抑制酸奶后發(fā)酵桑葉活性成分篩選及桑葉黃酮酸奶工藝

成少寧 ，王芬 ，喬冬 ，董文賓 ，2，黃健 ，3

（1.運(yùn)城職業(yè)技術(shù)大學(xué)，山西運(yùn)城044000；2.陜西科技大學(xué)，西安710021；3.運(yùn)城學(xué)院，山西運(yùn)城044000）

0 引 言

桑葉是桑樹(shù)的干燥葉，富含多種人體所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種功效[1]，《本草綱目》記載“桑之功最神，在人資用尤多”[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，桑葉可以改善肥胖[3]，其含有的活性物質(zhì)都具有降血糖成分[4]，是開(kāi)發(fā)保健食品、功能食品乃至藥品的良好材料來(lái)源。

酸奶是人們非常喜愛(ài)的食品之一，而在運(yùn)輸、售賣及貯藏的過(guò)程中，很難做到冷藏，導(dǎo)致貯藏后期酸奶的酸度過(guò)高，口感不佳，桑葉粉對(duì)后發(fā)酵具有一定的抑制作用[5]，本研究主要篩選對(duì)抑制酸奶后發(fā)酵影響最大的桑葉活性成分，并優(yōu)化桑葉活性成分酸奶工藝，為桑葉的深加工乃至桑葉相關(guān)功能性食品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料

桑葉多糖、桑葉總黃酮、桑葉生物堿，實(shí)驗(yàn)室提取并保存；鮮牛奶，南山牧場(chǎng)；白砂糖，市售；德式乳桿菌保加利亞亞種、嗜熱鏈球菌，本學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室；大豆蛋白胨、蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉（分析純），廣州光華公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

GNP-9160 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；GYB40-10S 高壓均質(zhì)機(jī)，上海東華試驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；SW-CJ-2D 超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；1/10000g 220gCPA224S 電子分析天平，德國(guó)賽多利斯有限公司；DHG-9203A 電熱恒溫干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；PB-10pH 計(jì)，德國(guó)賽多利斯有限公司；TGL-16G 高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 抑制酸奶后發(fā)酵桑葉活性成分篩選

1.2.1.1 酸奶制作流程與操作要點(diǎn)：

鮮牛乳檢驗(yàn)：鮮牛乳要求色澤乳白、無(wú)異物、無(wú)凝塊、具有鮮乳固有的香味，經(jīng)過(guò)無(wú)菌紗布過(guò)濾除雜，按照GB 19301-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)生乳》要求的方法檢驗(yàn)其蛋白質(zhì)、脂肪、雜質(zhì)度、非脂乳固體、微生物等指標(biāo)，檢驗(yàn)結(jié)果均符合國(guó)標(biāo)要求的鮮牛乳作為酸奶發(fā)酵的原料乳。

均質(zhì)、殺菌：鮮牛乳、7%白砂糖、0.4%桑葉活性物質(zhì)，混合均勻后在均質(zhì)機(jī)中60 ℃、20 MPa均質(zhì)5 min。

殺菌：90～95 ℃殺菌10 min。

菌種活化：分別將實(shí)驗(yàn)室中保存的德式乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌試管菌種接種于10%的無(wú)菌脫脂乳培養(yǎng)基中42 ℃培養(yǎng)并反復(fù)活化，直到活力達(dá)到規(guī)定要求為止。

冷卻、接種：殺菌后將牛乳快速冷卻至42～45 ℃，加入活化后的菌種，混勻。

發(fā)酵、冷藏后熟：42 ℃發(fā)酵4 h，待酸牛乳冷卻至室溫后，放入4 ℃的冰箱中后熟24 h，即為酸牛乳成品。1.2.1.2 酸度測(cè)定

參照 GB 5009.239-2016 中的第二法 pH 計(jì)法[6]對(duì)三種活性成分酸奶和對(duì)照酸奶貯藏1，5，9，13，17，21 d的酸度進(jìn)行測(cè)定。精確稱取10 g 攪拌均勻的酸奶，置于150 mL 錐形瓶中，加入20 mL 蒸餾水，用0.1 moL/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液pH 值穩(wěn)定在8.30±0.01 處4～5 s，并在這一過(guò)程中始終用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌。記錄消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，按照公式計(jì)算其滴定酸度。

1.2.1.3 pH 值

用 pH 計(jì)檢測(cè)貯藏 1，5，9，13，17，21 d 的3 種活性成分酸奶和對(duì)照酸奶。

1.2.1.4 持水力

采用重量法[7]，取20 mL 的干燥空離心管質(zhì)量計(jì)為W1，分別向其中加入10 g 左右酸奶，精確稱量質(zhì)量計(jì)為W2，轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心10 min，小心吸出上清液，精確稱量后計(jì)為W3，持水力為=

