響應(yīng)面法優(yōu)化川澤瀉發(fā)汗工藝

羅騫昀 羅昕怡 張亞琴 文秋姝 鄧秋林 陳興福

摘要 [目的]用響應(yīng)面法優(yōu)化澤瀉發(fā)汗加工工藝。[方法]通過標(biāo)準(zhǔn)分轉(zhuǎn)換，以發(fā)汗?jié)蔀a的浸出物含量、23乙酰澤瀉醇B和24乙酰澤瀉醇A含量的綜合評分為考察指標(biāo)，分別探究環(huán)境溫度、發(fā)汗時間和含水量對綜合評分的影響，在單因素試驗確定的優(yōu)化范圍基礎(chǔ)上，采用3因子二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計的響應(yīng)面法優(yōu)化了川澤瀉的發(fā)汗工藝。[結(jié)果]川澤瀉發(fā)汗的最佳工藝條件是環(huán)境溫度45 ℃、發(fā)汗時間94 h、含水量10%，此條件下綜合評分為94.02±0.02，浸出物含量為（15.34±0.02）%，23乙酰澤瀉醇B含量為（0.06± 0.02）mg/mL，24乙酰澤瀉醇A含量為（0.02±0.01）mg/mL。[結(jié)論]該研究建立的澤瀉最佳發(fā)汗工藝能夠提高澤瀉質(zhì)量，為川澤瀉的開發(fā)和利用提供可靠方法。

關(guān)鍵詞 川澤瀉;發(fā)汗工藝;響應(yīng)面法;工藝優(yōu)化;綜合評分

中圖分類號 R284? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2020）20-0180-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.20.048

Optimization of Diaphoretic Processing of Alisma orientalis by Response Surface Methodology

LUO Qian-yun，LUO Xin-yi，ZHANG Ya-qin et al

（College of Agriculture， Sichuan Agricultural University，Wenjiang，Sichuan 611130）

Abstract [Objective]To optimize the diaphoretic processing of Alisma orientalis by response surface methodology.[Method]Through the conversion of standard scores， the comprehensive scores of the extract content， Alisol B 23 acetate and Alisol A 24 acetate were used as the investigation indicators， and the effects of environmental temperature， diaphoretic time and water content on the comprehensive score were explored respectively.Based on the optimization range determined by the single factor experiment， the diaphoretic processing of Alisma orientalis was optimized using the response surface method of the three-factor quadratic regression orthogonal rotation combination design.[Result]The best diaphoretic processing of Alisma orientalis were environmental temperature 45 ℃，diaphoretic time 94 h， and water content 10%. Under this condition， the comprehensive score was 94.02±0.02， the extract content was （15.34±0.02）%， and Alisol B 23 acetate was （0.06±0.02） mg/mL and Alisol A 24 acetate was （0.02±0.01） mg/mL. [Conclusion ]The best diaphoretic processing method established on this experiment could increase the quality of Alisma orientalis，providing reliable method for the expansion of the market.

Key words Alisma orientalis（Sam.）Juzep.;Diaphoretic processing;Response surface methodology;Processing optimization;Comprehensive grade

澤瀉科植物澤瀉Alisma orientalis（Sam.）Juzep.的干燥塊莖為常用大宗藥材?，F(xiàn)代藥理研究表明，澤瀉具有利尿、降血脂、降血糖、抗炎等功效，對心血管和免疫系統(tǒng)也具有一定的藥理作用。澤瀉也是六味地黃丸等中成藥的主要原料之一，每年的需求量6 000～8 000 t，應(yīng)用廣、出口量大，具有廣闊的市場前景。澤瀉為著名川產(chǎn)地道藥材，主要產(chǎn)于四川、福建和江西，分別稱為川澤瀉、建澤瀉和江澤瀉，川澤瀉目前已占澤瀉市場用量的70%～80%。澤瀉質(zhì)量是市場開發(fā)的關(guān)鍵，其質(zhì)量指標(biāo)主要包括灰分、浸出物、23乙酰澤瀉醇B。萜類成分24乙酰澤瀉醇A和23乙酰澤瀉醇B是澤瀉主要的利尿活性成分，常用于評價澤瀉品質(zhì)和相關(guān)藥物生產(chǎn)。《中國藥典》（2015年版）規(guī)定，澤瀉藥材中醇溶性浸出物的含量不能低于10% [1]，有研究發(fā)現(xiàn)市場上的川澤瀉醇浸出物含量達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，但其含量較建澤瀉低6%左右;建澤瀉中23乙酰澤瀉醇B含量較高，而川澤瀉中24乙酰澤瀉醇A含量較高 [2-3]。因此，優(yōu)化和改善川澤瀉的加工工藝是進(jìn)一步提高川澤瀉市場競爭力的重要途徑。

