口蹄疫兔化弱毒疫苗ZBatt株與其親本強(qiáng)毒株生物學(xué)特性的比較研究

朱明旺，王繼華，高華峰，劉紹陽，彭正啓，信愛國

（1.云南省獸醫(yī)生物制品研制中心，保山 678000；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 國家口蹄疫專業(yè)實(shí)驗(yàn)室（昆明），昆明650224；3.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224）

口蹄疫（foot-and-mouth，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起，侵襲豬、牛、羊等偶蹄動(dòng)物的急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病傳播速度快、流行范圍廣，病毒可通過接觸易感動(dòng)物和空氣傳播，易感動(dòng)物接觸病毒后2～3 d產(chǎn)生臨床癥狀，并能夠持續(xù)7～10 d，發(fā)病率為100%，幼畜經(jīng)常不見癥狀而猝死，死亡率因病毒株而異，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)100%。FMDV目前已知有7個(gè)不同的血清型（A、O、C、Asia 1和南非1、2、3型），在每個(gè)血清型內(nèi)存在多種亞型，不同血清型間無交叉免疫性。FMD流行具有明顯的地域性[1]，Asia 1型FMD是第7個(gè)被確認(rèn)的血清型[2]，目前主要流行于南亞及東南亞地區(qū)[3-4]。

1958年4月云南省保山地區(qū)發(fā)生疑似FMD疫情，從病樣中分離到1株FMDV，命名為中國保山型，簡稱“中保型（ZB型）”[5]。1980年代，采用來源于世界FMD參考實(shí)驗(yàn)室（WRLFMD，英國Pirbright實(shí)驗(yàn)室）的標(biāo)準(zhǔn)血清，確定云南分離ZB型FMDV為“Asia 1”型[5-6]。1958年底，研究者開始將ZB野生強(qiáng)毒株接種3～5日齡乳兔進(jìn)行繼代培育，研發(fā)FMD兔化弱毒疫苗。病毒傳至第50代、64代，回歸牛體致病明顯；傳至第109代，回歸牛體毒力減弱，114代減毒株于健康牛舌面粘膜穿刺接種，進(jìn)行牛體安全試驗(yàn)，證明只有極少數(shù)牛在舌面注射部位發(fā)生少量原發(fā)性小水皰，不產(chǎn)生二期水皰；同居牛不感染；回歸牛體繼代4～6代不增強(qiáng)其致病力（賴天才：口蹄疫Asia 1型兔化毒的研究，1981年，內(nèi)部資料）。結(jié)果獲得了ZB株（血毒系）致弱毒株，其致病力和免疫原性達(dá)到口蹄疫弱毒疫苗的標(biāo)準(zhǔn)。該弱毒疫苗是采集發(fā)病乳兔肌肉和臟器，研磨后用pH7.6的磷酸鹽緩沖液稀釋至1%，取1 mL接種牛體，可以產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)效果，免疫持續(xù)期可達(dá)半年以上，1960-1980年曾用于云南省瀾滄江以西地區(qū)Asia 1型口蹄疫的免疫防治（內(nèi)部資料）。

由于FMD常規(guī)減毒活疫苗在使用過程中發(fā)現(xiàn)在假定宿主內(nèi)致弱的毒株對別的易感宿主具有致病性，存在弱毒疫苗株毒力返祖風(fēng)險(xiǎn)[7-8]。減毒疫苗在使用過程中仍然具有潛在的回復(fù)突變可能性，因此該兔化弱毒疫苗株ZBatt現(xiàn)已停止使用。比較ZBatt與其親本強(qiáng)毒株的生物學(xué)特性差異，可為深入研究ZBatt株減毒致弱機(jī)理提供毒力評價(jià)依據(jù)。本研究測定了ZBatt株和其親本強(qiáng)毒株感染不同來源的細(xì)胞的病變效應(yīng)，病毒對乳鼠、豚鼠的致病情況，比較了強(qiáng)毒株和弱毒株分別感染宿主細(xì)胞后幾個(gè)宿主因子mRNA表達(dá)差異，分析ZB強(qiáng)毒株和弱毒株的部分生物學(xué)表型差異，為評價(jià)病毒毒力差異的替代模型提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒株、細(xì)胞株、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物口蹄疫亞洲1型細(xì)胞組織培養(yǎng)弱毒ZB/CHA/58(att)（簡稱ZBatt）（GenBank登錄號：DQ533483）[5]，由云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院保存，系本室保存的“ZB”型兔化弱毒ZBRF187代適應(yīng)BHK-21細(xì)胞后保存?zhèn)溆?；?qiáng)毒株ZBCF222系牛舌皮組織毒適應(yīng)BHK-21細(xì)胞3代備用，由云南省獸醫(yī)生物制品研制中心（原口蹄疫保山疫苗廠）保存[9]；BHK-21細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫凍存；牛原代腎細(xì)胞和睪丸細(xì)胞由課題組制備；試驗(yàn)用乳鼠和豚鼠由云南省獸醫(yī)生物制品研制中心提供。

