基于微滴式數(shù)字PCR的飲料中嗜酸乳桿菌定量檢測

劉洋，張娜娜，竇同海，俞漪，徐瓊，曲勤鳳，趙渝，楊捷琳，朱春梅

(1. 上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(上海)，上海200233；2.上海昂樸生物科技有限公司，上海201114；3.上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200234；4.上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心，上海200135；5.杜邦營養(yǎng)與生物科技丹尼斯克（中國）投資有限公司，上海200335)

0 引 言

嗜酸乳桿菌作為重要的益生菌被廣泛用于食品中。Kumar[1-4]等人發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌對大腸桿菌、腹瀉致病菌等均有抑制作用；降低血漿中膽固醇含量[5]；對乳糖不耐癥有一定的療效[4，6]，對機體健康有促進作用等[5，7]。嗜酸乳桿菌能在發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸，并通過氨基酸代謝增加風味[8]。在我國，飲料中添加益生菌特別是嗜酸乳桿菌成為新的發(fā)展趨勢[8]。

微滴式數(shù)字PCR 技術(shù)（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）是近年來新發(fā)展起來的定性定量分子檢測新方法[9]，用于轉(zhuǎn)基因成分、食品中致病菌、摻假產(chǎn)品等的檢測，以及在臨床上用于腫瘤細胞的檢測[10-16]。1992 年，Sykes[17]等就首次提出了ddPCR的構(gòu)想，是一項基于單分子目標基因PCR 擴增的絕對定量技術(shù)，主要原理是將含有DNA 模板的PCR 反應(yīng)體系分布到大量的獨立反應(yīng)室，單分子間通過大量稀釋后分離，使得每個獨立反應(yīng)室中含有小于或等于一個拷貝，然后使這些反應(yīng)室在相同條件下獨自進行PCR 擴增[18-19]。含有DNA 分子的微反應(yīng)室能夠發(fā)生PCR 反應(yīng)，即產(chǎn)生陽性信號；而不含DNA 的微反應(yīng)室則產(chǎn)生陰性信號[18，20]，再利用泊松分布，逐一對陽性信號的微反應(yīng)室計數(shù)，從而計算出樣品中初始的DNA 模板量[21]。

ddPCR 技術(shù)以其準確性好、靈敏度高、無需任何校準物質(zhì)、可進行絕對定量等優(yōu)勢，已經(jīng)在臨床診斷、基因表達、環(huán)境微生物檢測等方面得到了廣泛的研究和應(yīng)用。本研究主要基于嗜酸乳桿菌SPIDR 序列，結(jié)合ddPCR 方法定量檢測飲料中的嗜酸乳桿菌，為該類產(chǎn)品的品質(zhì)檢測提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究根據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《可用于食品的菌種名單》，結(jié)合市場上飲料中常見的乳酸菌菌株，選擇4 個嗜酸乳桿菌，19 個其他菌株進行特異性檢測（表1）。

上述菌株購買后均由上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院自行保存。 Lactobacillus acidophilus NCFM（HOWARU?Dophilus）、Lactobacillus acidophilus La-14、HN001 HOWARU?Rhamnosus、Lactobacillus casei Lc-11、Lactobacillus paracasei Lpc-115、Lactobacillus paracasei Lpc-37、Lactobacillus salivarius Ls-33 由丹尼斯克（中國）投資有限公司惠贈。

1.2 儀器與設(shè)備

T100 微滴式數(shù)字 PCR 擴增儀、QX200 微滴讀取儀、PX1 板封口機、QX200 微滴生成儀，美國BIO-RAD；Vortex Genie2 漩渦振蕩器，美國 SI；移液槍，美國GILSON；SW-CJ-2D 超凈工作臺，蘇州凈化；ESCO LA2-4A1生物安全柜，新加坡藝思高。

1.3 主要試劑與材料

ddPCR Supermix for probes、微滴生成專用油、96孔板、微滴生成卡，美國BIO-RAD。

引物與探針見表2，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

2 實 驗

2.1 核酸提取方法

2.1.1 標準菌株核酸提取方法

表1 菌株名稱及其編號

表2 本研究用到的引物與探針

（1）菌株富集：吸取1 mL 培養(yǎng)液，加入2 mL 無菌離心管中，13 000 rpm，離心5 min，去除上清，重復(fù)上述步驟1次，即共吸取培養(yǎng)液2 mL取沉淀。

（2）菌株裂解：富集后的沉淀中加入400 μL 10 mg/mL溶菌酶，37 ℃，水浴 2 h；加入 400 μL CTAB 裂解液，3 0 μL 蛋白酶K，混勻，56 ℃，2 h。而后進行核酸提取[22]。

