膜蛋白基因與抗生素環(huán)境適應(yīng)性的關(guān)聯(lián)研究

張文羿，劉洋碩

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018）

0 引 言

益生菌是足量攝入后會(huì)在人體內(nèi)定殖并對(duì)健康有益的一類活的微生物，它是通過改善和維持腸道微生物平衡來宿主產(chǎn)生有益影響，目前被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和工業(yè)等領(lǐng)域[1]。但是由于益生菌本身的特性，它在定殖于人體腸道之前往往會(huì)受到來自環(huán)境的脅迫，包括人體胃腸道中內(nèi)源性物質(zhì)的脅迫以及加工及貯藏過程的環(huán)境考驗(yàn)。內(nèi)源性物質(zhì)主要包括胃酸、膽鹽等；而外界環(huán)境的脅迫主要為冷熱脅迫、滲透壓脅迫以及氧脅迫[2-3]。不僅如此，近些年興起的抗生素也成為一種新的脅迫環(huán)境。由于抗生素濫用的現(xiàn)象非常普遍，在治療胃腸道或者與感染相關(guān)的疾病時(shí)尤為嚴(yán)重，這會(huì)對(duì)人體腸道中的腸道菌群產(chǎn)生一定的影響，也會(huì)導(dǎo)致益生菌在進(jìn)入人體之后無法發(fā)揮其本身的益生功能。因此，十分有必要研究益生菌在抗生素環(huán)境下的適應(yīng)性機(jī)制。

基因敲除技術(shù)是根據(jù)同源重組的原理，構(gòu)建帶有同源序列的基因敲除載體，以電轉(zhuǎn)化或者熱轉(zhuǎn)化的方式將其導(dǎo)入細(xì)胞，取代原始菌株上的等位基因，從而產(chǎn)生缺少目的基因的突變株，通過分析突變株的表型變化以及其與原始菌株的表型差異來確定目的基因的生物學(xué)功能，該技術(shù)是目前研究基因功能最有效的方法之一[4]。Cre/lox 位點(diǎn)特異性基因重組系統(tǒng)可以對(duì)轉(zhuǎn)入的基因進(jìn)行組織特異性和定點(diǎn)操作，對(duì)選取的目的基因進(jìn)行整合性刪除和條件性重組，這是基因敲除技術(shù)的關(guān)鍵組成部分[5]。該系統(tǒng)中主要涉及到的是Cre重組酶，其作用是介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的重組[6]。

Lactobacillus plantarum P-8 源自自然發(fā)酵酸牛乳，具有調(diào)節(jié)血脂、維持微生態(tài)平衡的功能特性[7-9]。課題組前期采用蛋白質(zhì)學(xué)技術(shù)建立了L. plantarum P-8 適應(yīng)氨芐西林環(huán)境過程中的差異表達(dá)蛋白譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膜蛋白基因（LBP_cg0719）與抗生素環(huán)境適應(yīng)性密切相關(guān)。與原始菌株相比，膜蛋白基因在氨芐西林環(huán)境下適應(yīng)性進(jìn)化1600 代后的L. plantarum P-8 菌株中顯著上調(diào)控。本研究為了進(jìn)一步了解膜蛋白基因在L. plantarum P-8 適應(yīng)氨芐西林環(huán)境中作用，采用Cre/lox 基因重組技術(shù)對(duì)膜蛋白基因的生物學(xué)功能進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）菌株和質(zhì)粒

在氨芐西林環(huán)境下連續(xù)培養(yǎng)1600 代的抗生素菌株Lactobacillus plantarum P-8-A-1600[10]，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；Escherichia coli DH5α[11]購買于澤生生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pNZ5319[11]和質(zhì)粒pMSPcre[12]分別由荷蘭瓦格寧根大學(xué)和山東大學(xué)提供。