1.2 病毒對不同細(xì)胞的敏感性比較將弱毒株ZBatt和強(qiáng)毒株ZBCF222分別接種3種傳代細(xì)胞系（BHK-21、IBRS-2和PK）和牛原代腎（BK）細(xì)胞、牛原代睪丸（BT）細(xì)胞，觀察病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect, CPE）。

1.3 病毒對不同細(xì)胞的蝕斑形態(tài)比較將弱毒株ZBatt和強(qiáng)毒株ZBCF222稀釋成10-3、10-4、10-5，取0.2 mL分別接種于長滿單層BHK-21和BK細(xì)胞的24孔培養(yǎng)基中，每個(gè)稀釋度接種2孔，吸附1 h。將4×MEM與1.5%甲基纖維素以1:3的比例混合后加入2%血清和雙抗，充分混合配制病毒蝕斑覆蓋層，按照1 mL/孔加入到細(xì)胞板中。37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)觀察；48 h后，吸棄培養(yǎng)基中覆蓋液后加入結(jié)晶紫染色液500 μL/孔染色，室溫靜置30 min，洗去培養(yǎng)基中染色液，室溫干燥，觀察蝕斑結(jié)果。

1.4 病毒生長曲線測定首先測定弱毒株ZBatt和強(qiáng)毒株ZBCF222的TCID50備用。分別將病毒稀釋成100TCID50/0.1 mL，各取0.2 mL分別接種12孔板中長滿單層BHK-21細(xì)胞和BK細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種3孔。在接種后預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)分別收獲病毒，測定其TCID50，繪制病毒生長曲線。

1.5 病毒對乳鼠的生存曲線測定將ZBatt株和株ZBCF222分別稀釋為1TCID50/0.1 mL、0.1TCID50/0.1 mL和0.01TCID50/0.1 mL。選用3日齡乳鼠，隨機(jī)分為3組，每組8只，按200 μL/只依次接種3個(gè)稀釋度的病毒，注射后連續(xù)觀察7 d；記錄每組乳鼠的死亡數(shù)量和死亡時(shí)間，繪制乳鼠生存曲線。

1.6 病毒對豚鼠致病性觀察按照常規(guī)方法分別測定弱毒株ZBCF222和強(qiáng)毒ZBatt株的乳鼠LD50。分別用500LD50和1000LD50劑量，每只豚鼠在左后腳趾部皮內(nèi)接種0.2 mL病毒液，逐日觀察豚鼠發(fā)病情況，記錄結(jié)果。

1.7 病毒感染BK細(xì)胞宿主因子mRNA相對表達(dá)量測定研究表明，野生型FMDV毒株和L蛋白缺失減毒株感染牛源宿主細(xì)胞后，誘導(dǎo)宿主天然免疫反應(yīng)差異基因表達(dá)上調(diào)，主要與干擾素誘導(dǎo)基因、趨化因子和轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)[10]。據(jù)此，ZB強(qiáng)毒株和弱毒株感染BK細(xì)胞后，選擇測定與之相關(guān)的CCL2、IFN-β、ISG15、Mx1、OAS和PKR宿主因子相對定量表達(dá)水平，用于解析可能與ZB病毒致弱相關(guān)的宿主因子和信號通路。擴(kuò)增ZB株3D基因片段的熒光定量引物[11]和6種宿主因子熒光定量引物[10]信息詳見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。分別取0.2 mL 100TCID50/0.1 mL的強(qiáng)毒株ZBCF222和弱毒株ZBatt接種12孔板中長滿單層的牛原代腎（BK）細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種2孔。在接種后第12 h和24 h分別收獲病毒，測定病毒RNA的相對復(fù)制量和6種細(xì)胞宿主因子的mRNA相對表達(dá)量。試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)2次。

