湖南省部分地區(qū)豬、雞源糞腸球菌耐藥性及多位點序列分型分析

蔣逸凡，李岱霞，鮑翔宇，黎滿香

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，長沙 410128）

糞腸球菌（Enterococcus faecalis）是一種革蘭氏陽性菌，廣泛存在于口腔、土壤等環(huán)境中。是人和動物胃腸道內(nèi)微生物群落的重要組成部分，數(shù)量僅次于大腸桿菌[1]。一般情況下，糞腸球菌很難引起機體發(fā)病[2]，但當(dāng)機體的免疫環(huán)境遭到抑制或破壞時，則會引起感染。在引起人心內(nèi)膜炎感染的病原菌中，糞腸球菌居第二位，僅次于大腸埃希菌；由糞腸球菌引起的菌血癥感染率居第三位，僅次于金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌。糞腸球菌還可引起豬、雞感染發(fā)病和死亡，如引起鶉雞敗血癥和公豬睪丸炎、仔豬關(guān)節(jié)炎，造成雞胚死亡和產(chǎn)弱雛等[3-4]，給規(guī)?；i、雞養(yǎng)殖場帶來經(jīng)濟損失。

隨著對糞腸球菌的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)抗菌藥物的濫用和糞腸球菌的獲得性耐藥，使其耐藥性大大增加，對某些常用抗生素幾乎達(dá)到完全耐藥[5]。糞腸球菌的耐藥性主要分為染色體介導(dǎo)的天然性耐藥和染色體外遺傳物質(zhì)所誘導(dǎo)的獲得性耐藥。該菌的天然耐藥性比臨床上許多其他革蘭氏陽性菌都要強，且更容易被誘導(dǎo)進而對許多抗菌藥物產(chǎn)生獲得性耐藥[6]。

相對傳統(tǒng)的分子分型技術(shù)而言，細(xì)菌多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）技術(shù)具有更高的分辨率與更強的重復(fù)性，且更簡單方便。因此該方法已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌生物學(xué)及種群進化分析的研究中。歐洲部分研究[7-8]表明，糞腸球菌產(chǎn)內(nèi)酰胺酶菌株或耐萬古霉素菌株大多屬于CC2、CC16及CC87 3個克隆群，位于CC16克隆群的糞腸球菌多重耐藥菌株在社區(qū)和院內(nèi)都有分布，且在社區(qū)中極大多數(shù)為ST16型的糞腸球菌菌株都表現(xiàn)為對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥。本研究欲以豬、雞源糞腸球菌為例，對湖南部分地區(qū)養(yǎng)殖場分離株的耐藥性進行檢測，并通過MLST對糞腸球菌多重耐藥株可能的來源及優(yōu)勢菌型等進行分析，以初步了解該地養(yǎng)殖場中動物源糞腸球菌多重耐藥株的流行趨勢，為糞腸球菌感染的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離與鑒定2018年分離自湖南省寧鄉(xiāng)、衡陽、常德、瀏陽4個不同地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場健康豬、雞源采集的254份肛門拭子共81株糞腸球菌，包括豬源38株，雞源43株。拭子樣品接種于糞腸球菌顯色培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)并篩選單個紫紅色帶光澤的圓形菌落進行革蘭氏染色鏡檢；參照文獻[9]設(shè)計引物，提取可疑菌株DNA，利用PCR對菌株進行鑒定，PCR程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；53℃復(fù)性30 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。質(zhì)控菌株糞腸球菌（ATCC29212）由湖南省藥物監(jiān)察所饋贈。

1.2 主要試劑2×PCR Mix購自北京天恩澤基因科技有限公司；DNA marker購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；腸球菌顯色培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；PCR引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成；革蘭氏陽性菌藥敏試驗試劑盒購自天津市金章科技發(fā)展有限公司。

1.3 藥敏試驗按照2018年美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards，CLSI）推薦的抗菌藥物敏感性實驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，按照天津市金章科技發(fā)展有限公司革蘭氏陽性菌藥敏試驗試劑盒使用說明，使用肉湯稀釋法測定臨床上使用較多的萬古霉素、慶大霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、氧氟沙星、紅霉素、頭孢西丁、復(fù)方新諾明8種抗菌藥物的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concerntration，MIC）。取生理鹽水潤濕后的無菌棉簽，從過夜培養(yǎng)皿上挑取數(shù)個新鮮菌落，于適量無菌生理鹽水中混勻，選用標(biāo)準(zhǔn)比濁管調(diào)整菌液濃度至0.5麥?zhǔn)蠁挝?，吸?20 μL菌液與24 mL肉湯充分混勻，吸取菌懸液100 μL接種于含不同藥物濃度的96孔細(xì)菌定量藥敏試劑盒中，空白對照孔加入100 μL無菌肉湯。觀察沒有產(chǎn)生沉淀的最小濃度，其所含最低抗菌藥物濃度即為最小抑菌濃度，再結(jié)合CLSI規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)耐藥折點來判斷分離株是否耐藥。

