基于分子對接技術(shù)的抗新霉素單鏈抗體制備和進化

王方雨 張運尚 胡曼 樊劍鳴

摘要 為了制備高靈敏度、高特異性的抗新霉素單鏈抗體，試驗采用從雜交瘤細胞中提取單鏈抗體基因，轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達系統(tǒng)進行表達。然后采用分子對接的方法研究抗新霉素單鏈抗體和新霉素分子的識別機制并進行虛擬突變，將關(guān)鍵結(jié)合位點的氨基酸殘基進行突變，在對突變體進行表達和純化后建立間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法。結(jié)果表明：氨基酸殘基Leu227為單鏈抗體與新霉素結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基，將其突變?yōu)锳sp，獲得突變體。IC 50為1.58 ng/mL，相比于親本單鏈抗體的26.23 ng/mL，突變體的敏感性提高了16.6倍。試驗成功制備了高靈敏度、高特異性的抗新霉素單鏈抗體，為動物源性食品中的抗生素殘留檢測提供了研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 單鏈抗體;氨基糖苷類抗生素;藥物殘留檢測;分子識別機制;間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法

中圖分類號 Q789? 文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）20-0103-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.20.028

Preparation and Evolution of Anti-Neomycin Single-chain Antibody Based on Molecular Docking Technology

WANG Fang-yu1，ZHANG Yun-shang 1，2，HU Man1 et al （1.Key Laboratory of Animal Immunology，Henan Academy of Agriculture Sciences，Zhengzhou，Henan? 450002;2.College of Public Health， Zhengzhou University，Zhengzhou，Henan 450001）

Abstract In order to prepare high-sensitivity and high-specificity anti-neomycin single-chain antibodies， the experiment used genes extracted from hybridoma cells and directly transferred to E.coli expression system for expression.Then， the molecular docking method was used to study the recognition mechanism of anti-neomycin single-chain antibody and neomycin molecule and virtual mutation was performed.The amino acid residues of the key binding site were mutated， and the indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay method was established after expression and purification of the mutant.The results showed that the amino acid residue Leu227 was the key amino acid residue for the binding of single-chain antibody to neomycin， and it was mutated to Asp to obtain a mutant.The IC 50 was 1.58 ng/mL， which was 16.6 times more sensitive than the parental single-chain antibody （26.23 ng/mL）.It showed that the test successfully prepared high-sensitivity and high-specificity anti-neomycin single-chain antibody，which provided a research basis for the detection of antibiotic residues in animal-derived foods.

Key words Single-chain antibody;Aminoglycosides;Drug residue detection;Molecular recognition mechanism;Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay

新霉素（neomycin， NEO）是一種氨基糖苷類抗生素（aminoglycosides， AGs），該類藥物因含有多個氨基和羥基基團，所以對革蘭氏陽性菌和陰性菌都有抗菌作用，同時還具有極性強、水溶性好，在堿性環(huán)境抗菌性強等諸多優(yōu)點 [1]。作為廣譜抗菌劑和促進動物生長發(fā)育的飼料添加劑 [2]，新霉素被廣泛應(yīng)用在畜牧業(yè)中。養(yǎng)殖人員不合理或不規(guī)范的使用可能會導(dǎo)致養(yǎng)殖動物體內(nèi)中殘留抗生素，并產(chǎn)生細菌耐藥性 [3]，當(dāng)體內(nèi)有藥物殘留的動物被加工為肉類上市時，人們食用后會對人體造成多種危害，主要包括腎毒性、耳毒性和神經(jīng)肌肉阻滯等 [4]。為了防止動物性食品中氨基糖苷類藥物殘留對公眾健康構(gòu)成威脅，歐盟、糧農(nóng)組織/世衛(wèi)組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會和中國制定了可食用食品中NEO的最高殘留限量 [5]。如在牛奶中新霉素的MRL為200 μg/kg，在雞肉組織中為100 μg/kg。

