不同產(chǎn)地木豆葉中5種黃酮類成分含量的比較及聚類分析

黎映瓊 蔡慶群 蘇志強(qiáng) 陳標(biāo)妹

摘要 [目的]建立木豆葉中5種黃酮類成分含量的測定方法，比較不同產(chǎn)地木豆葉中5種黃酮類成分的含量并對其進(jìn)行聚類分析。[方法]采用HPLC-DAD建立木豆葉中5種黃酮類成分（葒草苷、牡荊苷、木犀草素、染料木素、球松素）的含量測定方法，色譜柱為 Agilent Zobax Eclipse XDB-C 18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長330 nm，柱溫為30 ℃;通過IBM SPSS 22.0對不同產(chǎn)地木豆葉進(jìn)行聚類分析。[結(jié)果]5種對照品在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)與峰面積均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系;回收率均在90%～110%;不同產(chǎn)地木豆葉中5種黃酮類成分含量差異較大，基于5種黃酮類成分含量對不同產(chǎn)地的木豆葉聚類結(jié)果表明，木豆葉可分為2組，其中一組5種黃酮總量基本都大于0.5%，另一組則基本小于0.5%，但是并無明顯產(chǎn)地聚類特性。[結(jié)論]該研究建立的木豆葉5種黃酮類物質(zhì)含量測定方法準(zhǔn)確、可靠，可用于木豆葉中5種黃酮成分的含量測定;根據(jù)聚類分析表明，不同產(chǎn)地木豆葉質(zhì)量參差不齊，可以優(yōu)選黃酮含量高的品種進(jìn)行選育，從而保證藥材來源的質(zhì)量穩(wěn)定性以及用藥安全性。

關(guān)鍵詞 木豆葉;不同產(chǎn)地;黃酮;聚類分析

中圖分類號 R284? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2020）20-0203-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.20.054

Comparison and Cluster Analysis of Five Flavonoids in Cajanus cajan Leaves from Different Producing Areas

LI Ying-qiong， CAI Qing-qun， SU Zhi-qiang et al

（The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou， Guangdong 510405）

Abstract [Objective] To establish a method for determining the content of five flavonoids in Cajanus cajan leaves and comparing the content of five flavonoids in Cajanus cajan leaves from different regions and perform cluster analysis. [Method] An HPLC method was developed for the determination of five flavones （Humulusside， vitexin， luteolin， genistein， pinostrobin） in the Cajanus cajan leaves. The chromatographic column was Agilent Zobax Eclipse XDB-C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）;gradient elution using methanol （A）-0.1% formic acid aqueous solution （B） as the mobile phase;flow rate was set at 1.0 mL/min;detection wavelength was set 330 nm;column temperature was set at 30 ℃;the content of five flavonoids of Cajanus cajan leaves from different areas were detected using the above methods;cluster analysis of Cajanus cajan leaves of different origins by IBM SPSS 22.0 was conducted. [Result] The five reference products showed a good linear relationship with the peak area in the corresponding concentration range;the recovery rates were between 90% and 110%;the content of the five flavonoids in the leaves of Cajanus cajan leaves from different places varied widely. The clustering results based on the content of five flavonoids showed that Cajanus cajan leaves from different places can be divided into two groups. The total amount of flavonoids in one group is basically greater than? 0.5%， and the other group is basically less than 0.5%， but there is no obvious clustering characteristics of origin. [Conclusion] The method for determining the content of five flavonoids in Cajanus cajan leaves is accurate and reliable. It can be used to determine the content of five flavonoids in Cajanus cajan leaves. According to the cluster analysis， the quality of Cajanus cajan leaves varies from place to place， and varieties with high flavonoid content can be selected for breeding， so as to ensure the quality stability of the medicinal materials and the safety of the medication.