2.1.2 實驗樣品核酸提取方法

樣品進行前處理：取飲料25 mL 加入到225 mL 的無菌蒸餾水中，混勻，取5 mL 的樣品加入15 mL 離心管中，9 000 g 離心 5 min，去上清；沉淀中加入 5 mL 無菌蒸餾水，渦旋振蕩混勻，混勻液放在沸水中加熱，直至蛋白質(zhì)絮狀物出現(xiàn)，9 000 g 離心5 min，去上清，沉淀中加入5 mL 無菌蒸餾水溶解，渦旋振蕩器上混勻，再次在沸水中加熱10 min，9 000 g 離心10 min，去上清。沉淀加400 μL 濃度為10 mg/mL 的溶菌酶，在渦旋振蕩器上將沉淀混勻，37 ℃孵育2 h，加入400 μL的CTAB 裂解液，56 ℃水浴 2 h。而后提取核酸[22]。粗提取核酸進行過柱純化，用于后續(xù)PCR 擴增。

2.2 體系及條件

ddPCR 擴增體系如下配制：2×ddPCR Master Mix 各 10 μL，NCFM P F（10 μmol/L）、NCFM P R（10 μmol/L）各 1.8 μL，NCFM P 探針（10 μmol/L）0.5 μL，DNA 模板 4 μL，無菌蒸餾水補足至 20 μL。配制好的反應(yīng)體系移至微滴生成卡中，加70 μL 微滴生成專用油，在微滴生成器中將微滴生成卡中的樣品生成微滴。取40 μL 生成的樣品微滴至96 孔板中，封膜。在PCR 儀中進行擴增。擴增程序為：預(yù)變性10 min，96 ℃ ；94 ℃ 30s 變性，60 ℃ 1 min 退火加延伸，40 個循環(huán)；98 ℃ 10 min 熱失活；4 ℃ 保存。升溫速度2 ℃/s。擴增結(jié)束，將96 孔板放置在微滴讀取儀中讀數(shù)。

2.3 ddPCR 擴增方法建立

2.3.1擴增條件優(yōu)化

2.3.1.1 擴增溫度優(yōu)化

以嗜酸乳桿菌標準菌株核酸為模板，優(yōu)化擴增溫度。退火溫度設(shè)置為 60、59.2、58、56.1、53.8、51.9、50.7、50.0 ℃共8個溫度梯度。

2.3.1.2 擴增模板優(yōu)化

以嗜酸乳桿菌標準菌株核酸為模板，分別對10 ng/μL、5 ng/μL、3 ng/μL、2 ng/μL、1 ng/μL、200 pg/μL、100 pg/μL、10 pg/μL 等幾個核酸濃度進行檢測。根據(jù)擴增顯示的陽性微滴數(shù)選擇最適的模板濃度。

2.4 ddPCR 擴增方法驗證

2.4.1 特異性檢測

特異性測試采用4 株嗜酸乳桿菌菌株，14 株其他乳桿菌，1 株嗜熱鏈球菌以及4 株致病菌的核酸為模板，采用建立的ddPCR 擴增體系進行檢測。

2.4.2 重復(fù)性試驗

選取嗜酸乳桿菌標準菌株的核酸，選擇1、0.1、0.01、0.001 ng/μL 等 4 個質(zhì)量濃度的核酸稀釋液進行擴增。根據(jù)陽性微滴數(shù)計算CV 值。

2.4.3 靈敏度試驗

以嗜酸乳桿菌標準菌株核酸為模板，對核酸濃度分別為 3 ng/μL、2 ng/μL、1 ng/μL、200 pg/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、0.5 pg/μL、0.25 pg/μL、0.05 pg/μL 進行檢測。根據(jù)ddPCR 擴增顯示的陽性微滴數(shù)選擇最適的核酸濃度。

2.4.4 抗干擾試驗

本研究選擇質(zhì)量濃度為 2 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、50 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL 的嗜酸乳桿菌標準菌株核酸，分別 1∶1 添加 1 ng/μL 與 50 pg/μL 的德式保加利亞乳桿菌，進行PCR 擴增。對比實驗組與對照組陽性微滴數(shù)之間的差異，判斷該方法抗其他菌種干擾的能力。