“發(fā)汗”是中藥材產(chǎn)地加工中常用的方法之一。“發(fā)汗”是將鮮藥材加熱或半干燥后，密閉堆積發(fā)熱，使其內(nèi)部含水量向外蒸發(fā)，并凝結(jié)成水珠附于藥材的表面，其目的是加快藥材的干燥，有利于藥材的保存，適用于澤瀉、厚樸、杜仲等藥材。研究表明，“發(fā)汗”加工過程會在一定程度上對藥材的外表性狀、內(nèi)在成分含量、藥用療效等方面有影響 [4]。通過市場調(diào)研得知，川澤瀉主要藥效成分含量也能夠通過“發(fā)汗”得以提高，但產(chǎn)地發(fā)汗方法不規(guī)范、工藝參數(shù)還有待通過試驗探究優(yōu)化。該研究以川澤瀉為研究對象，針對目前澤瀉生產(chǎn)上發(fā)汗的實際情況，通過試驗探究影響川澤瀉質(zhì)量的3個因素即環(huán)境溫度、發(fā)汗時間和含水量，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)汗工藝，以期為提高川澤瀉質(zhì)量和功效奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試原料。川澤瀉，產(chǎn)地為四川眉山市彭山區(qū)，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)陳興福教授鑒定為澤瀉科植物澤瀉Alisma orientalis（Sam.）Juzep.的干燥塊莖。

1.1.2 主要儀器。安捷倫1120 4286AA高效液相色譜儀，安捷倫公司;101-A3型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海捷呈有限公司;萬能高速粉碎機，廣東旭朗機械設(shè)備有限公司;FT10-2高速臺式離心機，北京金洋萬達(dá)科技有限公司。

1.1.3

主要試劑。24乙酰澤瀉醇A、23乙酰澤瀉醇B標(biāo)準(zhǔn)品購買于成都格利普生物科技有限公司;甲醇和乙腈（色譜純），購買于南京化學(xué)試劑股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1

灰分含量測定。參考《中國藥典》（2015年版）“通則2302灰分測定法”中第一法測定 [1]。平行測定3次，即得。

1.2.2

浸出物含量測定。參考《中國藥典》（2015年版）“通則2201浸出物測定法”中第二法測定 [1]，平行測定3次，即得。

1.2.3

23乙酰澤瀉醇B、24乙酰澤瀉醇A的含量測定。

1.2.3.1

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。分別精密稱取適量24乙酰澤瀉醇A和23乙酰澤瀉醇B標(biāo)準(zhǔn)品于15 mL容量瓶中，加入 10 mL乙腈定容，搖勻，得到24乙酰澤瀉醇A母液濃度為 0.02 mg/mL，23乙酰澤瀉醇B母液濃度為0.03 mg/mL。

1.2.3.2

供試品溶液的制備。精密稱取澤瀉粉末0.2～ 0.5 g置離心管中，加入乙腈10 mL，密塞，超聲處理（75 W，45 kHz）20 min，冷卻，在4 000 r/min條件下離心20 min，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

1.2.3.3

樣品測定。采用高效液相色譜法測定樣品中的24乙酰澤瀉醇A和23乙酰澤瀉醇B含量。色譜條件：色譜柱為Eclipse Plus C 18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相為乙 腈-水（V∶V=78∶22）;流速0.8 mL/min;柱溫25 ℃;檢測波長 208 nm;進(jìn)樣量10 μm。