1.4 糞腸球菌的MLST分析從75株多重耐藥的糞腸球菌中選取耐藥譜較廣的35株，采用水煮法提取DNA，制備PCR模板，引物序列參照文獻[13]設(shè)計，并由北京擎科生物科技有限公司合成，PCR擴增7個管家基因的目的片段。PCR程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；按照各管家基因特異性引物要求的退火溫度設(shè)置，時間為30 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR擴增產(chǎn)物純化后進行測序，將測序序列提交至MLST數(shù)據(jù)庫進行比對，確定菌株的各個等位基因的序號并提交數(shù)據(jù)庫，可得到菌株確定的序列型，即ST型。應(yīng)用eBURST軟件分析所有菌株的MLST結(jié)果及其在整個糞腸球菌數(shù)據(jù)庫中的分布情況，通過繪制聚類分析圖來研究各個實驗菌株ST型之間的親緣關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 81株糞腸球菌分離株對8種抗菌藥物的耐藥結(jié)果對分離到的81株糞腸球菌進行8種抗菌藥物的藥敏試驗，結(jié)果表明，豬源與雞源分離株對同種藥物的耐藥率較為相似，不同地區(qū)的分離株對同種藥物的耐藥情況卻存在一定差異；81株分離菌對四環(huán)素、紅霉素及頭孢西丁耐藥最嚴(yán)重，耐藥率均在90%以上，與王送林[10]2015年報道的湖南省豬源糞腸球菌耐藥結(jié)果相比較發(fā)現(xiàn)，耐四環(huán)素和紅霉素的豬源糞腸球菌在湖南地區(qū)仍然占據(jù)著較高比例（90%以上）。對氧氟沙星和氟苯尼考的耐藥相對嚴(yán)重，耐藥率為60%～80%，對萬古霉素普遍敏感，僅在衡陽地區(qū)發(fā)現(xiàn)1株雞源糞腸球菌對萬古霉素耐藥，具體耐藥結(jié)果見表1、表2。由此可知，不同地區(qū)的分離株對8種抗菌藥物的耐藥結(jié)果存在差異，與李金磊等[11]報道的河南省4個地區(qū)豬、雞源糞腸球菌的結(jié)果相似，這可能與各地用藥情況及水平存在直接關(guān)系；通過比較可知，4個地區(qū)均對四環(huán)素、紅霉素和頭孢西丁耐藥嚴(yán)重，耐藥率有的高達(dá)100%，此結(jié)果與我國大部分地區(qū)報道的相關(guān)耐藥結(jié)果相似[13-14]；寧鄉(xiāng)地區(qū)糞腸球菌對慶大霉素的耐藥率明顯高于其他3個地區(qū)（P<0.05）；衡陽地區(qū)分離株對氟苯尼考、氧氟沙星、紅霉素、復(fù)方新諾明以及頭孢西丁的耐藥率均低于其他3個地區(qū)，且出現(xiàn)了1株7重耐藥雞源耐萬古霉素糞腸球菌；常德地區(qū)分離株對氧氟沙星的耐藥率顯著高于其他地區(qū)（P<0.05）；瀏陽地區(qū)分離株對復(fù)方新諾明的耐藥性均顯著高于其他地區(qū)（P<0.01）。萬古霉素作為醫(yī)院常用的臨床治療藥物，在養(yǎng)殖場中暫未被提倡為常規(guī)用藥，因此糞腸球菌對該藥普遍敏感，而本次試驗分離到1株雞源耐萬古霉素糞腸球菌，說明耐萬古霉素糞腸球菌可能通過環(huán)境或相關(guān)途徑傳播到了該雞場中，因此，對耐萬古霉素菌株可能的來源及發(fā)展值得引起關(guān)注。

本次試驗中有75株糞腸球菌對3種及3種以上抗菌藥物耐藥，多重耐藥率達(dá)92.6%；豬源與雞源分離株的多重耐藥率均超過92%，且都以5重耐藥（25.8%、37.5%）和6重耐藥（31.4%、27.5%）為主；在4個地區(qū)中，寧鄉(xiāng)與瀏陽地區(qū)的糞腸球菌分離株全部對3種及3種以上的抗菌藥物耐藥（100%），常德地區(qū)的多重耐藥菌株所占比例為95%，且以5重耐藥和6重耐藥菌株居多；衡陽地區(qū)的多重耐藥率為75%，且以3重耐藥與4重耐藥菌株居多；除常德地區(qū)外，7重耐藥菌株在其他3地均有少量發(fā)現(xiàn)，沒有發(fā)現(xiàn)對8種抗菌藥物全部耐藥的菌株。