（2）所用試劑及配制溶液

高保真 DNA 聚合酶、Taq DNA 聚合酶、5× PCR Buffer、三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTPs）和核酸染料均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶購自美國New England Biolabs 公司；T4 連接酶購自美國Beckman公司；紅霉素和氯霉素購自美國Sigma公司。

溶液I：MRS液體培養(yǎng)基中添加0.75 mmol/L山梨醇和0.1%甘氨酸；溶液II：1 mmol/L蔗糖＋3.5 mmol/L MgCl·26H2O，用于洗滌細(xì)胞。復(fù)蘇液：MRS+10 mmol/L CaCl2+100 mmol/L MgCl2+0.75 mol/L 山梨醇。以上溶液均需要現(xiàn)配現(xiàn)用，使用之前在冰上預(yù)冷。

（3）所用培養(yǎng)基

MRS 培養(yǎng)基，用于 L. plantarum P-8 的增殖，生長條件為37 ℃靜置培養(yǎng)。使用根據(jù)需要前添加紅霉素或氯霉素，添加量根據(jù)提供的效價(jià)計(jì)算，需要將其配制成水溶液（濃度均為10 μg/mL）并進(jìn)行濾菌操作，采用0.22 μm 的水系濾膜進(jìn)行過濾。

LB 培養(yǎng)基，用于大腸桿菌的增殖，生產(chǎn)條件為37 ℃搖床培養(yǎng)。紅綠霉素的添加方式與MRS培養(yǎng)基一致，紅霉素終濃度為250 μg/mL，氯霉素為10 μg/mL。

（4）所用儀器

PCR 儀，購自美國 Applied Biosystems 公司；核酸電泳儀、UPV 凝膠成像系統(tǒng)和MicroPulser TM 電擊儀，均購自美國Bio-Rad 公司；BT25S 分析天平，購自美國 Merrler Toledo 公司；5417R 離心機(jī)，購自德國Eppendorf 公司；DU800 分光光度計(jì)，購自美國Beckman公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找L. plantarum P-8全基因組序列（CP005942.2）并找出 LBP_cg0719 基因序列，使用軟件Primer premier 5.0 設(shè)計(jì)上下游同源臂引物，大小約為1 000 bp。引物合成由上海桑尼生物科技有限公司完成，具體引物名稱以及序列如表1所示。

表1 引物基本信息

1.3 同源臂擴(kuò)增

以L. plantarum P-8 基因組DNA 為模板，分別使用LBP_cg0719 的上下游同源臂引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到長度約1000 bp 的上下游同源臂片段。PCR 反應(yīng)的條件為：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 1 min，58 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 2 min，共 30 個(gè)循環(huán)；72 ℃終端延伸10 min；4 ℃保存。PCR 的反應(yīng)體系為50 μL，各成分及相應(yīng)體積如表2所示。

表2 PCR反應(yīng)體系基本信息

1.4 構(gòu)建敲除載體pNZ5319-0719 Up-Down

用限制性內(nèi)切酶將同源臂上游片段插入pNZ5319 質(zhì)粒的 XohI、PemI 酶切位點(diǎn)中，同源臂下游片段插入Eco53kI、BglII 酶切位點(diǎn)中。在42 ℃將質(zhì)粒pNZ5319 的 DNA 轉(zhuǎn)入 E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，吸取菌體細(xì)胞 100 μL 涂布于 10 μg/mL 的氯霉素 LB 固體平板，37 ℃培養(yǎng)48 h，篩選具有氯霉素抗性的載體pNZ5319-0719 Up-Down。用PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證結(jié)果，并將產(chǎn)物寄出測(cè)序，反應(yīng)所用引物為0719 upF/85R 和87F/0719 downR。