1.2.1.5 乳酸菌總數(shù)測(cè)定

按照GB 4789.35-2016 方法[8]分別計(jì)數(shù)嗜熱鏈球菌數(shù)和乳桿菌數(shù)，兩者之和即為乳酸菌總數(shù)。

1.2.2 最佳發(fā)酵工藝條件的確定

以發(fā)酵劑接種量、蔗糖添加量、活性成分添加量以及果膠添加量4 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定每個(gè)因素發(fā)酵的水平，通過(guò)響應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化[9]，確定活性成分酸奶的最佳發(fā)酵工藝條件。

1.2.2.1 感官評(píng)價(jià)

抽選食品專業(yè)經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的10 名學(xué)生，對(duì)各酸奶進(jìn)行組織狀態(tài)、色澤、口感、風(fēng)味的評(píng)價(jià)和打分，滿分100分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 酸奶感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 抑制后發(fā)酵桑葉活性成分篩選

2.1.1 桑葉活性成分對(duì)酸奶貯藏期酸度的影響

桑葉3 種活性成分對(duì)酸奶貯藏期酸度的影響如圖1所示。

圖1 桑葉活性成分對(duì)酸奶貯藏期酸度的影響

由圖1 可知，桑葉活性成分酸奶滴定酸度在貯藏前期1～9 d 均隨著貯藏天數(shù)的增加而增加，但是在貯藏后期13～21 d 隨著貯藏天數(shù)增加滴定酸度減小，而且在貯藏期3 種活性成分中桑葉生物堿的滴定酸度最高，桑葉黃酮最低，說(shuō)明桑葉生物堿能促進(jìn)桑葉酸奶的發(fā)酵，桑葉多糖和黃酮在初期能促進(jìn)發(fā)酵，但是后期可能會(huì)抑制發(fā)酵，導(dǎo)致滴定酸度降低，桑葉黃酮抑制酸奶后發(fā)酵的作用較其他兩種活性成分強(qiáng)，對(duì)照酸奶的滴定酸度在貯藏期均呈增加趨勢(shì)。

2.1.2 桑葉活性成分對(duì)酸奶貯藏期pH 值的影響

桑葉活性成分對(duì)酸奶貯藏期pH 值的影響如圖2所示。

由圖2可知，活性成分酸奶的pH 值貯藏前期都隨著貯藏天數(shù)的增加而減小，貯藏后期則有緩慢的上升，其中桑葉生物堿的pH 值最小，桑葉黃酮在貯藏初期（1～5 d）pH 值小于桑葉多糖，但是后期（9～21 d）pH值大于桑葉多糖，對(duì)照酸奶的pH 值則隨著貯藏天數(shù)的增加呈下降趨勢(shì)。pH 值的變化趨勢(shì)與滴定酸度基本相同，都為桑葉黃酮的抑制發(fā)酵作用最強(qiáng)。

2.1.3 桑葉活性成分對(duì)酸奶貯藏期持水力的影響

桑葉活性成分對(duì)酸奶貯藏期持水力的影響如圖3所示。

圖3 桑葉活性成分對(duì)酸奶貯藏期持水力的影響

由圖3 可知，桑葉在貯藏期持水力基本都呈下降趨勢(shì)，持水力反映了酸奶的組織狀態(tài)，說(shuō)明酸奶隨著貯藏天數(shù)的增加其組織狀態(tài)會(huì)變差，會(huì)有更多的乳清析出。桑葉生物堿的持水力最大，桑葉黃酮次之。

2.1.4 桑葉活性成分對(duì)酸奶貯藏期乳酸菌總數(shù)的影響

桑葉活性成分對(duì)酸奶貯藏期乳酸菌總數(shù)的影響如圖4所示。

圖4 桑葉活性成分對(duì)酸奶貯藏期乳酸菌總數(shù)的影響

由圖4 可知，3 種活性成分酸奶的乳酸菌數(shù)都高于對(duì)照酸奶，說(shuō)明桑葉活性成分均能促進(jìn)酸奶中乳酸菌數(shù)的增值，并且均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其中桑葉生物堿酸奶的乳酸菌數(shù)最高，并且在貯藏17 d 時(shí)達(dá)到最高，之后又迅速下降，桑葉多糖的乳酸菌數(shù)和桑葉黃酮的乳酸菌數(shù)數(shù)量和變化趨勢(shì)都相近，但是桑葉多糖的乳酸菌數(shù)在第13 d 達(dá)到最大，桑葉黃酮的乳酸菌數(shù)在第17 d達(dá)到最大。其中的機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

