犬細(xì)小病毒的遺傳變異及流行情況分析

由海波，韓志強(qiáng)，史 赫，宋興超，趙家平，王全凱，李滋睿，徐 超

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春130112；2.長(zhǎng)春百克生物科技有限公司，長(zhǎng)春130012；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春130118）

犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus，CPV）于20世紀(jì)70年代末被發(fā)現(xiàn)，并在2年內(nèi)傳播到全球犬群，隨后十幾年間演化出多種新的抗原變體。犬細(xì)小病毒包含2個(gè)主要的開(kāi)放讀碼框（open reading frame，ORF），其中一個(gè)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2；另一個(gè)編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2，構(gòu)成衣殼的主要蛋白是VP2，VP2上幾個(gè)關(guān)鍵堿基和氨基酸的變化能夠改變抗原特征和宿主范圍。由于CPV變異的宿主范圍復(fù)雜多樣，不僅在家養(yǎng)貓和犬身上發(fā)現(xiàn)其身影，還在多種野生動(dòng)物和毛皮動(dòng)物中廣泛傳播，對(duì)其變異及流行所帶來(lái)的危害亟需引起人們的關(guān)注。

1 犬細(xì)小病毒的遺傳變異

1.1 起源CPV自1978年以來(lái)在亞洲、美洲和歐洲廣泛傳播[1]。早在1900年左右，貓細(xì)小病毒（Feline parvovirus，F(xiàn)PV）被發(fā)現(xiàn)，隨后在出現(xiàn)腹瀉癥狀的水貂和狐貍體內(nèi)分別發(fā)現(xiàn)了水貂腸炎病毒（Mink enter virus，MEV）和狐貍腸炎病毒（Fox enter virus，F(xiàn)EV），經(jīng)過(guò)數(shù)十年環(huán)境變化與病毒進(jìn)化（VP2蛋白特異性變化），1978年前后演化出可以感染犬的CPV-2。隨后相繼演化出CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c，New CPV-2a、New CPV-2b等新基因型，其中CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c既可感染犬又可感染貓。CPV分離株與貓細(xì)小病毒（Feline parvovirus，F(xiàn)PV）、水貂細(xì)小病毒（Mink parvovirus，MPV）、浣熊細(xì)小病毒（Raccon parvovirus，RPV）、貉細(xì)小病毒（Raccon dogs parvovirus，RDPV）和藍(lán)狐細(xì)小病毒（Blue fox parvovirus，BFPV）的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系表明，上述所有的細(xì)小病毒均源于一個(gè)共同祖先，并且與水貂、狐貍、浣熊等不同野生動(dòng)物的細(xì)小病毒基本相似[1-2]（圖1）。

1.2 抗原變異CPV自20世紀(jì)70年代在世界范圍內(nèi)廣泛傳播后，很快產(chǎn)生幾種不同抗原變體。一種是于1979年出現(xiàn)的CPV-2a（VP2中含有5個(gè)氨基酸替換），出現(xiàn)后很快取代CPV-2成為新的優(yōu)勢(shì)譜系，并且恢復(fù)了感染貓的能力，成為許多食肉動(dòng)物中最常見(jiàn)的病毒[3]；另一種是于1984年出現(xiàn)的CPV-2b，在VP2基因中有一個(gè)新的氨基酸替換（Asn426Asp），而后VP2基因又出現(xiàn)新的氨基酸替換（Ser297Ala）產(chǎn)生了New CPV-2a和New CPV-2b變異株[4]；在2000年，另一種新的變體CPV-2c又以另一個(gè)新的氨基酸取代（Asp426Glu）為特征出現(xiàn)[5]。有研究者認(rèn)為最早的CPV-2c毒株是在1996年分離出來(lái)的，并證明該變體在意大利首次檢測(cè)前4年已在德國(guó)流通[6]。三個(gè)變體之間的抗原基因差異主要源于426殘基的變化（圖1）。CPV-2a和CPV-2b的DNA序列分析表明，CPV-2b與CPV-2a在VP2蛋白中僅有兩種氨基酸不同，CPV-2b的兩個(gè)特定的編碼變化導(dǎo)致VP2殘基426和555存在差異，VP2 殘基555（Ile-Val）的替換代表了CPV-2序列的逆轉(zhuǎn)或保留，只有殘基426的差異決定了表位的改變并代表了CPV-2b特有的替換[7]。由于CPV-2b和CPV-2c抗原株僅在一個(gè)位置與CPV-2a不同，因此現(xiàn)在有研究認(rèn)為它們僅是CPV-2a的變體而非不同的亞型[7]。