2.2 糞腸球菌MLST分析35株糞腸球菌共分為21個ST型，其中包括ST32型3株、ST16型4株、ST476型3株、ST480型4株；ST828、ST903、ST553、與ST416型各包含2株；除此之外，其余序列型在本次試驗中均只包含1個菌株。35株糞腸球菌分型結(jié)果見表3。對35株糞腸球菌的ST型進行比較可知，不同地區(qū)不同動物來源的糞腸球菌擁有豐富的ST型，但總的來說具有相同或相似ST型的菌株大多來自同一地區(qū)，這與張秀方[14]的研究結(jié)果一致。其中，17個豬源分離株共分為11個ST型，18個雞源分離株共包含10個ST型。本次研究成功構(gòu)建了21個ST型的克隆圖譜（圖1），由圖可知，21個ST型分為了3個組別與10個獨立型。圖中ST16處于核心位置，是經(jīng)eBURST運算推測的試驗菌株的祖先ST型（即Founder），ST553、ST363、ST265、ST372以及ST541型以它為中心，與該型的親緣關(guān)系較近；組別2由ST480、ST663及ST846組成；組別3由ST476和ST828組成，組別4由ST32和ST846組成；10個獨立序列型分別為ST538、ST823、ST903、ST494、ST556、ST416、ST334、ST32、ST826和ST618，它們的親緣關(guān)系較為疏遠(yuǎn)。在7個管家基因里，擁有5個及5個以上相同等位基因編號的ST屬于同一個復(fù)合克隆群，將本試驗的21個ST型與整個數(shù)據(jù)庫的ST型導(dǎo)入該軟件進行分析，結(jié)果見圖2。本試驗通過eBURST數(shù)據(jù)分析軟件得到的優(yōu)勢CC群共有4個（CC16、CC480、CC476、CC4），其中CC16（ST16、ST363、ST372、ST541、ST265、ST553）所覆蓋的糞腸球菌數(shù)量最多，占比28.6%。ST16型是CC16群的優(yōu)勢ST型，也是經(jīng)eBRUST軟件推測出的35株糞腸球菌的祖先序列型，一般認(rèn)為位于同一子群的優(yōu)勢ST型其分化時間相對來說較長，并逐漸向不同地區(qū)分布并進化，當(dāng)這些菌株序列發(fā)生突變或是重組，便會產(chǎn)生豐富的ST型，由此可初步推測本研究中的35株多重耐藥糞腸球菌可能由同一ST16型祖先菌株分化而來。這些菌株在寧鄉(xiāng)、衡陽等地區(qū)均有分布，且大多為豬源糞腸球菌（7/10）。位于CC480（ST480、ST663、ST846）的3個ST型總共包括6株菌株，其中，寧鄉(xiāng)豬源2株、雞源1株，衡陽雞源1株，常德雞源2株；位于同一CC群的ST476與ST828，共包含5株菌株，且均為豬源；位于CC4（ST32、ST334）的菌株有4株，且均為雞源。除此之外，其他CC群以及余下的獨立ST型在不同地區(qū)的豬、雞源分離株中均有少量分布。

表1 糞腸球菌分離株對8種抗菌藥物的耐藥結(jié)果Table 1 Resistance results of 8 antibiotics in Enterococcus faecalis isolates

表2 豬、雞源糞腸球菌對8種抗菌藥物的耐藥結(jié)果Table 2 Resistance results to 8 antibiotics of Enterococcus faecalis isolated from swine and chickens

2.3 優(yōu)勢CC群糞腸球菌的耐藥性比較對本次試驗中的4個優(yōu)勢CC群（CC16、CC480、CC476、CC4）糞腸球菌的多重耐藥情況進行比較，4個CC群中的分離株均對四環(huán)素、紅霉素及頭孢西丁表現(xiàn)為耐藥；其中，有2株ST16型菌株的多重耐藥譜完全相同，均為5重耐藥菌（慶大霉素+四環(huán)素+氧氟沙星+紅霉素+頭孢菌素），有2株ST480菌株的耐藥譜僅存在1處差異，說明同一ST型的菌株可能具有相同或相似的多重耐藥譜，與李巖等[12]的研究結(jié)果相似。除此之外，CC16群分離株對慶大霉素耐藥率（90%）明顯高于其他CC群（P<0.05）；CC4（100%）菌株對氟苯尼考的耐藥率明顯高于CC16（60%）和CC480（16.7%），且本研究中唯一的1株耐萬古霉素雞源糞腸球菌也包括在該群中；CC476群菌株對氧氟沙星的耐藥率（100%）也比其他3個CC群高；CC480分離株對復(fù)方新諾明及氟苯尼考的耐藥率低于其他3個CC群。研究還表明[15]，CC16和CC4均是糞腸球菌流行的主要CC群，在抗生素的選擇性壓力下，某些分化已久且適應(yīng)性較強CC群便會成為優(yōu)勢克隆群，優(yōu)勢CC群的流行又可以促進耐藥性菌株的傳播，這一惡性循環(huán)勢必會給人類及動物健康帶來潛在威脅，故針對不同CC群糞腸球菌的不同耐藥特征，合理使用抗菌藥物，對糞腸球菌感染的臨床治療具有一定指導(dǎo)意義。

表3 糞腸球菌15個ST型的等位基因譜Table 3 Allele spectrum of 15 ST types in Enterococcus faecalis

圖1 35株糞腸球菌21個ST型的eBRUST圖Fig.1 The eBURST map about 21 STs of 35 Enterococcus faecalis

圖2 糞腸球菌MLST全局分布圖Fig.2 MLST global distribution map of Enterococcus faecalis