1.2.4

浸出物綜合評分方法。采用標(biāo)準(zhǔn)分轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)行試驗綜合評分 [5]。浸出物、23乙酰澤瀉醇B和24乙酰澤瀉醇A為澤瀉的主要質(zhì)量指標(biāo)，因此以這3個指標(biāo)的綜合評分作為響應(yīng)面試驗設(shè)計中的響應(yīng)值。對不同條件下發(fā)汗?jié)蔀a的浸出物、23乙酰澤瀉醇B和24乙酰澤瀉醇A含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)分轉(zhuǎn)化，因該試驗各指標(biāo)最大值為最優(yōu)，最大值計為100分，最小值計0分，根據(jù)藥典各成分含量要求及實際應(yīng)用價值，將浸出物權(quán)重比例設(shè)置為40%，23乙酰澤瀉醇B設(shè)置為50%，24乙酰澤瀉醇A設(shè)置為10%。各試驗項的得分（Xi）=100×（Xi-X min）/（X max-X min）。各指標(biāo)結(jié)果按此公式轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)分后，按指標(biāo)權(quán)重比例得到綜合評分，其計算公式為： Xi=50%×100×（X 1i-X 1min）/（X 1max-X 1min）+40%×100×（X 2i-X 2min）/（X 2max-X 2min）+10%×100×（X 3i-X 3min）/（X 3max-X 3min），式中，X1為浸出物，X2為23乙酰澤瀉醇B，X3為24乙酰澤瀉醇A。

1.2.5 單因素試驗?！吨袊幍洹罚?015年版）中明確說明“發(fā)汗”加工法的操作方法，即直接將一定量的中藥材堆積，進(jìn)行“發(fā)汗”。該研究模擬藥材真實發(fā)汗環(huán)境，全程用培養(yǎng)箱嚴(yán)格控制溫度條件。

1.2.5.1

環(huán)境溫度對發(fā)汗效果的影響。澤瀉多于秋末冬初進(jìn)行采收和加工，發(fā)汗常于室外進(jìn)行。在澤瀉樣品含水量為15%、發(fā)汗時間為72 h條件下，該試驗在培養(yǎng)箱嚴(yán)格控制溫度穩(wěn)定的情況下，分別考察發(fā)汗時環(huán)境溫度為15、25、35、45、55 ℃時對澤瀉質(zhì)量綜合評分的影響。

1.2.5.2

發(fā)汗時間對發(fā)汗效果的影響。取干燥澤瀉適量，在環(huán)境溫度為25 ℃、含水量為15%條件下，分別考察發(fā)汗時間為24、36、72、108、144 h時對澤瀉質(zhì)量綜合評分的影響。

1.2.5.3

含水量對發(fā)汗效果的影響。取干燥澤瀉適量，當(dāng)澤瀉含水量分別為10%、15%、20%、25%、30%時，均在25 ℃條件下發(fā)汗72 h，考察不同原料澤瀉的含水量對澤瀉質(zhì)量綜合評分的影響。

1.2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化澤瀉發(fā)汗工藝。

1.2.6.1

響應(yīng)面法優(yōu)化工藝。根據(jù)單因素考察結(jié)果得到初步優(yōu)化范圍，采用響應(yīng)面試驗設(shè)計，對同一批次澤瀉藥材在培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)汗處理，以浸出物、24乙酰澤瀉醇A和23乙酰澤瀉醇B含量的綜合評分為響應(yīng)值，對環(huán)境溫度（A）、發(fā)汗時間（B）、含水量（C）3個因素進(jìn)行優(yōu)化。對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式回歸擬合分析（Design-Expert 8.0.6軟件），剔除影響不顯著因素后，得到其數(shù)學(xué)模型。利用上述模型和方程分析預(yù)測最佳發(fā)汗工藝參數(shù)。

1.2.6.2

顯著性檢驗。對回歸方程進(jìn)行方差和顯著性 分析。

1.2.6.3

模型的驗證。根據(jù)回歸模型優(yōu)選出的最佳工藝，在此條件下進(jìn)行驗證試驗，測定3次平行試驗的綜合評分，觀察是否與預(yù)測值吻合，從而表明該試驗所建立的數(shù)學(xué)模型的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰分和浸出物的含量測定

