不同豬瘟疫苗母源抗體持續(xù)期及半衰期研究

王遵寶，李俊輝，賀 筍，楊金鹿，豆智華，王 濤，劉迦慧

（天康生物股份有限公司，烏魯木齊 830032）

豬瘟（classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一種高度接觸性傳染病，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（Office International des Epizooties，OIE）規(guī)定的必報(bào)告疫病，該病以發(fā)病急、持續(xù)高熱，全身出血和白細(xì)胞減少為特征，發(fā)病率和死亡率高[1-2]。豬胎盤屬于上皮絨毛膜型，母源抗體不能通過胎盤屏障，所以仔豬需通過吮吸初乳獲得母源抗體，從而獲得豬瘟被動(dòng)免疫保護(hù)力[3-5]。

免疫預(yù)防是當(dāng)前我國防控豬瘟的主要措施之一。臨床應(yīng)用中，豬瘟活疫苗的免疫效果受自身抗體干擾影響較大。尤其是仔豬免疫受母源抗體影響大，不合理的免疫程序可能導(dǎo)致免疫失敗。仔豬的母源抗體滴度會(huì)隨著日齡的增長而衰減，母源抗體的半衰期一般為14 d左右，但由于母豬品種、飼養(yǎng)管理水平、疫苗種類及免疫程序的不同，導(dǎo)致母源抗體效價(jià)和持續(xù)時(shí)間均不一致。母源抗體的存在為哺乳仔豬提供了一定時(shí)間內(nèi)抵御病毒的被動(dòng)保護(hù)，但其又會(huì)影響免疫接種。母源抗體過高，接種豬瘟活疫苗會(huì)被母源抗體中和；母源抗體過低，仔豬在免疫空白期易受環(huán)境中豬瘟病毒的侵襲[6-8]。根據(jù)母源抗體衰減規(guī)律，確定仔豬最佳首免日齡，從而制定合適的豬瘟免疫程序至關(guān)重要，可保證豬瘟免疫效果，有效減輕仔豬早期免疫負(fù)擔(dān)。

豬瘟E2亞單位疫苗是應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)將豬瘟病毒E2基因重組于桿狀病毒內(nèi)，在昆蟲細(xì)胞上培養(yǎng)表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白而制成的新型基因工程疫苗。該疫苗只誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生E2蛋白抗體，可以通過對E2、Erns或NS3蛋白的抗體檢測區(qū)分免疫和野毒感染豬[9-10]。此外，該疫苗中重組E2蛋白含量高，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平豬瘟抗體，受自身豬瘟抗體干擾小。

為了比較兩種不同疫苗在臨床上的免疫效果及受自身抗體干擾的程度，本研究以抗體水平相近的妊娠母豬及其所產(chǎn)仔豬作為研究對象，通過監(jiān)測母豬及其所產(chǎn)仔豬血清豬瘟抗體，比較不同豬瘟疫苗免疫母豬后產(chǎn)生的抗體差異，同時(shí)分析其母源抗體衰減規(guī)律，推導(dǎo)、計(jì)算斷奶仔豬母源抗體半衰期，為臨床應(yīng)用中預(yù)測母源抗體持續(xù)期，合理制定仔豬免疫程序提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物在天康畜牧公司繁育豬場，用2～3胎次的二元母豬60頭及其所產(chǎn)仔豬，每窩隨機(jī)選擇3頭，共計(jì)180頭仔豬，打雙耳標(biāo)用于試驗(yàn)。

1.2 疫苗豬瘟病毒E2亞單位疫苗、豬瘟兔化弱毒苗（傳代細(xì)胞源）。

1.3 檢測試劑PK-15細(xì)胞、豬瘟兔化弱毒細(xì)胞適應(yīng)株由天康生物股份有限公司保管和供應(yīng)；豬瘟陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；兔抗豬FITC標(biāo)記IgG二抗購自Sigma公司；豬瘟病毒抗體檢測試劑盒購自愛德士公司（99-43220）；DMEM、胎牛血清等購自Gibco公司；甲醛、磷酸鹽等為國產(chǎn)分析純。

1.4 動(dòng)物免疫分組及采血在天康畜牧公司繁育豬場，用2～3胎次的妊娠期二元母豬60頭，按照表1進(jìn)行分組、免疫，每組20頭，對照組不免疫。免疫前、分娩后采血，分離血清，用于測定豬瘟抗體。該豬場前期用豬瘟兔化弱毒苗（hog cholera lapinized vaccine，HCLV）進(jìn)行豬瘟免疫、防控工作。母豬飼養(yǎng)條件、其他疫苗免疫程序均保持一致。試驗(yàn)?zāi)肛i分娩后每窩隨機(jī)選擇3頭仔豬，打雙耳標(biāo)編號，在出生后每兩周采血，無菌分離血清，測定豬瘟抗體。為保證母源抗體對群體的保護(hù)效力，避免疾病發(fā)生，當(dāng)試驗(yàn)組的豬瘟抗體平均阻斷率低于50%或陽性率低于60%時(shí)，停止該組豬瘟抗體監(jiān)測，免疫豬瘟疫苗。