病毒如何在新宿主物種中感染和傳播是研究疾病發(fā)生的核心。除家貓和犬外，許多宿主物種都攜帶并感染與之密切相關(guān)的細(xì)小病毒。據(jù)調(diào)查，美國(guó)的浣熊多數(shù)攜帶細(xì)小病毒，并且可能存在至少20年的聯(lián)系[2]。大多數(shù)RPV序列都處于與CPV-2和CPV-2a毒株的中間位置。因此，RPV可能在CPV-2和之后出現(xiàn)的的CPV-2變體（CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c）之間的轉(zhuǎn)換中起到了中介作用，使之不僅能感染犬并且恢復(fù)感染貓的能力?；謴?fù)貓宿主范圍和獲得感染其他宿主能力可能是該病毒的一個(gè)選擇性?xún)?yōu)勢(shì)。其他野生動(dòng)物也可能在CPV-2的進(jìn)化和傳播中起到作用，例如狼（Canis lupus Linnaeus）、狐貍（Vulpes）和土狼（Proteles cristatus）等[8]。

1.3 CPV-2c遺傳演化趨勢(shì)1995年至2005年，CPV-2變種頻率在意大利發(fā)生了快速變化，CPV-2c幾乎完全替代了CPV-2b[6]。CPV-2c不僅存在于意大利，并且在德國(guó)、葡萄牙、西班牙、法國(guó)、希臘、澳大利亞、保加利亞、瑞典、美國(guó)、巴西、阿根廷、厄瓜多爾、墨西哥等多個(gè)國(guó)家廣泛存在[9-18]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，無(wú)論犬免疫狀況如何，CPV-2c在不同地理區(qū)域都普遍存在，并且通常與成年犬的嚴(yán)重疾病相關(guān)[16]。厄瓜多爾的一項(xiàng)CPV-2的三種變體感染情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，CPV-2a的患病率為57.1%（20/35），CPV-2b為8.5%（3/35），CPV-2c為34.3%（12/35）[19]。

圖1 CPV-2在犬中的進(jìn)化過(guò)程及其VP2蛋白中幾個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基在遺傳變異過(guò)程中的變化Fig.1 Some evolution of CPV-2 in dogs and changes in several key amino acid residues in the VP2 protein during genetic variation

在中國(guó)，于2010年通過(guò)測(cè)序首次證實(shí)了CPV-2c的存在，但直到2014年才在中國(guó)分離和鑒定出CPV-2c并且鑒定其具有新的突變，這表明CPV仍在中國(guó)繼續(xù)發(fā)展，疫苗接種策略可能需要重新評(píng)估[20]。2015年，中國(guó)臺(tái)灣首次報(bào)告了CPV-2c，疑似感染細(xì)小病毒的99只犬中有88個(gè)樣本獲得CPV-2分離株，鑒定出CPV-2a（19.3%）、CPV-2b（26.1%）和CPV-2c（54.6%）[20]。2015年（1-12月）和2016年（1-4月）的CPV-2c檢出率分別為53.1%（26/49）和68.8%（22/32）。綜上數(shù)據(jù)顯示，CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c在臺(tái)灣地區(qū)共同傳播，CPV-2c是目前的主要變體（圖2）。盡管CPV-2c感染導(dǎo)致的臨床癥狀與CPV-2a和CPV-2b幾乎相同，包括厭食、嘔吐、急性胃腸炎和出血性腹瀉，但CPV-2c感染預(yù)示著更嚴(yán)重的疾病[21]。有研究證實(shí)，目前的CPV-2疫苗對(duì)CPV-2c防控具有一定有效性[22-23]，但也有證據(jù)表明，具有完整疫苗接種計(jì)劃的犬只仍攜帶CPV-2c[20]。因此，目前的疫苗對(duì)新型CPV-2c變異體的療效還有待評(píng)估，特別是在新型CPV-2c變異體與CPV-2c原型相比所觀察到的氨基酸替換方面仍需更多深入的研究。越來(lái)越多研究提示我們，CPV-2c可能以一種更強(qiáng)的趨勢(shì)發(fā)展，全世界需要對(duì)這種新型CPV-2c變異體進(jìn)行持續(xù)和深入的監(jiān)測(cè)。