1.8 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±SD表示, 經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件Graphad Prism（Version 5.01）處理分析和圖像呈現(xiàn)。采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表示差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病毒感染不同細(xì)胞系的敏感性比較兔化弱毒株ZBatt和野生強(qiáng)毒株ZBCF222分別接種BHK-21細(xì)胞，經(jīng)24 h培養(yǎng)觀察，光鏡下均可看到有點(diǎn)狀細(xì)胞脫落、細(xì)胞變圓和核濃縮等現(xiàn)象，細(xì)胞產(chǎn)生典型的CPE。感染IBRS-2和PK細(xì)胞后，培養(yǎng)72 h均未見明顯的CPE，只是有一些不規(guī)則、散在的圓形細(xì)胞浮在正常細(xì)胞的上面；盲傳至第3代也沒有出現(xiàn)CPE，表明IBRS-2和PK細(xì)胞對ZB病毒感染不敏感。ZBatt株和ZBCF222株分別感染牛原代BK細(xì)胞和牛原代BT細(xì)胞，72 h后觀察到強(qiáng)毒株ZBCF222感染能夠?qū)е录?xì)胞產(chǎn)生CPE，而弱毒株ZBatt感染則不能產(chǎn)生CPE，表明ZBCF222對天然宿主來源細(xì)胞具有致病性，而ZBatt則呈現(xiàn)減毒表型。本研究在體外培養(yǎng)細(xì)胞上證實(shí)使用ZBatt減毒株制備弱毒疫苗的可靠性（圖略）。

2.2 病毒感染不同細(xì)胞的蝕斑形態(tài)比較觀察比較兔化弱毒株ZBatt和強(qiáng)毒株ZBCF222病毒在BHK-21細(xì)胞和BK細(xì)胞中的蝕斑形態(tài)，結(jié)果顯示二者在BHK-21細(xì)胞上均可產(chǎn)生明顯的CPE，形成大小相似的蝕斑；而在牛原代腎細(xì)胞上，強(qiáng)毒株ZBCF222病毒可以產(chǎn)生明顯的蝕斑，而弱毒株ZBatt病毒則無明顯的蝕斑形成（圖1），表明ZBCF222病毒感染牛原代細(xì)胞，而減毒株ZBatt對牛源細(xì)胞不具有感染性。

2.3 病毒對乳鼠及豚鼠的致病性試驗(yàn)結(jié)果按照常規(guī)方法，分別將ZBCF222和ZBatt病毒接種3～5日齡乳鼠，測定的其半數(shù)致死量（median lethal dose，LD50）。結(jié)果ZBCF222和ZBatt的LD50分別為10-7.3/0.2 mL和10-9.0/0.2 mL。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

圖1 ZBatt株和ZBCF222株感染BHK-21和牛原代腎細(xì)胞（BK）蝕斑形態(tài)比較Fig.1 Plaque morphology of the ZBatt and ZBCF222 strain in BHK-21 or BK cells

將ZBatt和ZBCF222分別接種乳鼠，測定病毒對乳鼠的生存曲線。結(jié)果顯示，1TCID50/0.1 mL高劑量組接種乳鼠24 h后，乳鼠出現(xiàn)典型的呼吸困難、后肢麻痹等癥狀，開始出現(xiàn)死亡，ZBatt在接種36 h致乳鼠全部死亡，ZBCF222在接種48 h后致乳鼠全部死亡（圖2A）；ZBatt對乳鼠的致病性強(qiáng)于ZBCF222（P<0.05）。中劑量組（0.1TCID50/0.1 mL），ZBatt 36 h后乳鼠有死亡，48 h全部死亡；而ZBCF222至7 d觀察結(jié)束時(shí)乳鼠的生存率為70%，ZBatt對乳鼠的致病力顯著強(qiáng)于ZBCF222（P<0.001）（圖2B）；低劑量組（0.01TCID50/0.1 mL），7 d試驗(yàn)觀察期內(nèi)乳鼠全部健活，二者無差別（圖略）。結(jié)果表明兔化弱毒株ZBatt對乳鼠的致病性高于野生型強(qiáng)毒株ZBCF222。

