V、W、X/Z)中的一員[6]。有研究證明[7-8]，組織蛋白酶家族蛋白在SAHA誘導(dǎo)的自噬中起到重要作用，而作為組織蛋白酶家族主要成員的CTSV在自噬過程中是否也起到相關(guān)作用還未有報(bào)導(dǎo)。本文將SAHA作用于MDA-MB-231細(xì)胞，探討CTSV在SAHA誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞自噬中的作用機(jī)制，有著重要的理論和實(shí)驗(yàn)意義。

1 材料與方法

1.1 材料人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231(EGC076)由本實(shí)驗(yàn)室凍存；Leibovitz’s L-15培養(yǎng)基(KGM41300)和青鏈霉素(KGY0023)購自凱基生物公司，胎牛血清(A3160902)購自美國Thermo公司；SAHA(1604-1)購自美國Biovision公司；High Pure RNA Isolation kit試劑盒(1182866500)購自德國Roche Diagnostics公司；Power SYBR Green PCR Master mix(4367659)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(B2162617)購自美國Life Technologies公司；抗體購自英國Abcam公司；CTSV小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)(SC-44526-SH)購自美國Santa Cruz公司；其他的化學(xué)試劑購自美國Sigma-Aldrich公司和上海生工生物有限公司。

1.2 儀器多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific)；濕式轉(zhuǎn)膜儀、垂直電泳槽(美國 Bio-Rad)；凝膠成像系統(tǒng)(上海Tanon)；倒置顯微鏡(日本Olympus)；-80 ℃超低溫冰箱(美國Thermo Scientific)；微量核酸蛋白濃度測定儀(美國Thermo Scientific)；熒光定量PCR儀(美國Thermo Scientific)；低溫離心機(jī)(美國Thermo Scientific)。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于含10 %胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的Leibovitz′s L-15培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將MDA-MB-231細(xì)胞接種于96孔板(1×107·L-1)和6孔板(5×108·L-1)各孔中，經(jīng)過無血清培養(yǎng)基同步化處理后，用于下列實(shí)驗(yàn)。

1.3.2細(xì)胞活力檢測 將不同濃度的SAHA(0、0.5、1、2、5、10、20、50 μmol·L-1)與MDA-MB-231細(xì)胞共同孵育24 h，經(jīng)胰酶消化，收集2×105個(gè)細(xì)胞加入450 μL Count&Viability reagent，室溫避光靜置后應(yīng)用Muse細(xì)胞分析儀檢測細(xì)胞活力。

1.3.3CTSV-siRNA轉(zhuǎn)染 取6.6 μL CTSV-siRNA與125 μL無血清培養(yǎng)基混合，室溫放置5 min。取3.75 μL Lipofectamine 3000與125 μL無血清培養(yǎng)基混合，室溫放置5 min。將上述兩者混勻，室溫放置5 min。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物與6孔板中的MDA-MB-231細(xì)胞混合，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4RNA提取和Real-time PCR 將SAHA與MDA-MB-231細(xì)胞共同孵育24 h，按照RNA提取試劑盒說明進(jìn)行，合成第一鏈cDNA后應(yīng)用SYBR Green方法進(jìn)行Real-time PCR，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行反應(yīng)，檢測mRNA水平。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT方法。ULK1引物序列：Forward為5′-GTAAACTGGGGTCGCATTGT-3′，Reverse為5′-TGGATCCAAGGCTCTAGGTG-3′；ATG3引物序列：Forward為5′-TTTGGCTATGATGAGCAACG-3′，Reverse為5′-GTGGCAGATGAGGGTGATTT-3′； ATG4B引物序列：Forward為5′-GAGCTGCCAAGTCCAGAT TC-3′，Reverse為5′-CCAGGATTTTCAAAGGGACA-3′； ATG4C引物序列：Forward為5′-CCTTGGCTCTTTTT GGCTTA-3′，Reverse為5′-AGGATGCCTTGCTTCTTC AA-3′； ATG5引物序列：Forward為5′-GCAAGCC AGACAGGAAAAAG-3′，Reverse為5′-GACCTTCAG TGGTCCGGTAA-3′； ATG7引物序列：Forward為5′-GAACATGGTGCTGGTTTCCT-3′，Reverse為5′-CAT CCAGGGTACTGGGCTAA-3′；ATG9A引物序列：Forward為5′-GTCAGCTGCGTGGACTATGA-3′，Reverse為5′-GACTTGAGCAGGCAAAAAGG-3′；ATG10引物序列：Forward為5′-GCATTGTAGGGCCAGTTGTT-3′，Reverse為5′-GCTGGCCAGGTAAACTCTTG-3′；ATG12引物序列：Forward為5′-AGGTCTGTAGTC GCGGAGAA-3′，Reverse為5′-GTTCCCGGCTAGT CATTCAA-3′；Beclin 1引物序列：Forward為5′- AGG TTGAGAAAGGCGAGACA-3′，Reverse為5′-GCTTT TGTCCACTGCTCCTC-3′；GAPDH引物序列：Forward為5′- ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′，Reverse為5′- ACGACCAAATCCGTTGACTC-3′。