2 犬細(xì)小病毒的國(guó)內(nèi)最新進(jìn)展

2.1 CPV-2毒株自然感染貓Li等[25]在我國(guó)河南省對(duì)在貓糞便中檢測(cè)到的CPV毒株進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)河南省貓群中FPV、New CPV-2a和CPV-2呈共循環(huán)，VP2基因的297與562位氨基酸發(fā)生突變，疑似為CPV-2疫苗株與野毒株的重組毒株。這是首次證明CPV-2在自然條件下也存在于貓?bào)w內(nèi)。提示有必要繼續(xù)監(jiān)測(cè)中國(guó)境內(nèi)貓的細(xì)小病毒感染。

圖2 2015-2016年臺(tái)灣地區(qū)CPV-2變種Fig.2 CPV-2 varieties in Taiwan from January 2015 to April 2016

2.2 東北地區(qū)貓?jiān)慈?xì)小病毒的調(diào)查Niu等[26]在調(diào)查東北地區(qū)貓?jiān)醇?xì)小病毒的流行情況中發(fā)現(xiàn)2份貓?jiān)碈PV陽(yáng)性樣品。遺傳進(jìn)化分析表明，其分屬于CPV-2a與CPV-2b，與國(guó)內(nèi)犬CPV分離株具有一致的變異位點(diǎn)，進(jìn)化樹(shù)處于同一分支。VP2基因323與324位氨基酸主要影響細(xì)小病毒與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）的結(jié)合，并影響宿主范圍。兩株貓?jiān)慈?xì)小病毒324位氨基酸（Tyr→Ile）的改變，可能是造成犬細(xì)小病毒感染貓的主要原因。

2.3 新型CPV-2存在于我國(guó)貉群中目前，貉細(xì)小病毒性腸炎于世界各地廣泛存在[27]。齊宇等[28]分離到1株貉細(xì)小病毒（RDPV-SD1607），分析發(fā)現(xiàn)RDPV-SD1607處于CPV-2分支，且處于CPV-2和CPV-2a分支之間，說(shuō)明RDPV-SD1607株與CPV-2具有共同的遺傳起源，推測(cè)其可能正處于CPV-2亞型向CPV-2a亞型進(jìn)化的中間狀態(tài)，或是CPV適應(yīng)貉而形成的新毒株。目前RDPV已經(jīng)在中國(guó)的貉中傳播了至少8年，并處于持續(xù)進(jìn)化中，替代宿主和中間宿主通常為廣泛分離的宿主物種之間的病毒轉(zhuǎn)移提供橋梁[2]。所以有必要在世界各地進(jìn)行進(jìn)一步的積極和仔細(xì)的流行病學(xué)調(diào)查，以了解RDPV在我國(guó)各地區(qū)和世界范圍內(nèi)CPV的演變動(dòng)態(tài)。

3 犬細(xì)小病毒的流行情況

3.1 我國(guó)各地區(qū)CPV流行基因型王洋等[29]從北京分離到1株CPV強(qiáng)毒株，確定為New CPV-2a。張雙等[30]從吉林省分離到6株病毒，其中5株屬于New CPV-2a，1株屬于New CPV-2b。陳強(qiáng)等[31]對(duì)從貴陽(yáng)市分離到10株CPV病毒，其中7株屬于CPV-2a，3株屬于CPV-2c。徐閏等[32]對(duì)南寧地區(qū)12個(gè)CPV毒株分析發(fā)現(xiàn)，有3株屬于CPV-2a、3株屬于CPV-2b、6株屬于CPV-2c，提示CPV-2c在國(guó)內(nèi)呈上升趨勢(shì)。Zhuang等[33]發(fā)現(xiàn)四川地區(qū)New CPV-2a、New CPV-2b和CPV-2c共同傳播。吳雙等[34]在江蘇省泰州3只病犬中分離到1株CPV病毒，經(jīng)分析確定屬于CPV-2a。

