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    影響生鮮乳β-內(nèi)酰胺酶杯碟法檢測(cè)因素的研究

    2020-11-17 12:11:34屈雅莉郭星張影肖淑珍劉麗劉文雅張耀廣柴艷兵李飛李興佳劉志楠
    中國乳品工業(yè) 2020年10期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)酰胺酶青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液

    屈雅莉,郭星,張影,肖淑珍,劉麗,劉文雅,張耀廣,柴艷兵,李飛,李興佳,劉志楠

    (石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司,石家莊050021)

    0 引 言

    抗生素應(yīng)用帶來經(jīng)濟(jì)增長的同時(shí)還帶來細(xì)菌耐藥性問題。當(dāng)前,該問題已成為全球性危機(jī)[1-4],給公共衛(wèi)生安全造成了很大威脅[5-9]。

    β-內(nèi)酰胺類抗生素具有殺菌性強(qiáng)、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)常被使用。如果飼養(yǎng)者濫用藥物可造成牛乳中的殘留,使用后會(huì)引起部分人過敏反應(yīng)或產(chǎn)生耐藥性,從而間接危害人體健康[10-12]。

    目前國內(nèi)外對(duì)生牛乳的β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)主要有高效液相色譜法、碘量法和杯碟法[13-15]。高效液相色譜法操作復(fù)雜檢測(cè)成本高[16]。碘量法靈敏度差且不同樣本重復(fù)性差。杯碟法靈敏度高,易操作,易判定。

    本研究采用杯碟法檢測(cè)生牛乳,實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品酶活力和供試平板的厚度影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性;青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。

    1 實(shí) 驗(yàn)

    1.1 材料和設(shè)備

    試劑:三級(jí)水,實(shí)驗(yàn)室自制;生理鹽水(分析純),天津市大茂化學(xué)試劑廠;磷酸鹽緩沖液,北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

    實(shí)驗(yàn)菌種:藤黃微球菌(Micrococcus luteus)CMCC(B)28001第二代,CICC 10445第二代。

    標(biāo)準(zhǔn)品:青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液(Dr)、β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液(SIGMA、中國食品藥品檢定研究院)、舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液(Dr)。

    培養(yǎng)基:營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、抗生素檢定培養(yǎng)基II(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)。

    儀器設(shè)備:生化培養(yǎng)箱36±1 ℃(BINDER),生物安全柜(ESCO)光度計(jì) 450 nm(賽默飛),pH 計(jì)(梅特勒-托利多儀器有限公司),移液器(Thermo),電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司),恒溫水浴鍋(上海一恒),游標(biāo)卡尺,牛津杯,培養(yǎng)皿,離心管,陶瓦蓋。

    1.2 方法

    依據(jù)NY/T 3313-2018《生乳中β-內(nèi)酰胺酶的測(cè)定》對(duì)生乳進(jìn)行測(cè)定,該方法檢出限為4 U/mL,原理為:杯碟法是使用對(duì)青霉素類藥物敏感的藤黃微球菌,利用舒巴坦特異性抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性,同時(shí)加入青霉素作對(duì)照,比對(duì)加入舒巴坦與未加入舒巴坦的樣品產(chǎn)生的抑菌圈的大小來間接測(cè)定樣品中是否含有β-內(nèi)酰胺酶類藥物[17]。

    1.2.1 制備菌懸液優(yōu)化

    采用不同來源的標(biāo)準(zhǔn)菌株:藤黃微球菌(Micrococcus luteus)CMCC(B)28001 第二代和 CICC 10445 第二代分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上,36±1 ℃培養(yǎng)18~24 h,分別記錄菌形態(tài),于生物安全柜內(nèi)制備菌懸液。同時(shí)將以上菌懸液分別對(duì)50 組生鮮乳進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn),該方法檢出限為4 U/mL,所以采用檢出限對(duì)不同菌株進(jìn)行驗(yàn)證,選出該方法的最適菌株。

    1.2.2β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品制備優(yōu)化

    從市面選取常見的3 個(gè)不同品牌的β- 內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品 (對(duì)青霉素敏感),標(biāo)注分別為:≥8×106U/mL;≥6×106U/mL;≥3×106U/mL。選用3 個(gè)品牌標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行3 組加標(biāo)實(shí)驗(yàn),每組50 個(gè)樣品,加標(biāo)量分別為2,4,8 U/mL,計(jì)算加標(biāo)結(jié)果,驗(yàn)證不同品牌β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

    1.2.3 青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液貯存條件優(yōu)化

    青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液制備完成后,分別選用現(xiàn)配現(xiàn)用,常溫(20~25 ℃)貯存2,4,6,低溫(0~8 ℃)貯存2,4,6,24 h 的青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn),加標(biāo)量為4 U/mL,每組50 個(gè)樣品本底,計(jì)算加標(biāo)樣品陽性檢出率,驗(yàn)證青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液不同貯存條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,確定青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液貯存的最優(yōu)條件。