2.5 實際樣品檢驗

市場上購買含有嗜酸乳桿菌的飲料共11 份，不含嗜酸乳桿菌的飲料1 份。提取樣品核酸進行擴增，根據(jù)陽性微滴數(shù)計算樣品中嗜酸乳桿菌含量。

3 結(jié) 果

3.1 擴增溫度和模板濃度的優(yōu)化

對引物和探針的溫度優(yōu)化擴增結(jié)果顯示，不同溫度梯度對于檢測的結(jié)果影響較小。60 ℃時陽性微滴較多，選擇60 ℃作為擴增的退火溫度。

擴增濃度優(yōu)化的結(jié)果圖如圖1 所示，可以看出，核酸濃度為10 ng/μL、5 ng/μL、3 ng/μL 時，無陰性微滴出現(xiàn)，提示核酸濃度過高；核酸濃度為2 ng/μL、1 ng/μL、200 pg/μL 和100 pg/μL 時，陽性微滴與陰性微滴之間有明顯的界限，但核酸濃度為2 ng/μL 時拖尾較為嚴重。后續(xù)實驗選擇1 ng/μL 的核酸濃度作為實驗濃度。

圖1 模板濃度優(yōu)化結(jié)果

3.2 ddPCR 特異性檢測

特異性檢測結(jié)果如圖2 所示，嗜酸乳桿菌擴增出現(xiàn)陽性微滴，其他菌株均未出現(xiàn)陽性微滴，說明引物及探針的特異性好，方法適用于嗜酸乳桿菌的特異性檢測。

3.3 重復(fù)性試驗

不同濃度核酸重復(fù)性檢測結(jié)果如表3 所示，檢測結(jié)果的CV 值在2.34%～6.1%之間，小于7%，在可接受范圍內(nèi)，證明該方法的重復(fù)性好。

圖2 特異性檢測結(jié)果

表3 ddPCR重復(fù)性驗證

3.4 靈敏度檢測

核酸水平靈敏度檢測結(jié)果表4 所示，核酸濃度為3 ng/μL 時，陽性微滴與陰性微滴不能區(qū)分；核酸濃度在 2 ng/μL～0.25 pg/μL 之間陽性微滴與陰性微滴可明顯區(qū)分，0.1 pg/μL 時無陽性微滴出現(xiàn)，說明在核酸水平ddPCR 的檢測下限為0.25 pg/μL。

表4 添加不同濃度菌株擴增微滴數(shù)

3.5 抗干擾試驗

抗干擾試驗結(jié)果如圖3 所示，兩者的擴增結(jié)果與對照組比較，兩者在數(shù)值上無明顯差異，證明該方法具有良好的抗干擾能力。

3.6 實際樣品檢測

對市售的11 份樣品進行數(shù)字PCR 定量檢測，結(jié)果顯示標簽標示添加嗜酸乳桿菌的樣品全部擴增出陽性微滴（表5）。除10 號樣品外，樣品中菌的含量為1.6×103～2.3×106copies/g，與標簽信息基本相符。結(jié)果表明，本研究建立的數(shù)字PCR 檢測方法可用于實際樣品中嗜酸乳桿菌的定量檢測。

4 總 結(jié)

圖3 添加干擾菌擴增的結(jié)果圖

隨著社會和民眾對健康的重視，益生菌在食品中的應(yīng)用越來越廣泛，其中嗜酸乳桿菌作為一類功效顯著的益生菌，在飲料、發(fā)酵乳、嬰幼兒配方乳粉中應(yīng)用較多。因益生菌原料成本較高，且為生物活性物質(zhì)，其添加種類和添加量需要特別關(guān)注。我國食品安全國家 標準要求飲料中添加菌種的活菌數(shù)必須≥106CFU/mL。但目前，對于飲料中益生菌的菌種檢測主要依賴傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，耗時耗力，結(jié)果受影響因素較多，難以滿足市場精確鑒定和定量的要求，急需快速、準確、特異性高的檢測方法。

目前，基于微滴式數(shù)字PCR 的分子檢測方法在食品微生物檢測中得到較大的關(guān)注和探索。蔡一村[23-25]等借助數(shù)字PCR 檢測肉制品中摻假，并得出肉質(zhì)量與陽性微滴數(shù)之間的關(guān)系式；趙新等[26-29]借助數(shù)字PCR 檢測食品中的致病菌；Collier R 等[30]研究了數(shù)字PCR 在轉(zhuǎn)基因植物檢測方面的應(yīng)用[31-32]；周巍[33-34]等開發(fā)了數(shù)字PCR 在乳制品中致病菌檢測方面的方法。這些研究表明數(shù)字PCR 具有快速、準確、通量高等優(yōu)點，是食品微生物定量的重要技術(shù)。目前，國內(nèi)外對嗜酸乳桿菌的精確定量檢測研究報道較少。

本研究利用菌種特異性引物建立了嗜酸乳桿菌數(shù)字PCR 檢測方法并在飲料中應(yīng)用。方法特異性高，靈敏度達到0.25 pg/μL，且重復(fù)性好。實際樣品檢驗結(jié)果表明方法定性定量準確，與標簽宣稱基本相符。該方法可用于飲料中嗜酸乳桿菌的定量檢測。