1.3.5Western blot檢測 將SAHA與MDA-MB-231細(xì)胞共同孵育24 h，提取總蛋白，并用BCA法測定蛋白含量。取等量蛋白樣品煮沸10 min，經(jīng)SDS-聚丙酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉過夜，洗膜，一抗孵育，洗膜，二抗孵育，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。Tanon化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)檢測結(jié)果。

1.3.6細(xì)胞免疫熒光法 將SAHA與MDA-MB-231細(xì)胞共同孵育24 h，用PBS清洗細(xì)胞，4 %甲醛室溫固定10 min，緩沖液室溫封閉2 h。將含有LC3抗體的自噬體檢測試劑在4 ℃下與細(xì)胞孵育過夜，用熒光共聚焦顯微鏡對細(xì)胞成像并觀察自噬信號(hào)。

1.3.7自噬通量阻滯試驗(yàn) 將SAHA和不同劑量的Bafilomycin A1(0～40 nmol·L-1)孵育MDA-MB-231細(xì)胞24 h。Western blot檢測自噬抑制的最佳劑量。然后用CTSV-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在Bafilomycin A1存在下培養(yǎng)。用Western blot法測定自噬通量，檢測p62蛋白水平，用Muse細(xì)胞分析儀檢測細(xì)胞活力測定SAHA藥理作用。

2 結(jié)果

2.1 SAHA抑制乳腺癌細(xì)胞增殖將不同濃度的SAHA與MDA-MB-231細(xì)胞孵育24 h后測定細(xì)胞活力。結(jié)果顯示：不同劑量的SAHA處理后，細(xì)胞活力明顯下降。尤其是在2 μmol·L-1SAHA處理的MDA-MB-231細(xì)胞中，與對照組相比，活細(xì)胞比率從96.1 %下降到59.2 %(Fig 1)。結(jié)果表明，SAHA能明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖。

2.2 SAHA增加乳腺癌細(xì)胞CTSV的表達(dá)SAHA處理后CTSV的mRNA和蛋白水平明顯升高。隨著SAHA劑量的增高，CTSV的最高mRNA水平可達(dá)到對照組的214.04倍，CTSV的蛋白水平也明顯升高。該結(jié)果證明，SAHA可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞中CTSV的基因和蛋白水平高表達(dá)(Fig 2)。此外，結(jié)合SAHA的毒副作用，我們最終確定了SAHA對MDA-MB-231細(xì)胞作用的最佳劑量為2 μmol·L-1。

Fig 1 Muse cell analysis for 24 hours SAHA dose-response effects on breast cancer cells (n=3)

2.3 CTSV-siRNA轉(zhuǎn)染降低乳腺癌細(xì)胞中CTSV的基因和蛋白水平用Real-time PCR和Western blot檢測CTSV-siRNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后CTSV的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示：CTSV-siRNA轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞后，與對照組相比，CTSV-siRNA組CTSV的基因和蛋白水平均明顯降低。另外，SAHA可以明顯升高乳腺癌細(xì)胞中CTSV的基因和蛋白水平，當(dāng)SAHA和CTSV-siRNA聯(lián)合作用后能夠恢復(fù)由CTSV-siRNA干擾引起的CTSV基因和蛋白水平的降低(Fig 3)。該結(jié)果證明，CTSV-siRNA轉(zhuǎn)染可有效降低乳腺癌細(xì)胞中CTSV的水平。