1.5 感受態(tài)菌體細(xì)胞的制備

將抗生素菌株L. plantarum P-8-A-1600 活化2 代后接種到MRS 空白培養(yǎng)基中，放置在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將菌液以2%的接種量接種到溶液I 中，37 ℃ 培養(yǎng)至其 OD600值在 0.3～0.6 之間時(shí)取出離心（6 000 rpm，4 ℃，5 min），棄掉上清液收集菌體。用1 mL 預(yù)冷的溶液II 重懸菌體，以相同條件離心，棄掉上清液收集菌體，重復(fù)洗滌3次。最后用40 μL預(yù)冷的溶液II重懸菌體，得到的菌液即為感受態(tài)菌體細(xì)胞。

1.6 敲除載體的電轉(zhuǎn)化

無菌電轉(zhuǎn)化杯置于冰上預(yù)冷10 min，加入40 μL預(yù)冷的感受態(tài)菌體細(xì)胞和1 μg 質(zhì)粒DNA，吹打混勻后在冰上靜置10 min。設(shè)置電擊儀的使用參數(shù)：電容25 μF、電壓1.7 kV、電阻200 Ω。將電轉(zhuǎn)化杯快速擦干放入電擊槽開始電轉(zhuǎn)化。務(wù)必要確保杯身的干燥潔凈，防止爆杯現(xiàn)象的發(fā)生。電轉(zhuǎn)化后，在電轉(zhuǎn)化杯中加入960 μL 預(yù)冷的復(fù)蘇液，吹打混勻，在冰上靜置5 min；之后將菌液轉(zhuǎn)移至2 mL 無菌EP 管中37 ℃靜置培養(yǎng)3 h，吸取100 μL 菌液涂布到含有氯霉素的MRS平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子。

1.7 篩選雙交換轉(zhuǎn)化子L. plantarum P-8-A-1600-0719::lox66-P32-cat-lox71

挑取轉(zhuǎn)化子單菌落，分別在含氯霉素10 μg/mL的MRS 液體培養(yǎng)基中活化24 h，隨后接種在濃度均為10 μg/mL 紅氯霉素雙抗生素MRS 培養(yǎng)基中，篩選出具有氯霉素抗性且不具有紅霉素抗性的雙交換子，同時(shí)將抗生素菌株L. plantarum P-8-A-1600 分別接種于含僅氯霉素和僅含紅霉素的MRS 培養(yǎng)基中作為對(duì)照組進(jìn)行培養(yǎng)（紅氯霉素濃度均為10 μg/mL）。將篩選到的雙交換子、敲除載體以及抗生素菌株分別用引物（EryF/EryR、CatF/CatR、0719 upF/0719 downR）進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證結(jié)果并寄樣測(cè)序。

1.8 消除紅霉素抗性基因并構(gòu)建突變菌株L.plantarum P-8-A-1600-0719

將具有氯霉素抗性的雙交換子電轉(zhuǎn)到pMSPcre質(zhì)粒中，電轉(zhuǎn)化的過程及條件與上述一致，涂布在10 μg/mL紅霉素的MRS固體平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h。長出的菌落則為含有紅霉素抗性的菌株，即帶有pMSPcre 質(zhì)粒的菌株。將其在MRS 液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代使質(zhì)粒pMSPcre 從菌株中丟失。為了驗(yàn)證突變株是否構(gòu)建成功，將篩選到的突變株再次用LBP_cg0719 的同源臂引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證，所用引物為EryF/EryR、CatF/CatR和0719 upF/0719 downR，以連續(xù)傳代前含有pMSPcre 質(zhì)粒的菌株作為對(duì)照。如果PCR驗(yàn)證及測(cè)序結(jié)果均為正確，那么所得到的菌株即為突變菌株L. plantarum P-8-A-1600-0719。

1.9 突變菌株L. plantarum P-8-A-1600-0719 耐藥表型分析

將突變菌株L. plantarum P-8-A-1600-0719 和抗生素菌株L. plantarum P-8-A-1600 分別接種在濃度為 4 μg/mL、8 μg/mL 和 16 μg/mL 的氨芐西林 MRS培養(yǎng)基以及不含氨芐西林的空白MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，采用分光光度計(jì)測(cè)定不同菌株在波長為600 nm時(shí)的OD值。以抗生素菌株L. plantarum P-8-A-1600 的OD600值作為對(duì)照，從而分析突變株與抗生素菌株的耐藥性表型。