利用豚鼠作為小動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，比較ZBCF222和ZBatt的毒力差異。結(jié)果表明，低劑量500LD50/0.2 mL組，ZBCF222接種豚鼠后2～3 d發(fā)病，觀察到豚鼠精神萎糜，不愿活動(dòng)，食欲減少或廢絕，口角污穢不潔，流涎，產(chǎn)生繼發(fā)感染，趾部產(chǎn)生繼發(fā)水皰，皮膚脫離（圖3），發(fā)病率20%；ZBatt接種豚鼠均無明顯臨床癥狀出現(xiàn)。高劑量組（1000LD50/0.2 mL），接種ZBCF222后，豚鼠出現(xiàn)典型的臨床癥狀，產(chǎn)生嚴(yán)重的繼發(fā)感染，發(fā)病率為100%；接種ZBatt后豚鼠不表現(xiàn)臨床癥狀（表2）。結(jié)果表明野生型強(qiáng)毒株ZBCF222對豚鼠具有強(qiáng)的致病性，兔化弱毒株ZBatt對豚鼠呈現(xiàn)減毒表型。結(jié)果與ZBCF222和ZBatt對牛體的致病表現(xiàn)具有一致性，判斷豚鼠可作為ZB強(qiáng)毒株和弱毒株的毒力差異比較的試驗(yàn)動(dòng)物。

圖2 強(qiáng)毒株ZBCF222和弱毒株ZBatt接種乳鼠存活率比較結(jié)果Fig.2 Survival rate of suckling mice after challenge of ZBCF222(A) and ZBatt(B)

圖3 弱毒株ZBatt（A）和強(qiáng)毒株ZBCF222（B）接種豚鼠發(fā)病圖Fig.3 Pathological map of guinea pig inoculated with attenuated ZBatt(A) and virulent ZBCF222 strain(B)

2.4 病毒生長曲線測定結(jié)果ZBatt和ZBCF222的病毒效價(jià)分別為10-6.0TCID50/0.1 mL和10-5.8TCID50/0.1 mL。分別將病毒稀釋成100TCID50/0.1 mL，接種BHK-21和BK細(xì)胞，在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)收獲病毒，測定其TCID50，繪制病毒生長曲線。結(jié)果顯示ZBCF222和ZBatt在BHK-21細(xì)胞上具有相似的增殖特性（圖4A）。ZBCF222感染BK細(xì)胞后，病毒能夠增殖復(fù)制至36 h，效價(jià)為10-5.5TCID50/0.1 mL；而ZBatt感染BK細(xì)胞后，病毒不增殖，兔化弱毒株ZBatt和野生強(qiáng)毒株ZBCF222在BK細(xì)胞上的病毒增殖特性差異顯著（P=0.008）（圖4B）。

2.5 病毒感染BK細(xì)胞誘導(dǎo)宿主因子mRNA相對定量結(jié)果將ZBCF222和ZBatt感染BK細(xì)胞后，分別收獲12 h和24 h病毒液，測定病毒RNA復(fù)制量及細(xì)胞中宿主因子mRNA相對表達(dá)量，結(jié)果見圖5。ZBCF222和ZBatt感染BK細(xì)胞后，6種宿主因子CCL2、IFN-β、ISG15、Mx1、OAS和PKR的相對表達(dá)變化差異均不明顯，表明ZB株強(qiáng)弱病毒與宿主相互作用對這6個(gè)宿主因子影響不顯著。病毒感染BK細(xì)胞后，ZBCF222病毒RNA復(fù)制量（P=0.004）高于ZBatt病毒RNA復(fù)制量，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，ZBCF222能夠在天然來源宿主細(xì)胞中復(fù)制，而ZBatt復(fù)制效率差，這種復(fù)制效率差異與選擇測定的6種宿主因子mRNA相對定量表達(dá)水平不相關(guān)。

表2 ZB強(qiáng)弱毒株接種豚鼠試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of injection virulent or attenuated ZB viruses in guinea pigs

3 討論

本研究比較了亞洲1型FMD兔化弱毒疫苗株ZBatt和其親本強(qiáng)毒株ZBCF222的部分生物學(xué)特性。結(jié)果顯示，二者感染BHK-21后具有相似的致病性、病毒復(fù)制和RNA增殖特性，形成蝕斑形態(tài)大小相似，并且二者均對IBRS-2和PK細(xì)胞不敏感。但強(qiáng)毒和弱毒感染天然宿主來源的原代細(xì)胞則存在明顯的致病性差異，強(qiáng)毒株能導(dǎo)致BK細(xì)胞產(chǎn)生典型細(xì)胞病變，形成明顯可見蝕斑形態(tài)，病毒生長曲線和RNA復(fù)制效率測定也證明這一特性；而兔化弱毒株感染BK細(xì)胞不產(chǎn)生CPE，也不產(chǎn)生明顯可見的蝕斑形態(tài)，病毒增殖效果不明顯。結(jié)果表明，兔化弱毒株ZBatt對天然宿主細(xì)胞呈現(xiàn)減毒特征，在細(xì)胞水平上證明其作為減毒活疫苗使用的安全性。