表1 試驗(yàn)?zāi)肛i免疫分組表Table 1 The immune grouping of test sows

1.5 抗體檢測方法

1.5.1 豬瘟病毒ELISA抗體檢測方法 參見美國愛德士《豬瘟病毒抗體檢測試劑盒》說明書（編號：99-43220-01）。

1.5.2 豬瘟病毒血清中和抗體測定方法 將待測血清樣本置于56℃水浴中滅活30 min，在96孔板中用DMEM將待測血清樣本2倍梯度稀釋至第11排，12排作為陰性對照，加入豬瘟兔化弱毒，100～300TCID50/孔，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行血清中和。另取96孔板進(jìn)行病毒含量的反滴定。感作1 h后，每孔加入100 μL的PK-15細(xì)胞，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，3 d后用免疫熒光法在倒置熒光顯微鏡下判讀熒光信號，以Reed-Muench方式計(jì)算血清的中和抗體滴度。反滴定后病毒含量在50～300TCID50/50μL則所稀釋病毒符合檢驗(yàn)要求，判定的血清中和抗體成立。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，使用重復(fù)測量方差分析中LSD分析比較免疫前后、不同組間抗體差異；用雙變量相關(guān)分析母豬分娩后血清中和抗體滴度與仔豬1日齡血清中和抗體滴度間相關(guān)性；根據(jù)母源中和抗體結(jié)果，采用線性回歸分析，按以下公式計(jì)算不同免疫組斷奶仔豬母源抗體半衰期（T1/2）。

T1/2=LN 2/λ，其中λ為回歸方程斜率的絕對值。

2 結(jié)果與討論

疫苗免疫是我國豬瘟防控的主要措施。由于受母源抗體干擾較大，仔豬免疫程序不合理常導(dǎo)致豬瘟免疫防控失敗。不同豬瘟疫苗免疫母豬后，產(chǎn)仔豬的母源抗體持續(xù)期監(jiān)測對仔豬首免日齡確定及免疫程序的制定至關(guān)重要。

母豬血清抗體ELISA檢測結(jié)果顯示，免疫前各組豬瘟抗體水平差異不顯著，陽性率為100%。試驗(yàn)豬分娩后抗體均為陽性，E2組豬瘟抗體提升明顯，阻斷率平均值最高為91.62%，經(jīng)LSD分析，E2組阻斷率與HCLV組和對照組相比差異顯著（P＜0.05），離散度遠(yuǎn)小于免疫前及其他試驗(yàn)組，提示經(jīng)過免疫有效提升了豬群抗體水平和整齊度；HCLV組抗體有所提升，阻斷率均值為81.09%，離散度變化不大；對照組抗體阻斷率均值最低，較免疫前有所下降，離散度變大，詳見表2。

表2 試驗(yàn)豬免疫前后豬瘟ELISA抗體檢測結(jié)果Table 2 CSFV ELISA antibody in sows before and after vaccination

母豬血清中和抗體檢測結(jié)果表明，免疫組分娩后中和抗體滴度顯著高于免疫前和同期對照組，其中E2組抗體滴度均值最高，為11.4log2，HCLV組抗體滴度均值為9.5log2，對照組分娩后抗體較免疫組低，該結(jié)果與ELISA檢測結(jié)果一致（表3）。盡管所選試驗(yàn)豬免疫前抗體水平相近，但由于兔化弱毒疫苗受豬瘟基礎(chǔ)抗體影響較大，所以不能客觀地評價(jià)、比較兩種疫苗真實(shí)的免疫效果，側(cè)面體現(xiàn)出E2亞單位疫苗受抗體干擾較小的特點(diǎn)。

仔豬母源抗體ELISA檢測結(jié)果顯示，各試驗(yàn)組仔豬l日齡時(shí)抗體阻斷率最高，之后緩慢下降，21 d斷乳時(shí)抗體水平明顯下降。經(jīng)LSD分析，E2組仔豬母源抗體與HCLV組和對照組相比差異極顯著（P＜0.05）。按照豬瘟抗體阻斷率均值不低于50%且陽性率不低于60%的判定標(biāo)準(zhǔn)，E2亞單位疫苗組仔豬的母源抗體持續(xù)期為70 d，HCLV組仔豬母源抗體持續(xù)期為28 d，未免疫對照組為14 d，詳見表4。