綜合以上檢測(cè)結(jié)果，桑葉黃酮酸奶在3 種活性成分酸奶中的滴定酸度最低，pH 值在貯藏后期最高，持水力和乳酸菌數(shù)雖然都小于生物堿，但是生物堿由于其滴定酸度太高，對(duì)酸奶后發(fā)酵不能起到抑制作用，所以桑葉黃酮是3 種活性成分中對(duì)酸奶后發(fā)酵抑制作用最大的活性成分。

2.2 最佳發(fā)酵工藝條件的確定

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1.1 發(fā)酵劑添加量對(duì)桑葉黃酮酸奶發(fā)酵的影響

在蔗糖添加量為7%，桑葉黃酮添加量為0.5%，果膠添加量為0.2%，發(fā)酵劑添加量分別按照1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%在42 ℃恒溫條件下發(fā)酵4 h，然后測(cè)定其滴定酸度和感官，結(jié)果如圖5所示。

圖5 發(fā)酵劑接種量對(duì)酸奶發(fā)酵的影響

由圖5 可知，酸奶酸度隨著發(fā)酵劑接種量的增加呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明發(fā)酵劑接種量越多，發(fā)酵的速度越快，但是感官評(píng)分在發(fā)酵劑接種量為2.00%時(shí)最高，發(fā)酵劑接種量大于2.00%時(shí)，酸度太高，感官評(píng)分下降。

在發(fā)酵劑添加量為2.0%，桑葉黃酮添加量為0.5%，果膠添加量為0.2%，蔗糖添加量分別按照3%，5%，7%，9%，11%在42 ℃恒溫條件下發(fā)酵4 h，然后測(cè)定其滴定酸度和感官，結(jié)果如圖6所示。

圖6 蔗糖添加量對(duì)酸奶發(fā)酵的影響

由圖6 可知，酸奶酸度隨著蔗糖添加量的增加而增加，說(shuō)明蔗糖可以促進(jìn)酸奶的發(fā)酵，因?yàn)檎崽强梢宰鳛槿樗峋奶荚创龠M(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)從而有助于酸奶酸度的增加，而感官評(píng)分在蔗糖添加量9%時(shí)最高，添加量大于9%酸度過(guò)高，酸甜不協(xié)調(diào)，感官評(píng)分下降。

2.2.1.3 桑葉黃酮添加量對(duì)桑葉黃酮酸奶發(fā)酵的影響

在蔗糖添加量為7%，發(fā)酵劑添加量為2.0%，果膠添加量為0.2%，桑葉黃酮添加量分別按照0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%在42 ℃恒溫條件下發(fā)酵4 h，然后測(cè)定其滴定酸度和感官，結(jié)果如圖7所示。

圖7 桑葉黃酮添加量對(duì)酸奶發(fā)酵的影響

由圖7 可知，酸奶的滴定酸度和感官評(píng)分都隨著桑葉黃酮添加量的增加而呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，黃酮在低濃度時(shí)會(huì)促進(jìn)酸奶發(fā)酵，但是高濃度的黃酮可能會(huì)抑制酸奶的發(fā)酵，導(dǎo)致酸奶的滴定酸度下降，添加量在0.70%時(shí)都達(dá)到最大值。

2.2.1.4 果膠添加量對(duì)桑葉黃酮酸奶發(fā)酵的影響

在蔗糖添加量為7%，發(fā)酵劑添加量為2.0%，桑葉黃酮添加量為0.5%，果膠添加量分別按照0.1%，0.15%，0.2%，0.25%，0.3%在42 ℃恒溫條件下發(fā)酵4 h，然后測(cè)定其滴定酸度和感官，結(jié)果如圖8所示。

圖8 果膠添加量對(duì)酸奶發(fā)酵的影響

由圖8 可知，果膠添加量對(duì)酸奶發(fā)酵的影響較小，隨著果膠添加量的增加，酸奶的酸度變化影響較小，但是感官影響較大，因?yàn)楣z會(huì)影響酸奶的組織狀態(tài)，添加量低時(shí)，攪拌后酸奶組織較稀薄，添加量太高，酸奶又太稠，添加量0.2%時(shí)感官評(píng)分最高。

讀楊鵬筆下的故事，你會(huì)發(fā)現(xiàn)，他的絕大部分作品承載的是一個(gè)小小男孩的英雄夢(mèng)想。楊鵬自己也說(shuō)，他作品的主人公都有自己的影子，他在心靈深處的某一個(gè)角落，永遠(yuǎn)是一個(gè)14歲的孩子，從未長(zhǎng)大。