鑒于抗生素在環(huán)境和食物鏈中的廣泛傳播，其對生態(tài)環(huán)境和人類健康的不利影響受到廣泛關(guān)注。目前已有眾多方法對食物樣品進行檢測 [6-8]，如超高效液相色譜法、液相色 譜-質(zhì)譜法和免疫法。其中基于抗體與抗原特異性結(jié)合原理的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）被認為是檢測抗體最快速、簡便的方法 [9-11]，適用于對樣品的初步篩選。在以往的研究中，研究人員已經(jīng)開發(fā)了基于單克隆抗體（MAb）的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法（IC-ELISA） [12-13]。但傳統(tǒng)抗體單抗或多抗的制備均較為復(fù)雜，不僅浪費時間和精力，還有不可進化的弊端 [3]。有必要開發(fā)一種簡單、快速、高效的新型抗體。目前，單鏈抗體（ScFv）是最受關(guān)注的抗體之一。ScFv是通過將抗體的重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）通過接頭（Linker）連接而成的抗體。不僅可以通過分子對接技術(shù)改善其識別機制，還可以進行隨機誘變和定點誘變進行改造和進化 [14]。在這項研究中，為了獲得高靈敏度的抗NEO-ScFv，從能分泌抗NEO單克隆抗體的雜交瘤細胞中提取重鏈和輕鏈的基因，構(gòu)建ScFv基因，然后轉(zhuǎn)染到大腸桿菌BL21（DE3）中進行表達。通過分子對接方法研究其識別機制，定向誘變進化了ScFv。獲得靈敏度更高的ScFv突變體，并以此建立IC-ELISA檢測方法，以期為檢測動物性食品中新霉素殘留奠定了 基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 抗NEO單克隆抗體雜交瘤細胞由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室提供。

1.2 藥品

新霉素標(biāo)準(zhǔn)品、慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品、鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品和卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品均購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，藥物均為分析純或更高。

1.3 主要試劑

TRIzol總RNA提取試劑盒、PrimeScript RT-PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司;羊抗鼠酶標(biāo)二抗購自北京Solarbio公司;AEC酶底物試劑盒購自北京ZSGB-bio公司;PBST溶液由包含0.05%Tween-20的PBS配制;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），限制性內(nèi)切酶（Sfi Ⅰ和Not Ⅰ）和T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司（中國，大連）;EasyPure快速凝膠提取試劑盒，EasyPure質(zhì)粒MiniPrep試劑盒，表達載體Pet-32a感受態(tài)細胞Rosetta-gami（DE3），快速多位點誘變系統(tǒng)和Luria-Bertani培養(yǎng)基（液體和固體）購自TransGen生物公司（中國，北京）;DNA純化試劑盒和SDS-PAGE凝膠制備試劑盒來自北京ComWin生物技術(shù)有限公司（中國，北京）;蛋白胨、酵母提取物購自英國Oxoid公司;引物的合成和基因序列分析在Sangon生物公司（中國，上海）進行。

1.4 研究方法

1.4.1 重鏈、輕鏈基因的擴增與組裝。

使用TRIzol總RNA提取試劑盒從抗NEO雜交瘤細胞中提取總RNA。然后，以總RNA為模板使用PrimeScript RT-PCR試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用VH和VL引物擴增的全套ScFv基因，引物序列見表1。反應(yīng)條件如下：94 ℃ 預(yù)變性5 min;94 ℃持續(xù)45 s，58 ℃持續(xù)60 s，72 ℃持續(xù)45 s，共進行30個循環(huán);最后在72 ℃下延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用EasyPure快速凝膠提取試劑盒回收目的片段。將獲得的VH和VL片段分別與載體連接，進行基因序列分析。然后以編碼肽（Gly4Ser）3為接頭，將VH和VL基因通過重疊延伸PCR（SOE-PCR）拼接為完整的ScFv基因。反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s，68 ℃ 60 s，72 ℃ 45 s，共進行30個循環(huán);最終在72 ℃下延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳驗證，并對相關(guān)片段進行測序。