表3 試驗(yàn)豬免疫前后血清豬瘟中和抗體滴度（log2，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Table 3 The neutralization antibody against CSFV in sows before and after vaccination （log2，Mean±SD）

仔豬血清中和抗體測定結(jié)果與ELISA檢測結(jié)果一致，即仔豬1日齡時(shí)抗體水平最高，E2亞單位疫苗組可達(dá)10.3log2。隨日齡增大，豬瘟抗體呈逐漸下降趨勢，斷奶前下降緩慢，斷奶后（21日齡）抗體水平開始明顯下降，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[11-12]。其中E2亞單位疫苗組仔豬10周齡時(shí)中和抗體滴度為5.3±2.1log2，12周齡時(shí)已下降至3.8±1.5log2；HCLV組在4周齡時(shí)中和抗體滴度為5.8±1.9log2，6周齡時(shí)中和抗體滴度下降至3.9±2.3log2；對照組在4周齡時(shí)中和抗體滴度已下降至4log2以下。有研究報(bào)道豬瘟中和抗體滴度為1∶8～1∶16是豬瘟抗體保護(hù)的臨界線[13-14]，所以本研究以中和抗體滴度幾何均值不低于1∶16為母源抗體持續(xù)期的判定標(biāo)準(zhǔn)，E2亞單位疫苗組仔豬母源抗體持續(xù)期最長，仔豬母源抗體可持續(xù)至70 d，HCLV組為28 d，對照組母源抗體持續(xù)期最短，為14 d（圖1）。

表4 仔豬母源抗體ELISA檢測結(jié)果Table 4 Maternal antibody by blocking ELISA in piglets

圖1 仔豬血清豬瘟中和抗體滴度（log2）測定結(jié)果Fig.1 The result of neutralization antibody titer in different ages of piglets (log2)

國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道的仔豬母源抗體半衰期差異較大，不僅受母豬品種、疫苗類型、免疫程序、飼養(yǎng)管理水平等影響較大，而且與其統(tǒng)計(jì)分析方法有關(guān)，并未見半衰期計(jì)算方法[15-16]。本研究為了比較同等條件下兩種疫苗的母源抗體半衰期，用SPSS 13.0軟件，以斷奶后仔豬（21日齡斷奶）抗體監(jiān)測日齡為自變量，中和抗體滴度的自然對數(shù)值為因變量，用線性回歸分析，擬合了斷奶仔豬母源抗體的衰減曲線，由此得到線性回歸方程，根據(jù)公式計(jì)算不同免疫組的仔豬母源抗體半衰期。分析結(jié)果表明，同等條件下E2組仔豬母源抗體半衰期最長，為10.5 d，HCLV組為7.5 d。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，母豬分娩后血清中和抗體滴度與1日齡仔豬血清中和抗體滴度間呈顯著正相關(guān)（R2=0.96），與國內(nèi)外學(xué)者研究結(jié)果一致，即仔豬母源抗體受母豬抗體影響大，兩者成顯著正相關(guān)，母豬豬瘟抗體高則其所產(chǎn)仔豬母源抗體滴度高[17-18]。

豬瘟E2亞單位疫苗是利用昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)的E2重組蛋白與進(jìn)口油佐劑乳化而制成的新型基因工程疫苗，可通過Erns、E2抗體的測定區(qū)分疫苗免疫與野毒感染豬，有助于豬場豬瘟凈化。為了更好地使用E2亞單位疫苗防控豬瘟，確定仔豬首免日齡，對于合理制定適合本疫苗的免疫程序具有重要的意義，本研究對比了豬瘟E2亞單位疫苗和豬瘟兔化弱毒苗免疫妊娠母豬后本體及其所產(chǎn)仔豬體內(nèi)豬瘟抗體的衰減規(guī)律。結(jié)果表明，妊娠母豬免疫E2疫苗后，無任何注苗引起的不良反應(yīng)；免疫后抗體水平顯著提高，受自身抗體干擾影響小，所產(chǎn)仔豬的中和抗體滴度高、半衰期短、持續(xù)性長，可持續(xù)至70日齡，顯著優(yōu)于其他試驗(yàn)組。免疫HCLV疫苗后，抗體水平有所提升，但所產(chǎn)仔豬母源抗體持續(xù)期短，為28 d。

本研究掌握了豬瘟E2亞單位疫苗母源抗體衰減規(guī)律，明確了仔豬首免日齡為70日齡，不僅為該疫苗在臨床上免疫程序的合理制定提供了依據(jù)，而且有效地減輕了仔豬早期免疫負(fù)擔(dān)、提高了疫苗免疫功效，為實(shí)現(xiàn)育肥豬免疫一針豬瘟疫苗出欄上市奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。