3.2 國(guó)外部分地區(qū)流行基因型Mira等[35]首次證實(shí)New CPV-2a存在于意大利。Fagbohun等[36]報(bào)道了尼日利亞地區(qū)CPV-2a為主要變體，其次是CPV-2b和CPV-2c。Cargnelutti等[37]發(fā)現(xiàn)巴西南部犬體內(nèi)CPV的存在具有較高的多樣性，其中CPV-2c占優(yōu)勢(shì)，其次分別為New CPV-2a、CPV-2b、New CPV-2b。此外，還發(fā)現(xiàn)1株與原始CPV-2相似的分離株，預(yù)示著CPV-2的重新出現(xiàn)和疫苗株的進(jìn)化。Faz等[38]采用PCR調(diào)查發(fā)現(xiàn)墨西哥地區(qū)犬中最常見(jiàn)的變體是CPV-2。Clark等[39]報(bào)告澳大利亞犬中出現(xiàn)了CPV-2b感染。2016-2018年，Charoenkul等[40]在泰國(guó)犬和貓中發(fā)現(xiàn)了CPV-2c。Son等[41]在韓國(guó)浣熊體內(nèi)檢測(cè)到CPV-2與以前報(bào)告的韓國(guó)家養(yǎng)犬的CPV-2a和CV-2b毒株不同。

3.3 野生動(dòng)物中的流行情況Filipov等[14]在保加利亞發(fā)現(xiàn)1只狼（Canis lupus）和1只紅狐（Vulpes Vulpes）均感染CPV-2a。在德國(guó)的虎（Panthera tigris altaica）糞便樣本中也發(fā)現(xiàn)了CPV-2a序列[42]。Steinel等[43]在納米比亞和美國(guó)的6只獵豹（Acinonyx jubatus）及納米比亞的1只蝙蝠耳狐（Otocyon megalotis）中均檢測(cè)到CPV-2b。葡萄牙采集的1種石貂（Martes foina）分離物中存在CPV-2b[44]。在一組亞洲小爪水獺（Aonyx cinerea）中診斷出CPV-2c[45]感染。通過(guò)對(duì)VP2基因系統(tǒng)發(fā)育分析將中國(guó)的小熊貓細(xì)小病毒（RPPV）分類(lèi)為CPV-2a，并發(fā)現(xiàn)氨基酸序列中呈現(xiàn)出一種不尋常的變異，證明CPV持續(xù)進(jìn)化[46]；CPV持續(xù)進(jìn)化的另一個(gè)證據(jù)是，大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）VP2基因的突變，該突變被歸類(lèi)為CPV-2a型[47]。

綜上，目前我國(guó)流行的犬細(xì)小毒株有New CPV-2a、New CPV-2b、CPV-2c，其中以New CPV-2a為主，CPV-2b和CPV-2c主要在南方流行，在北方較少。而世界范圍內(nèi)的CPV基因型的變異復(fù)雜化且無(wú)明顯的規(guī)律性，說(shuō)明連續(xù)分子調(diào)查是十分必要的，可獲得更多關(guān)于新CPV突變體有效傳播的信息。CPV三個(gè)變體在野生動(dòng)物中均驗(yàn)證存在，但CPV-2c比少，CPV-2a和CPV-2b更為常見(jiàn)。雖然細(xì)小病毒在環(huán)境中相對(duì)穩(wěn)定，但間接傳播在種群中，特別是在以動(dòng)物間接觸率低為特征的野生食肉種群中，對(duì)病毒的傳播和維持起著重要作用。家畜和野生食肉動(dòng)物之間的跨物種傳播也因此變得更容易發(fā)生。

4 展望

由于多種跨物種傳播事件的發(fā)生，非馴養(yǎng)動(dòng)物受犬細(xì)小病毒變異感染的多樣性顯著。與家犬相比，對(duì)其他宿主的CPV流行病學(xué)和進(jìn)化有更好的了解顯得尤為重要。近年來(lái)，在貓?jiān)醇?xì)小病毒調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，CPV有逐漸代替FPV成為感染貓的主要細(xì)小病毒的發(fā)展趨勢(shì)。多重感染的不斷出現(xiàn)預(yù)示著將來(lái)可能出現(xiàn)FPV與CPV不同基因亞型混合感染的頻繁發(fā)生以及CPV感染貓后發(fā)生基因變異，形成更多新的基因亞型與流行毒株。如：CPV-2c、CPV-2c(a)、CPV-2c(b)型。病毒傳播模式對(duì)于理解新變種或毒株的引入途徑也顯得至關(guān)重要，這可能使流行病學(xué)情況復(fù)雜化，影響疾病模式，尤其可能顯示新毒株的不同毒性和臨床相關(guān)性，并損害疫苗的效力，所以需要了解變異。本文提供的信息有助于了解CPV的遺傳變異、CPV-2c遺傳演化趨勢(shì)、CPV的最新進(jìn)展及多個(gè)變體在國(guó)內(nèi)外的流行情況，并為CPV的防控提供了可靠的信息借鑒。