1.4.2 抗NEO單鏈抗體的測序、表達和純化。

利用Ncol Ⅰ和Not Ⅰ限制性酶消化靶基因和原核表達載體pET-32a，并通過T4 DNA連接酶進行連接。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（DE3）中，并放置在37 ℃含有100 μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細菌溶液的OD 600達0.6～0.8后，將1 mmol/L IPTG加入培養(yǎng)物中以誘導(dǎo)ScFv的表達，然后使培養(yǎng)物在37 ℃進一步生長16 h。收集上清液，并使用MWCO：8 000～14 000 Da透析袋在PEG/NaCl中將其濃縮至100倍。將收集的沉淀物分別用PBS重懸以獲得周質(zhì)裂解物，并通過超聲處理裂解以獲得全細胞裂解物。上清液、周質(zhì)裂解物和全細胞裂解物用于通過SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)的溶解度。最后，使用Beaver Bead TM His-tag蛋白純化磁珠純化抗NEO ScFv蛋白。

1.4.3 同源性建模和分子對接。

首先根據(jù)測序結(jié)果，在NCBI數(shù)據(jù)庫（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索了抗NEO單鏈抗體模型的可能模板序列，并在Blast進行了序列比較，選擇模板與抗NEO單鏈抗體模型具有高度一致性。具有高得分和低e值的序列被用作抗NEO單鏈抗體模型構(gòu)建的模板序列。然后，利用SWISS MODEL在線服務(wù)器建立抗NEO ScFv的模型。為了驗證同源性建模結(jié)果的可靠性并確定最佳模型結(jié)構(gòu)，使用Procheck、Verify3D和ERRAT程序評估了構(gòu)建的抗NEO單鏈抗體同源性模型的一致性，并選擇了最佳受體模型用于進一步的分子對接研究。使用MOE 2015.10進行分子對接，分析NEO與抗NEO-ScFv的結(jié)合模式并找到關(guān)鍵殘基。在Dock模塊中，通過誘導(dǎo)擬合和在Amber10：EHT力場下，將NEO?？吭诳筃EO-ScFv的活性位點中。使用默認參數(shù)后具有30個對接構(gòu)象的對接配體用于進一步分析。

1.4.4 ScFv抗體的定向誘變。

基于抗NEO-ScFv與NEO的結(jié)合模式研究分析，通過虛擬突變單鏈抗體與NEO結(jié)合關(guān)鍵殘基，可以提高NEO與單鏈抗體的結(jié)合親和力。利用MOE 2015.10軟件進行單鏈抗體氨基酸殘基的虛擬突變，關(guān)鍵結(jié)合氨基酸殘基Leu227被Asp代替來產(chǎn)生抗NEO-ScFv的突變體。然后，優(yōu)化了虛擬突變ScFv突變模型的結(jié)構(gòu)，獲得了穩(wěn)定的ScFv突變模型。隨后，通過誘導(dǎo)擬合的方法對具有ScFv突變的NEO進行對接研究，并使用默認參數(shù)獲得30個構(gòu)象。在試驗過程中，將表達載體ScFv-pCANTAB5E中的ScFv基因進行突變，以利用快速多位點誘變系統(tǒng)生產(chǎn)突變的表達載體。然后，利用“1.4.2”中的表達方法對突變體進行表達和純化。最后通過SDS-Page和IC-ELISA鑒定并分析ScFv突變體。

1.4.5 建立間接競爭ELISA法?；诩兓蟮目筃EO-ScFv建立IC-ELISA檢測方法。簡而言之，在96孔板上每孔加入包被原NEO-OVA溶液100 μL，放置在4 ℃下過夜;然后用PBST溶液洗滌，在37 ℃下用每孔300 μL的5% PBSM（PBS中5%脫脂奶粉）封閉1 h。用CBS將NEO標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度（200、100、80、50、20、10、5、2、1和0.1 ng/mL），分別與抗NEO-ScFv進行混合后加入孔中（100 μL/孔）。放置在37 ℃下孵育1 h，然后用PBST洗滌。將與辣根過氧化物酶（100 μL /孔;在PBS中稀釋1/2 000）綴合的抗生物素蛋白加入孔中，并在37 ℃下孵育30 min。然后用PBST洗滌5次，并添加100 μL /孔的TMB底物，在黑暗中于室溫孵育 10 min 后，加入濃度為2 mol/L的濃硫酸（50 μL /孔）終止顯色反應(yīng)。最后，使用自動酶標(biāo)儀（Thermo，USA）在450 nm處測量吸光度。以IC 50，測定動態(tài)范圍和檢測下限（LOD）作為評估 IC-ELISA的標(biāo)準(zhǔn)。使用公式（P-S-N）/（P-N）×100%計算抗NEO-ScFv的IC 10、IC 20，IC 50和IC 80的抑制率，其中P是陽性樣品的OD 450（50 μL抗NEO ScFv與50 μL CBS混合），S為標(biāo)準(zhǔn)品的OD 450（50 μL ScFv與50 μL NEO標(biāo)準(zhǔn)品的連續(xù)濃度混合），N為陰性對照的OD 450（100 μL CBS）。