圖5 ZBCF222和ZBatt株感染牛原代腎細(xì)胞后病毒RNA復(fù)制及宿主因子差異表達(dá)結(jié)果Fig.5 Viral RNA and host factors replication levels in BK cells at desired time points post-infection with ZBCF222 strain or ZBatt strain

在FMDV的研究中，乳鼠是敏感的試驗(yàn)動(dòng)物，常用于FMDV病毒分離、毒力測定等實(shí)驗(yàn)[12]。本研究中ZB病毒對乳鼠致病性試驗(yàn)表明，兔化弱毒株ZBatt對乳鼠的致病性明顯強(qiáng)于野生型親本強(qiáng)毒株，結(jié)果與病毒在牛體試驗(yàn)結(jié)果截然相反。分析其原因，可能與病毒本身的特性有關(guān)，或者是弱毒株在乳鼠體內(nèi)有繼代適應(yīng)情況，或許還與所使用的乳鼠品系有一定的關(guān)系[12]?；仡橺B病毒繼代培育過程和疫苗生產(chǎn)記錄，減毒后ZB病毒對溫度的敏感性增強(qiáng)，溫度對病毒的存活及致病性的影響大，減毒病毒對乳鼠的LD50雖然相對偏低，但其LD50明顯高于其親本強(qiáng)毒株（內(nèi)部資料）。本研究采用相同劑量測定病毒對乳鼠的生存率，結(jié)果與之相同。因此，乳鼠不適合作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型用來評價(jià)ZB株致病性差異。

豚鼠是口蹄疫研究中常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。雖然新生乳鼠對FMDV高度敏感，成年鼠、倉鼠也對FMDV敏感，但發(fā)病似乎沒有豚鼠規(guī)律[12]。試驗(yàn)表明，豚鼠感染FMDV可引起規(guī)律性、典型性發(fā)病，豚鼠可作為FMD抗體檢測、臨床癥狀及病理觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，用于口蹄疫疫苗免疫效力評價(jià)[13-14]。Asia 1型FMDV疫苗免疫豚鼠后，其抗體水平隨免疫劑量的增加而升高，同源病毒攻毒時(shí)的抗體水平與保護(hù)力呈正相關(guān)，豚鼠可替代作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物牛用于滅活疫苗效力檢驗(yàn)[15]。本研究利用豚鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物比較ZB病毒強(qiáng)弱毒株毒力差異，結(jié)果提示ZB強(qiáng)弱毒株對豚鼠的致病性與病毒對天然宿主的致病性一致，證明可以用豚鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型比較不同ZB株的毒力差異。

FMDV Lpro缺失突變致弱毒株與野生型病毒感染牛源宿主細(xì)胞后，差異表達(dá)相關(guān)的宿主因子CCL2、IFN-β、ISG15、Mx1、OAS和PKR等，這些因子主要與干擾素誘導(dǎo)基因、趨化因子和轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)[10]。本研究比較測定了這6種由FMDV Lpro缺失導(dǎo)致的表達(dá)差異基因，目的是從病毒-宿主相互作用關(guān)系角度，尋找與病毒致病性差異相關(guān)的宿主因子。結(jié)果表明，ZB病毒強(qiáng)弱毒株感染BK細(xì)胞后，這6種宿主因子mRNA相對定量表達(dá)差異不明顯。之前我們比較了ZB病毒致弱前后病毒全基因組發(fā)現(xiàn)，在病毒Lpro編碼區(qū)，僅存在3個(gè)氨基酸（N2D、M143L和E147G）差異[16]，利用ZBatt株反向遺傳操作系統(tǒng)構(gòu)建的Lpro嵌合病毒證明這3個(gè)氨基酸突變與ZBatt減毒表型不相關(guān)[17]。因此，本研究中發(fā)現(xiàn)這6個(gè)宿主因子表達(dá)差異不顯著，與FMD病毒Lpro突變對病毒毒力改變影響不顯著相關(guān)。提示有必要進(jìn)一步分析FMDV強(qiáng)弱毒株感染天然宿主細(xì)胞引起的mRNA復(fù)制和蛋白差異表達(dá)情況，尋找強(qiáng)弱毒株感染相關(guān)宿主因子變化情況。

綜上所述，F(xiàn)MD兔化弱毒株ZBatt與其親本強(qiáng)毒株對天然來源宿主細(xì)胞存在致病性差異，豚鼠可作為替代牛實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用于ZB病毒毒力差異評價(jià)。