2.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化桑葉黃酮發(fā)酵工藝條件

2.2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，運(yùn)用Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取發(fā)酵劑添加量（A）、蔗糖添加量（B）、桑葉黃酮添加量（C）、果膠添加量（D）為影響因素，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行4 因素3 水平的響應(yīng)面分析。試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 %

利用Design-Expert V8.0.6 軟件，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元二次擬合分析，以及方差分析結(jié)果如表3所示。

對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，得到回歸模型方程為

Y=92.10+0.83A+0.73B-1.34C+0.058D+0.40AB+0.13AC-0.63AD+0.25BC-0.050BD-0.30CD-2.32A2-1.29B2-3.95C2-2.05D2。

由表3 可知，該模型具有極顯著性（P＜0.01），說(shuō)明響應(yīng)面模型極度顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)失擬誤差為0.8969（P＞0.05）不顯著，其多元相關(guān)系數(shù)為R2=0.9120，表明所建立的回歸模型的擬合度為91.20%；說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際試驗(yàn)值擬合較好，可以將該模型用于桑葉黃酮酸奶的工藝研究。

由表3 可以看出，各試驗(yàn)因素對(duì)桑葉黃酮酸奶品質(zhì)的影響排序?yàn)樯Ｈ~黃酮添加量（C）＞發(fā)酵劑添加量（A）＞蔗糖添加量（B）＞果膠添加量（D）。

2.2.2.2 響應(yīng)面分析討論

利用響應(yīng)面Design-Expert V8.0.6 軟件處理的交互作用結(jié)果見(jiàn)圖9～圖11所示。

圖9 桑葉黃酮添加量與發(fā)酵劑添加量交互作用響應(yīng)面

圖10 果膠添加量與發(fā)酵劑添加量交互作用響應(yīng)面

圖11 桑葉黃酮添加量與果膠添加量交互作用響應(yīng)面

通過(guò)響應(yīng)面分析可知，對(duì)活性成分酸奶感官評(píng)價(jià)影響最大的交互作用是因素A 和因素D，即發(fā)酵劑添加量和果膠添加量，其響應(yīng)面如圖10 所示。當(dāng)果膠添加量為0.18%～0.23%，發(fā)酵劑添加量為1.7%～2.3%時(shí)，響應(yīng)面值接近最高點(diǎn)，說(shuō)明在這個(gè)范圍內(nèi)，活性成分酸奶的感官品質(zhì)較好。

通過(guò)Design-Expert V8.0.6 軟件分析得出其最佳的工藝條件為：發(fā)酵劑添加量2.10%，蔗糖添加量9.60%，桑葉黃酮添加量0.67%，果膠添加量0.20%，在此條件下感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為92.3994。

根據(jù)預(yù)測(cè)的最佳工藝條件，即發(fā)酵劑添加量2.10%，蔗糖添加量9.60%，桑葉黃酮添加量0.67%，果膠添加量0.20%，進(jìn)行桑葉黃酮發(fā)酵酸奶工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到其感官評(píng)分為91.6，與預(yù)測(cè)值較接近，說(shuō)明利用響應(yīng)面優(yōu)化得到的工藝條件可行。

3 結(jié) 論

（1）試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定桑葉3 種活性物質(zhì)酸奶在貯藏期的滴定酸度、pH 值、持水力和乳酸菌數(shù)的變化來(lái)篩選對(duì)酸奶后發(fā)酵具有抑制作用的物質(zhì)，結(jié)果顯示桑葉多糖和桑葉黃酮對(duì)酸奶后發(fā)酵都具有抑制作用，桑葉黃酮的抑制作用最強(qiáng)，桑葉生物堿對(duì)酸奶后發(fā)酵沒(méi)有抑制作用。

（2）采用Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化的方法，以感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)，優(yōu)化得到桑葉黃酮酸奶的最佳發(fā)酵工藝為：發(fā)酵劑添加量2.10%，蔗糖添加量9.60%，桑葉黃酮添加量0.67%，果膠添加量0.20%。以此工藝和配方，生產(chǎn)桑葉黃酮酸奶，其感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)預(yù)測(cè)最大值為92.3994，實(shí)測(cè)值為91.6，生產(chǎn)的桑葉黃酮酸奶色澤微黃，表面有細(xì)膩均勻光澤，無(wú)沉淀分層，有少量的乳清析出，入口有濃郁的桑葉清香，并且與乳香柔和，酸甜適口。