2.4 SAHA-CTSV激活乳腺癌細(xì)胞自噬標(biāo)志物L(fēng)C3的表達(dá)用熒光共聚焦顯微鏡觀察了SAHA-CTSV對LC3表達(dá)的誘導(dǎo)作用。結(jié)果表明，SAHA強(qiáng)烈觸發(fā)細(xì)胞自噬，隨著SAHA的誘導(dǎo)，標(biāo)記LC3分子的熒光塊分布在細(xì)胞質(zhì)的大部分區(qū)域；而CTSV-siRNA轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞熒光亮度降低，呈散簇狀，僅位于細(xì)胞膜周圍。最后，當(dāng)SAHA作用于CTSV敲除細(xì)胞時(shí)，熒光的分布比未經(jīng)SAHA處理的細(xì)胞更為有限，僅在細(xì)胞膜周圍擴(kuò)散，但熒光的分布和亮度仍強(qiáng)于未經(jīng)SAHA處理的細(xì)胞(Fig 4)。該結(jié)果表明，SAHA-CTSV促使MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生自噬。

Fig 2 Assays for CTSV expressions induced by different doses of SAHA for 24 hours treatment n=3)A： Western blot assay for MDA-MB-231 cells; B： Real-time PCR assay for MDA-MB-231 cells. *P<0.05 vs Basal.

Fig 3 Effect of SAHA on breast cancer cells accompanied by increase of CTSV function n=3)A： Western blot assay for MDA-MB-231 cells; B： Real-time PCR assay for MDA-MB-231 cells. (CVi: CTSV siRNA). *P<0.05 vs Basal, #P<0.05 vs SAHA.

2.5 SAHA-CTSV誘導(dǎo)自噬相關(guān)ATGs分子和LC3的變化為了進(jìn)一步探討SAHA-CTSV誘導(dǎo)乳腺癌發(fā)生自噬的機(jī)制，我們采用Real-time PCR和Western blot檢測SAHA-CTSV介導(dǎo)的自噬過程中相關(guān)ATG和LC3的改變。結(jié)果顯示，在MDA-MB-231細(xì)胞中，SAHA單獨(dú)處理可促進(jìn)ULK1(ATG1)、ATG4B、ATG4C、ATG5、ATG7、ATG9A、ATG10和Beclin1的mRNA表達(dá)。然而，當(dāng)SAHA被特異性siRNA敲除CTSV功能的細(xì)胞處理時(shí)，ULK1、ATG4B、ATG10和Beclin1的活性被強(qiáng)烈抑制(Fig 5)。對于蛋白的分析，SAHA增多了MDA-MB-231細(xì)胞Beclin1的表達(dá)量，并伴有LC3B升高和mTOR降低。CTSV-siRNA的加入逆轉(zhuǎn)了SAHA效應(yīng)(Fig 6)。該結(jié)果表明，CTSV在SAHA誘導(dǎo)的MDA-MB-231細(xì)胞自噬過程中起到重要作用。

Fig 4 Fluorescence microscopy for SAHA-CTSV induced autophagy (n=3) (CVi: CTSV siRNA).

Fig 5 The mRNA expressions of autophagy-related ATGs induced by SAHA-CTSV in breast cancer cells n=3)*P<0.05 vs Basal, #P<0.05 vs SAHA (CVi: CTSV siRNA).

Fig 6 Effect of SAHA-CTSV on protein expressions of ATGs and LC3, Western blot assay for MDA-MB-231 cells (n=3)(CVi: CTSV siRNA).