Key words Cajanus cajan leaves;Different producing areas;Flavones;Cluster analysis

木豆葉，又名柳豆葉，為豆科植物木豆[Cajanus cajan（L.）Millsp.]的干燥葉。木豆為豆科木豆屬落葉灌木 [1-2]，主要分布于長江以南的海南、云南、廣西、貴州、廣東以及福建、湖南、四川、江西、浙江、臺灣等省區(qū) [3]，它既是重要的木本糧食作物，也是一種重要的藥用植物，為廣東、廣西、海南地區(qū)習(xí)用中藥，具有活血化瘀、消腫止痛、補(bǔ)腎健骨、祛腐生肌之功效?，F(xiàn)代研究表明，木豆葉具有抗炎 [4]、降脂 [5]、抗骨質(zhì)疏松 [6]、抗股骨頭壞死 [7-8]等作用。

木豆葉主要活性成分為黃酮類化合物，包括葒草苷、牡荊苷、芒柄花苷、染料木素、木犀草素、球松素等 [2，9]。然而目前關(guān)于其黃酮類的研究主要在于藥理以及總黃酮提取工藝方面 [10-11]，黃酮類含量測定主要集中在對其牡荊苷單一成分定量研究 [12-13]，少見多種成分同時(shí)測定的文獻(xiàn)報(bào)道。采用單一指標(biāo)性成分含量進(jìn)行中藥材質(zhì)量控制存在一定缺陷，因此，筆者采用HPLC同時(shí)測定木豆葉中5種黃酮類成分（葒草苷、牡荊苷、染料木素、木犀草素、球松素）的含量，并對來自不同產(chǎn)地的20批次木豆葉進(jìn)行含量及聚類分析，以期為木豆葉的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材。不同產(chǎn)地木豆葉采集信息見表1。各木豆葉樣品經(jīng)實(shí)驗(yàn)室通過ITS通用引物序列鑒定為豆科植物木豆。

1.1.2 試劑。對照品染料木素（批號B21039，含量98%）、木犀草素（批號B20888，含量98%），購自上海源葉生物科技有限公司;球松素（批號BD8743，含量95%）、葒草苷（批號306855，含量95%），購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;牡荊苷（批號137309，含量98%），購自百靈威科技有限 公司。

1.1.3 儀器。LC-20A型高效液相色譜儀，檢測器為Prominence SPD-M20A PDA檢測器（日本島津）;Heal Force Smart超純水系統(tǒng)（香港力康生物醫(yī)療科技控股集團(tuán)）;MS105型1/100 000電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 方法

1.2.1 供試品的制備。將木豆葉樣品充分干燥粉碎后，精密稱取0.5 g，置50 mL錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，密塞，稱定，超聲30 min，放冷，補(bǔ)重，過濾，濾液經(jīng)微孔濾膜 （0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2 對照品的制備。精密稱取5種黃酮類對照品適量，加入甲醇，配制成含牡荊苷0.101 5 mg/mL、葒草苷 0.384 5 mg/mL、染料木素0.123 4 mg/mL、木犀草素 0.202 5 mg/mL、球松素 0.167 8 mg/mL的對照品儲備液。

1.2.3 HPLC分析條件。色譜柱為Agilent Zobax Eclipse XDB-C 18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）為流動(dòng)相。洗脫梯度：0～10 min，10%～50% A;10～50 min， 50%～80% A;50～60 min，80% A;60～62 min，80%～10% A;62～ 72 min，10%A。流速為1.0 mL/min，檢測波長 330 nm，柱溫 為30 ℃。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線考察。取“1.2.2”對照品儲備液進(jìn)行梯度稀釋后按照“1.2.3”條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，以進(jìn)樣量（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X）、峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得5種黃酮成分的回歸方程和線性范圍。

1.2.5 方法學(xué)考察。

1.2.5.1 精密度考察。取“1.2.1”同一份供試品溶液10 μL，根據(jù)該研究色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，獲得葒草苷等5種黃酮類成分峰面積值，計(jì)算得5種成分峰面積RSD值。

1.2.5.2 穩(wěn)定性考察。精密吸取“1.2.1”同一份供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣，測定不同時(shí)間條件下各成分的峰面積并計(jì)算RSD值。

1.2.5.3 重復(fù)性考察。精密稱取同一批次木豆葉樣品6份，按照“1.2.1”供試品制備方法制備樣品，分別進(jìn)樣10 μL，計(jì)算5種黃酮類成分含量的RSD值。

1.2.5.4 加樣回收率考察。精密稱取已知含量的木豆葉樣品6份，每份各0.5 g，按照供試品中黃酮-黃酮對照品含量 1∶1的比例添加5種對照品，按“1.2.1”制備供試品，按“1.2.3”色譜條件分別進(jìn)樣，計(jì)算回收率和RSD。

1.2.6 不同產(chǎn)地木豆葉樣品含量測定。不同產(chǎn)地木豆葉經(jīng)充分干燥制備供試品后，按照“1.2.3”色譜條件進(jìn)樣分析并計(jì)算含量。