2 結(jié) 果

2.1 敲除載體pNZ5319-0719 Up-Down的構(gòu)建

在含有10 μg/mL 氯霉素的LB 平板上篩選具有抗性的菌株進(jìn)行增殖培養(yǎng)，隨后用PCR 反應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果如圖1 所示，泳道1 至泳道4 所用引物分別為 0719upF/0719upR、0719upF/85R、0719downF/0719downR 和 87F/0719downR。泳道 1 與泳道 2 相比，條帶要低100 bp 左右；泳道3 和泳道4 相比，條帶同樣要低100 bp 左右。這是因?yàn)?5R 的位點(diǎn)本身要比0719upR 靠后100 bp 左右，而87F 的位點(diǎn)要比0719downF 靠前約100 bp，所以導(dǎo)致載體片段大小發(fā)生變化，在膠圖中顯示為泳道2 和4 的條帶比泳道1 和3 高約100 bp，由以上結(jié)果說明前后臂已經(jīng)成功插入pNZ5319 質(zhì)粒，且測(cè)序結(jié)果說明各序列均正確。由此可知，載體pNZ5319-0719 Up-Down成功構(gòu)建。

圖1 敲除載體PCR方法驗(yàn)證

2.2 雙交換子L. plantarum P-8-A-1600-0719::lox66-P32-cat-lox71的篩選

將敲除載體pNZ5319-0719 Up-Down電擊轉(zhuǎn)化到L. plantarum P-8-A-1600后，涂布于濃度均為10 μg/mL氯霉素和紅霉素MRS 固體平板上，篩選出具有氯霉素抗性且不具有紅霉素抗性的雙交換子，即前后同源臂均進(jìn)行交換的帶有質(zhì)粒的菌株。用引物0719 upF/0719 downR、EryF/EryR、CatF/CatR 進(jìn)行驗(yàn)證，并以抗生素菌株L. plantarum P-8-A-1600 和質(zhì)粒pNZ5319 作為對(duì)照。泳道1-3 所用引物為EryF/EryR；泳道4-6 所用引物為CatF/CatR；泳道7-9 所用引物為0719 upF/0719 downR。菌株順序依次為抗生素菌株L. plantarum P-8-A-1600、質(zhì)粒pNZ5319 和雙交換子L. plantarum P-8-A-1600-0719::lox66-P32-cat-lox71。驗(yàn)證結(jié)果如圖2 所示，因?yàn)閜NZ5319 同時(shí)具有紅霉素基因和氯霉素抗性基因而抗生素菌株和突變株均無紅氯霉素抗性，所以泳道2 出現(xiàn)條帶，而泳道 1 和 3 沒有出現(xiàn)條帶；L. plantarum P-8-A-1600 不含紅霉素基因和氯霉素基因，因此泳道4 沒有出現(xiàn)條帶，而泳道5 和泳道6 均出現(xiàn)條帶。因?yàn)榭股鼐辍①|(zhì)粒和突變株均含有LBP_cg0719 目的基因，所以泳道7-9 均有條帶出現(xiàn)，而由于質(zhì)粒pNZ5319 和雙交換子L. plantarum P-8-A-1600-0719::lox66-P32-cat-lox71與L. plantarum P-8-A-1600 相比多了氯霉素抗性基因片段，因此其全長片段要大于L. plantarum P-8-A-1600，在膠圖中顯示為泳道7 的條帶要比泳道8 和9 稍低。PCR 產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果顯示各序列均正確。由此可知，已經(jīng)成功地篩選到了雙交換子。