試驗測得供試品中灰分含量均小于5%，浸出物含量均大于10%，符合藥典規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 23乙酰澤瀉醇B、24乙酰澤瀉醇A的含量測定

標(biāo)準(zhǔn)品和供試樣品的測定結(jié)果見圖1。由圖1可見，供試品中含有測定目標(biāo)成分，即在保留時間8 min左右出現(xiàn)24乙酰澤瀉醇A的峰，18 min左右出現(xiàn)23乙酰澤瀉醇B的峰，因此測定數(shù)據(jù)可用于進(jìn)一步分析。

2.3 單因素試驗

2.3.1

環(huán)境溫度對發(fā)汗效果的影響。由圖2a可知，隨環(huán)境溫度的增加，綜合評分呈先上升后略下降的趨勢，環(huán)境溫度為45 ℃時，綜合評分達(dá)到最高值。這可能是環(huán)境溫度的升高能夠增強澤瀉內(nèi)源酶活性，從而促進(jìn)相關(guān)的生化反應(yīng)，當(dāng)溫度達(dá)到一定值后，可能會由于熱脅迫而刺激澤瀉的發(fā)汗產(chǎn)物進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成次級代謝產(chǎn)物，如萜類等，從而對質(zhì)量綜合評分產(chǎn)生影響 [6]。試驗中發(fā)現(xiàn)15 ℃條件下澤瀉無發(fā)汗表現(xiàn)，55 ℃條件下發(fā)汗?jié)蔀a表現(xiàn)出發(fā)霉嚴(yán)重的情況，因此選取25、35、45 ℃為后續(xù)優(yōu)化試驗的3個水平。

2.3.2

發(fā)汗時間對發(fā)汗效果的影響。由圖2b可知，隨發(fā)汗時間增長，綜合評分呈先上升后略下降的趨勢。這可能是隨發(fā)汗時間延長，發(fā)汗過程中的生理生化反應(yīng)進(jìn)行得更徹底，從而提高了藥材質(zhì)量。試驗研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)汗時間為108 h時澤瀉出現(xiàn)輕微發(fā)霉現(xiàn)象，至144 h時發(fā)汗?jié)蔀a發(fā)霉嚴(yán)重，因此選擇36、72、108 h為后續(xù)優(yōu)化試驗的3個水平。

2.3.3

含水量對發(fā)汗效果的影響。由圖2c可知，隨含水量的增加，綜合評分呈先上升后下降的趨勢。這可能是含水量對澤瀉內(nèi)部酶活性有一定影響。試驗發(fā)現(xiàn)10%含水量條件下發(fā)汗?jié)蔀a無明顯發(fā)汗表現(xiàn)，30%含水量條件下發(fā)汗?jié)蔀a出現(xiàn)較嚴(yán)重發(fā)霉情況，因此選擇10%、15%、20%為后續(xù)優(yōu)化試驗的3個水平。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化澤瀉發(fā)汗工藝

2.4.1 回歸分析。經(jīng)回歸分析得到響應(yīng)面數(shù)學(xué)模型：

Y= 54.55-8.13A+3.18B-0.64C+4.36AB-22.15AC-7.00BC- 1.70A2-22.60B2-7.21C2。由表1綜合評分結(jié)果分析，最佳發(fā)汗工藝參數(shù)為環(huán)境溫度25 ℃、發(fā)汗時間72 h、含水量20%，此條件下綜合評分為86.31。結(jié)合上述回歸模型分析預(yù)測，最佳發(fā)汗工藝參數(shù)為環(huán)境溫度45 ℃、發(fā)汗時間94 h、含水量10%，此條件下綜合評分為93.10。

由圖3中的三維響應(yīng)曲面圖可得，發(fā)汗時間和含水量對整個發(fā)汗工藝影響顯著，環(huán)境溫度對整個工藝影響不顯著，環(huán)境溫度和含水量交互作用顯著。