    1.2.4 檢測(cè)平板制備優(yōu)化

    方法中要求添加藤黃微球菌的抗生素檢定培養(yǎng)基II 傾注量約為15~20 mL,但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)傾注較厚的平板易產(chǎn)生“雙圈”現(xiàn)象,即在明顯抑制圈與非抑制圈之間有一圈不清晰(淺色帶)的抑菌圈,影響結(jié)果判定。本研究分為兩組,一組供試檢測(cè)平板傾注量約10~15 mL,另一組供試檢測(cè)平板傾注量約20~25 mL。兩組平板分別檢測(cè)50 個(gè)加標(biāo)樣品(加標(biāo)量4 U/mL),計(jì)算加標(biāo)樣品陽性檢出率,同時(shí)觀察平板抑菌圈形態(tài),確定檢測(cè)平板制備的最優(yōu)化條件。

    1.2.5 檢測(cè)平板貯存條件優(yōu)化

    本文對(duì)供試檢測(cè)平板制備完成后的貯存條件進(jìn)行研究。選取在2~8 ℃貯存0,1,2,3,4 d 的供實(shí)檢測(cè)平板進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn),加標(biāo)量為4 U/mL,每組50 個(gè)樣品本底,計(jì)算加標(biāo)樣品陽性檢出率,確定檢測(cè)平板貯存最優(yōu)條件。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 制備菌懸液優(yōu)化

    采用不同來源標(biāo)準(zhǔn)菌株。藤黃微球菌(Micrococcus luteus)CMCC(B)28001第二代菌36±1 ℃培養(yǎng)20~24 h菌落大,菌苔厚,利于制備菌懸液。CICC 10445 第二代菌株生長較慢,36±1 ℃培養(yǎng) 18~20 h 菌苔較小、透明且薄,不利于菌懸液制備,若使用CICC 10445 作為實(shí)驗(yàn)菌株最好選用活化培養(yǎng)22~24 h 的菌苔制備菌懸液(見表1)。

    表1 不同來源標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)情況

    圖1 兩種來源標(biāo)準(zhǔn)菌株36±1 ℃培養(yǎng)20 h菌落形態(tài)

    采用兩種標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn),加標(biāo)量為4 U/mL。使用CMCC(B)28001 第二代菌的實(shí)驗(yàn)組陽性檢出率為100%,使用CICC 10445 第二代菌的實(shí)驗(yàn)組陽性檢出率為100%。兩種菌株的檢出率一致,對(duì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無明顯差異(見表2)。

    表2 采用不同來源標(biāo)準(zhǔn)菌株加標(biāo)實(shí)驗(yàn)陽性檢出情況

    2.2 β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品制備優(yōu)化

    采用3 個(gè)品牌對(duì)青霉素敏感的β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品2 U/mL 加標(biāo)實(shí)驗(yàn)(圖2),其中品牌1 的β-內(nèi)酰胺酶活力較高,72%的樣品檢出陽性,但后期排查的成本較高;4 U/mL(檢出限)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)(圖3),陽性檢出率分別為100%,100%,84%;品牌1 和品牌2 漏檢率0%,品牌3 漏檢率為16%,采用品牌3 的β-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)有很大漏檢風(fēng)險(xiǎn);8 U/mL 加標(biāo)實(shí)驗(yàn)(圖4),3 個(gè)品牌陽性檢出率均為100%。

    本研究的檢出限為4 U/mL,采用品牌1 可滿足方法要求,但有72%概率出現(xiàn)假陽性,會(huì)造成資源浪費(fèi);品牌2 可滿足方法要求;品牌3 不能滿足方法要求,有16%的漏檢概率。采用不同品牌β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性有影響。

    圖2 3個(gè)品牌β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品2 U/mL加標(biāo)實(shí)驗(yàn)檢出情況

    圖3 3個(gè)品牌β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品4 U/mL加標(biāo)實(shí)驗(yàn)檢出情況

    圖4 3個(gè)品牌β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品8 U/mL加標(biāo)實(shí)驗(yàn)檢出情況

    2.3 青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液貯存條件優(yōu)化

    采用低溫(0~8 ℃)貯存不同時(shí)間的青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖5 所示。由圖5 可以看出,隨著貯存時(shí)間延長,青霉素分解,加標(biāo)樣品陽性檢出率逐步降低。低溫貯存時(shí)間0~2 h 青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液陽性檢出率為100%,漏檢率0%;低溫貯存時(shí)間>2 h,存在不同程度漏檢的概率。本研究青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制完成后低溫貯存時(shí)間最優(yōu)為0~2 h。