表3 PCR所用菌株及引物

圖2 雙交換子PCR方法驗(yàn)證

2.3 突變株L. plantarum P-8-A-1600-0719的構(gòu)建

將質(zhì)粒pMSPcre 電轉(zhuǎn)到篩選到的雙交換子L. plantarum P-8-A-1600-0719::lox66-P32-cat-lox71中，涂布于濃度為10 μg/mL 紅霉素的MRS 平板上，篩選出具有紅霉素抗性而不具有氯霉素抗性的菌株，并在無抗生素的空白MRS 培養(yǎng)基中連續(xù)傳10 代使pMSPcre 質(zhì)粒丟失。用引物EryF/EryR、CatF/CatR和0719 upF/0719 downR 進(jìn)行驗(yàn)證，以L. plantarum P-8-A-1600 和質(zhì)粒 pMSPcre 作為對(duì)照。泳道 1-3 為L. plantarum P-8-A-1600、質(zhì)粒 pMSPcre 和 L. plantarum P-8-A-1600-0719 用 EryF/EryR 為引物的 PCR產(chǎn)物，泳道4-6 所用引物為CatF/CatR，泳道7-9 是抗生素菌株、質(zhì)粒和突變株用目的基因特異性引物0719 UpF/0719 DownR 進(jìn)行PCR 得到的結(jié)果。驗(yàn)證結(jié)果如圖3 所示，在L. plantarum P-8-A-1600-0719中均沒有出現(xiàn)紅霉素、氯霉素的基因，且L. plantarum P-8-A-1600中的前后臂比L. plantarum P-8-A-1600-0719 要長500 bp 左右。同時(shí)，測(cè)序結(jié)果也顯示各序列都正確。因此，結(jié)果說明已經(jīng)成功構(gòu)建了突變株L.plantarum P-8-A-1600-0719。

2.4 突變株L. plantarum P-8-A-1600-0719 的耐藥表型分析

對(duì)突變株L. plantarum P-8-A-1600-0719 進(jìn)行氨芐西林耐藥性表型分析，并且對(duì)其在不同氨芐西林濃度中的生長特性進(jìn)行檢測(cè)。以抗生素菌株L. plantarum P-8-A-1600 為對(duì)照，結(jié)果如圖4 所示，突變株L.plantarum P-8-A-1600-0719 在正常培養(yǎng)基中生長時(shí)，和抗生素菌株相比，OD600值幾乎沒有差異。隨著氨芐西林的濃度不斷提高，抗生素菌株和突變株的OD600值同時(shí)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但是兩者之間的差距也在逐漸增加。當(dāng)氨芐西林濃度增加到16 μg/mL時(shí)，突變株的OD600值約為抗生素菌株的2 倍。因此，由L. plantarum P-8-A-1600-0719 的耐藥性表型可以推斷，基因LBP_cg0719 與L. plantarum P-8 抗生素適應(yīng)性菌株的耐藥性相關(guān)。

表4 PCR反應(yīng)所用菌株及引物

圖3 突變株P(guān)CR方法驗(yàn)證

圖4 抗生素菌株與突變株在添加不同濃度氨芐西林的LSM培養(yǎng)基中濁度的變化

3 結(jié) 論

本研究以實(shí)驗(yàn)室抗生素適應(yīng)性進(jìn)化性菌株為研究對(duì)象，為了進(jìn)一步確認(rèn)該基因的生物學(xué)功能，采用Cre-lox 基因敲除技術(shù)對(duì)目的基因LBP_cg0719 進(jìn)行敲除實(shí)驗(yàn)，得到L. plantarum P-8-A-1600-0719 突變體菌株，并對(duì)其表型進(jìn)行分析。研究結(jié)果顯示敲除了LBP_cg0719 基因的突變體菌株在抗生素環(huán)境中的濁度更大，生長狀況更加良好，相比于L. plantarum P-8-1600 具有更好的適應(yīng)性。因此可以推測(cè)，LBP_cg0719 基因?qū). plantarum P-8的耐藥性具有一定的調(diào)節(jié)作用。