2.4.2

顯著性檢驗。對回歸方程進(jìn)行方差和顯著性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型的F=7.60、P=0.007 0，說明選用的模型具有顯著性。發(fā)汗時間和含水量的二次項的P<0.05，說明發(fā)汗時間和含水量對整個發(fā)汗工藝影響顯著;環(huán)境溫度及其二次項的P>0.05，因此環(huán)境溫度對整個工藝影響不顯著。環(huán)境溫度和含水量交互項的P<0.05，表明溫度和含水量交互作用顯著，其他因素間的交互作用不顯著。這與圖3顯示的結(jié)果基本一致。

2.4.3

模型的驗證。根據(jù)回歸模型優(yōu)選出的最佳工藝，在此條件下進(jìn)行驗證試驗，3次平行試驗的綜合評分為94.02± 0.02，此時發(fā)汗?jié)蔀a浸出物含量為（15.34±0.02）%，23乙酰澤瀉醇B含量為（0.06±0.02）mg/mL，24乙酰澤瀉醇A含量為 （0.02±0.01）mg/mL，與預(yù)測值吻合，表明該試驗所建立的數(shù)學(xué)模型準(zhǔn)確可靠，優(yōu)化出的一體化最佳工藝重現(xiàn)性好，表明該最佳工藝切實可行、可操作性強。

3 結(jié)論與討論

發(fā)汗時間、環(huán)境溫度和含水量的交互效應(yīng)對澤瀉發(fā)汗工藝效率影響均較為顯著。該試驗以環(huán)境溫度、發(fā)汗時間和含水量為考察因素，以浸出物、23乙酰澤瀉醇B和24乙酰澤瀉醇A含量加權(quán)所得到的綜合評分為指標(biāo)，通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗建立澤瀉發(fā)汗加工的最佳工藝為環(huán)境溫度45 ℃、發(fā)汗時間94 h、含水量10%。得到的最佳工藝數(shù)據(jù)對澤瀉產(chǎn)地加工中的發(fā)汗過程有重要指導(dǎo)意義，以此可規(guī)范澤瀉發(fā)汗加工方法，也可為建造產(chǎn)地發(fā)汗加工設(shè)施與加工設(shè)備提供參考，以提高澤瀉加工的產(chǎn)業(yè)化水平。

該試驗研究了影響發(fā)汗效果的主要關(guān)鍵因素。發(fā)汗過程受到溫度、水分、時間、堆積量等條件因素的影響 [7]，該研究選擇了溫度、水分和時間3個因素進(jìn)行探究，主要基于堆積量通過溫度、水分影響發(fā)汗效果，根據(jù)具體條件在有效控制溫度、水分情況下，選擇適宜的規(guī)程量。于凡等 [8]在探究不同發(fā)汗條件對丹參品質(zhì)影響的研究中采用了溫度和水分2個相同探究因素，也得到顯著結(jié)果，說明通過改變發(fā)汗條件提高中藥材品質(zhì)的方法具有普遍可行性。其他中藥材如杜仲等，產(chǎn)地加工中進(jìn)行發(fā)汗處理，也得到與該試驗研究相同的效果。

“發(fā)汗”是提高藥材產(chǎn)地加工質(zhì)量的一種有效方法，藥材發(fā)汗加工后多有外觀性狀和化學(xué)成分的變化 [3]。近年來關(guān)于“發(fā)汗”對藥材影響方面的文獻(xiàn)主要涉及化學(xué)成分和藥理作用2個方面 [9]，如厚樸經(jīng)發(fā)汗加工過程后，厚樸酚總量比未發(fā)汗前增加了7.94% [10]，續(xù)斷發(fā)汗后用于治療白血病的活性物質(zhì)川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量也有一定提升 [11]。該試驗研究也證實了通過發(fā)汗能夠提高澤瀉質(zhì)量。目前研究者們對發(fā)汗加工的研究方向多集中在觀察加工過程前后中藥材活性有效成分的含量變化，且多數(shù)研究也表明發(fā)汗過程對藥材化學(xué)成分含量有一定的影響，為以后對發(fā)汗更深入的研究提供了較好的試驗基礎(chǔ)，未來對發(fā)汗的研究應(yīng)轉(zhuǎn)向?qū)ζ溥^程中內(nèi)在作用機制的探究，從而為發(fā)汗加工法在市場中推廣和產(chǎn)地應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù) [12]。