2.6 Bafilomycin A1阻斷SAHA-CTSV自噬通量時(shí)不能發(fā)揮抗腫瘤作用為驗(yàn)證SAHA-CTSV對乳腺癌細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用，通過Bafilomycin A1阻斷自噬的傳遞。首先，篩選了不同劑量的Bafilomycin A1對SAHA誘導(dǎo)的MDA-MB-231細(xì)胞自噬的抑制作用。使用不同劑量的Bafilomycin A1(0、5、10、20、40 nmol·L-1)與SAHA處理的MDA-MB-231細(xì)胞孵育24 h。通過Western blot分析，可以看到，在5 nmol·L-1Bafilomycin A1或高于該劑量的情況下，p62蛋白的表達(dá)與單用SAHA相比明顯增加。接下來，將5 nmol·L-1Bafilomycin A1和SAHA與經(jīng)CTSV-siRNA轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞共培養(yǎng)24 h。發(fā)現(xiàn)如果自噬被阻斷，SAHA不能通過CTSV發(fā)揮抗腫瘤的藥理作用。Muse細(xì)胞分析儀測定細(xì)胞活力結(jié)果也證實(shí)，在Bafilomycin A1的作用下，乳腺癌細(xì)胞雖然與SAHA共培養(yǎng)，但與SAHA單獨(dú)培養(yǎng)相比，活細(xì)胞數(shù)量增加。此外，CTSV基因敲除進(jìn)一步削弱了SAHA對細(xì)胞的影響(Fig 7)。該結(jié)果表明，SAHA誘導(dǎo)的MDA-MB-231細(xì)胞自噬過程中，CTSV起到重要作用。

Fig 7 The anti-tumor effect of SAHA-CTSV in environment that autophagic flux was blocked by Bafilomycin A1 n=3)*P<0.05 vs Basal, #P<0.05 vs SAHA (CVi: CTSV siRNA, BA1: Bafilomycin A1).

3 討論

自噬是一種保護(hù)細(xì)胞存活的機(jī)制，細(xì)胞需要適當(dāng)?shù)淖允烧{(diào)節(jié)[9]。研究表明，自噬在癌癥的發(fā)展和治療中也起著“雙刃劍”的作用[10]。一方面，自噬可以為癌細(xì)胞提供足夠的營養(yǎng)，另一方面，當(dāng)長期和過量的藥物作用于細(xì)胞時(shí)，自噬可以導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的死亡過程[11]。

研究證實(shí)，SAHA對乳腺癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞活力、凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)程有明顯影響[12]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，SAHA也可能與其他形式的細(xì)胞死亡有關(guān)，包括自噬性細(xì)胞死亡[13]。Fig 6表明，SAHA能明顯促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞LC3的表達(dá)，說明自噬與 SAHA誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡有關(guān)。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)SAHA處理乳腺癌細(xì)胞時(shí)，CTSV基因和蛋白的表達(dá)增加過多。當(dāng)我們使用CTSV特異性siRNA敲除CTSV mRNA功能時(shí)，SAHA誘導(dǎo)的LC3表達(dá)明顯受到抑制，細(xì)胞死亡過程也受到抑制。該結(jié)果提示CTSV在SAHA誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞自噬中起關(guān)鍵作用。由于CTSV是組織蛋白酶家族成員，是溶酶體酶復(fù)合物的重要組成部分，而溶酶體是自噬溶酶體的重要組成部分，推測SAHA通過CTSV調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡過程。

為進(jìn)一步揭示SAHA誘導(dǎo)自噬發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制，我們檢測自噬相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)，在SAHA的作用下，ATG4和Beclin1在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯改變，LC3B蛋白含量的增加伴隨著mTOR表達(dá)的降低。最后，我們用Bafilomycin A1阻斷自噬通量，并測定p62表達(dá)的變化，以闡明SAHA-CTSV軸在乳腺癌細(xì)胞中的作用。隨著Bafilomycin A1的加入，SAHA和CTSV-siRNA聯(lián)合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞活力均明顯增加。提示SAHA-CTSV軸通過對乳腺癌細(xì)胞的自噬作用發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上闡明了SAHA誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞自噬是由CTSV介導(dǎo)的。SAHA通過CTSV激活自噬標(biāo)記分子ATG和Beclin1，誘導(dǎo)LC3表達(dá)異常增加。通過mTOR轉(zhuǎn)導(dǎo)，SAHA最終促進(jìn)自噬溶酶體的合成并引發(fā)細(xì)胞死亡。我們的研究結(jié)果為進(jìn)一步探索自噬的分子機(jī)制，特別是細(xì)胞死亡如何應(yīng)對抗乳腺癌藥物過度自噬，以及其他代謝和信號(hào)過程如何協(xié)調(diào)這一過程奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。