1.2.7 聚類分析。通過IBM SPSS 22.0基于5種黃酮含量對不同產(chǎn)地木豆葉進(jìn)行聚類分析。以5種黃酮含量為變量，采用SPSS對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以平方歐氏距離為測度進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木豆葉5種異黃酮類成分HPLC圖譜

按“1.2.3”條件操作，木豆葉5種黃酮類成分分離度好，均大于1.5，且陰性無干擾，專屬性強(qiáng)（圖1）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 按“1.2.4”操作，結(jié)果見表2。由表2可知，5種成分進(jìn)樣量與峰面積之間有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線 r均大于0.999。

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.1 精密度。按“1.2.5.1”操作，計(jì)算得5種成分峰面積的RSD值分別為0.33%、0.25%、1.86%、1.28%、1.45%，均小于 2.00%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性。按“1.2.5.2”操作，計(jì)算得5種成分峰面積的RSD值分別為1.34%、1.49%、0.99%、0.78%、0.98%，均小于 2.00%，表明供試品溶液穩(wěn)定性較好。

2.3.3 重復(fù)性。按“1.2.5.3”操作，計(jì)算得6份樣品中5種黃酮類成分含量分別0.142%、0.160%、0.002%、0.015%、 0.158%，RSD值分別為0.22%、1.58%、1.22%、3.04%、2.11%，均小于3.00%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.3.4 加樣回收率。按“1.2.5.4”操作，計(jì)算得木豆葉中5種黃酮類成分的平均加樣回收率分別為100.01%、98.45%、 98.34%、95.14%、103.45%，RSD值分別為1.49%、1.35%、 2.18%、2.33%、 1.45%，加樣回收率在95%～105%，RSD均小于3%，說明方法準(zhǔn)確度高。

2.4 不同產(chǎn)地木豆葉樣品的黃酮類成分含量

由表3可知，不同產(chǎn)地木豆葉5種黃酮類成分含量差異較大，葒草苷含量在 0.048%～0.239%，牡荊苷含量在0.054%～0.269%，染料木素含量在0.000%～0.004%，木犀草素含量在0.000%～ 0.015%，球松素含量在0.004%～0.241%，5種黃酮總含量在0.175%～0.728%。

2.5 聚類分析

由圖2可知，根據(jù)黃酮含量高低可將不同產(chǎn)地木豆葉分為2組：YN-6、SC-1、YN-7、YN-5、GX-2、 YN-3、YN-4、SC-2為第1組，該組木豆葉5種黃酮總量基本都低于0.5%;GX-3、GX-4、GX-1、YN-2、GX-5、YN-1、 HN-1、HN-2、HN-3、GD-1、GD-2、GD-3為第2組，5種黃酮總量基本都超過0.5%。

3 結(jié)論與討論

（1）目前總黃酮的提取方法包括加熱回流法、超聲提取法以及表面活性劑輔助酶法等 [14-16]?；诔曁崛》ǖ姆奖阈?，該研究采用超聲提取法開展了試驗(yàn)，結(jié)果表明，該提取方法能有效、方便地提取出木豆葉中的黃酮類成分，雜質(zhì)干擾較少。

（2）該研究采用DAD檢測在190～400 nm紫外波長下進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果表明：5種成分在波長330 nm條件下有較強(qiáng)的吸收，且基線平穩(wěn)，因此選擇330 nm作為最終試驗(yàn)檢測波長。

（3）該研究根據(jù)木豆葉主要活性成分研究的相關(guān)文獻(xiàn) [17-18]，選擇其中的5個(gè)黃酮類成分葒草苷、牡荊苷、球松素、染料木素以及木犀草素作為指標(biāo)進(jìn)行含量測定，結(jié)果表明，所建立的含量測定方法操作方便、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高，且能同時(shí)檢測木豆葉中的5種成分，可用于木豆葉黃酮類成分的含量測定及其質(zhì)量控制。

（4）將該方法應(yīng)用于不同產(chǎn)地木豆葉黃酮類成分含量比較，結(jié)果表明：不同產(chǎn)地木豆葉的含量差異較大。為了確保藥材來源的穩(wěn)定性、有效性以及安全性，后續(xù)可對黃酮類成分含量較高的木豆葉進(jìn)行選育工作，從而確保該性狀的穩(wěn)定遺傳。

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