    采用常溫(20~25 ℃)貯存不同時(shí)間的青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖6 所示。由圖6 可以看出,隨著貯存時(shí)間延長,加標(biāo)樣品陽性檢出率逐步降低。常溫貯存時(shí)間0~6 h,存在不同程度漏檢的概率。青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制完成應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用,不可常溫貯存。

    圖5 青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液低溫貯存不同時(shí)間檢出情況

    圖6 青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液常溫貯存不同時(shí)間檢出情況

    2.4 檢測(cè)平板制備優(yōu)化

    采用傾注量為10~15 mL 的供試檢測(cè)平板進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的陽性檢出率為100%,加標(biāo)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)平板抑菌圈邊界清晰可見,易于判斷結(jié)果(圖7)。

    圖7 β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)平板抑菌圈形態(tài)

    采用傾注量為20~25 mL 的供試檢測(cè)平板進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn),存在不同程度的漏檢概率,主要是由于檢測(cè)平板抑菌圈邊界不清晰,且一部分出現(xiàn)“雙圈”現(xiàn)象,且以外圈計(jì)和內(nèi)圈計(jì)結(jié)果不一致,不易判斷檢測(cè)結(jié)果。本研究結(jié)果表明,供實(shí)檢測(cè)平板的傾注量10~15 mL最優(yōu)(見表3)。

    表3 采用不同傾注量檢測(cè)平板加標(biāo)實(shí)驗(yàn)陽性檢出情況

    2.5 檢測(cè)平板貯存條件優(yōu)化

    采用低溫(2~8 ℃)貯存不同時(shí)間的供試檢測(cè)平板進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn),隨著平板保存時(shí)間延長,陽性樣品檢出率降低。使用低溫(2~8 ℃)貯存0~1 d 供試檢測(cè)平板進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)(加標(biāo)量4 U/mL),陽性檢出率為100%,使用低溫(2~8 ℃)貯存2~4 d供試檢測(cè)平板加標(biāo)實(shí)驗(yàn)存在不同程度漏檢的概率。本研究供實(shí)檢測(cè)平板冷藏貯存的時(shí)間最優(yōu)為0~1 d,建議現(xiàn)配現(xiàn)用(圖8)。

    圖8 采用不同貯存時(shí)間檢測(cè)平板的檢出情況

    3 結(jié)果與討論

    用杯碟法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶,主要是利用舒巴坦特異性抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性,并加入青霉素作為對(duì)照,通過比對(duì)抑菌圈的大小來間接測(cè)定樣品中有無含有β-內(nèi)酰胺酶類藥物[18]。試驗(yàn)中菌株、β-內(nèi)酰胺酶、青霉素等是試驗(yàn)中應(yīng)注意的關(guān)鍵因素,把控其最優(yōu)條件有利于提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性[19-20]。

    通過分析試驗(yàn)結(jié)果,采用藤黃微球菌(Micrococcus luteus)CMCC(B)28001 和 CICC 10445 作為實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性無明顯影響,實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自身情況選擇性購買標(biāo)準(zhǔn)菌株,但考慮到兩種菌株的生長特性,藤黃微球菌(Micrococcus luteus)CMCC(B)28001 建議使用活化20~24 h 的培養(yǎng)物制備菌懸液,CICC 10445建議使用活化22~24 h的培養(yǎng)物制備菌懸液。

    采用不同品牌β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大影響,建議實(shí)驗(yàn)開展之前對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的酶活力進(jìn)行實(shí)驗(yàn),可采用檢出限附近加標(biāo)回收的方式驗(yàn)證其活力是否符合實(shí)驗(yàn)要求。

    青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液隨著貯存時(shí)間延長會(huì)逐步衰減,貯存溫度越高衰減越快。此次試驗(yàn)結(jié)果顯示青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液不可常溫貯存,建議青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制完成后最好立即實(shí)驗(yàn),若無法立即實(shí)驗(yàn),應(yīng)將青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液放置于冰水混合物中2 h完成實(shí)驗(yàn)。

    供試檢測(cè)平板的厚度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定有影響,偏厚的平板易產(chǎn)生“雙圈”現(xiàn)象,本次試驗(yàn)顯示檢測(cè)平板的最優(yōu)傾注量為10~15 mL,傾注的時(shí)候可以先傾注一部分含菌培養(yǎng)基至無菌平皿上,輕微旋轉(zhuǎn)平板,使培養(yǎng)基流動(dòng)平鋪于整個(gè)無菌平皿上,可得到較薄測(cè)試平板。

    供實(shí)檢測(cè)平板最優(yōu)現(xiàn)配現(xiàn)用,若配置較多平板或?qū)嶒?yàn)需求,在冰箱冷藏貯存1 d 可達(dá)同等效果。實(shí)驗(yàn)中注意:可待檢測(cè)平板凝固后即刻放入2~8 ℃冰箱冷藏保存,若室溫放置時(shí)間較長造成藤黃微球菌大量生長,則平板不可使用。

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