1.4.6 交叉反應(yīng)率分析。

配制不同濃度的慶大霉素、卡那霉素和鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（200.0、100.0、80.0、50.0、20.0、10.0、5.0、2.0、1.0和 0.1 ng/mL）。用確定的最適抗原抗體濃度進行IC-ELISA試驗，步驟同“1.4.5”（在加入抗新霉素ScFv時，先將ScFv分別與不同濃度的慶大霉素、卡那霉素和鏈霉素進行室溫孵育 30 min），每個濃度重復(fù)3次。然后用SPSS軟件計算IC 50，最后根據(jù)公式CR=IC 50（新霉素）/IC 50（競爭物）×100%計算交叉反應(yīng)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 ScFv基因的構(gòu)建 VH、VL和ScFv基因的擴增結(jié)果如圖1所示，分別長約350、330和780 bp。VH基因長度略大于VL基因，與預(yù)期結(jié)果相似，經(jīng)過NCBI BLAST對比可知為抗體可變區(qū)基因，由此可知，成功擴增和組裝ScFv基因。用Sfi Ⅰ和Not Ⅰ消化ScFv基因和pCANTAB5E載體，用T4 DNA連接酶連接產(chǎn)物后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TG1細胞中進行涂板培養(yǎng)。

2.2 單鏈抗體的表達和純化

對得到的重組質(zhì)粒ScFv進行測序和表達，在37 ℃下加入1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達，并用Western Blot檢測（圖2），結(jié)果表明ScFv抗體大小為 47 kD，與預(yù)測一致，說明成功表達抗NEO-ScFv。然后使用Beaver Beads TM His-tag蛋白純化磁珠進行純化（圖3），說明ScFv蛋白大部分存在上清液中，分別用20、100、200、 250 mmol/L咪唑洗滌后，發(fā)現(xiàn)用20 mmol/L咪唑洗脫時可以將大部分單鏈抗體洗脫，其上清液即為純化的單鏈抗體蛋白。最后將純化后的蛋白在-20 ℃下保存。

2.3 同源建模和分子對接

通過NCBI Blast序列比對，發(fā)現(xiàn)抗NEO-ScFv序列與蛋白質(zhì)PDB ID：5i4f.1.A有高度序列一致性（67.07%），可作為模板進行同源建模。隨后，利用SWISS-MODEL同源性建模軟件建立單鏈抗體模型。然后用Procheck、Verify-3D和Errat對模型合理性進行評價。Ramachandran圖結(jié)果顯示模型中93.3%的氨基酸殘基位于核心區(qū)域，3.9%位于允許區(qū)域，僅有1.7%位于不合理區(qū)域內(nèi)。說明該模型中98.3%蛋白質(zhì)殘基在合理范圍內(nèi)，符合立體化學(xué)能定律。Verify-3D的結(jié)果表明，ScFv模型中94.3%氨基酸殘基的平均3D-1D得分大于0.2，因此該模型通過了Verify-3D測試。Errat結(jié)果表明，總體質(zhì)量因子為89.579。所以，構(gòu)建的抗NEO-ScFv模型具有很高的可靠性，可用于與NEO抗原的分子對接。

Leu229組成。NEO可以同時與殘基Glu51、Glu36、Glu100、Gly224、Cys167、Asn102和Asp183形成相對穩(wěn)定的氫鍵網(wǎng)絡(luò)體系。此外，（2S，3S，4R，4R，5R，6R）-吡喃環(huán)上的5-氨基基團還可以與殘基Tyr165形成π-π堆積作用。然而，發(fā)現(xiàn)疏水性的殘基Leu227靠近NEO分子中的（2R，3R，4R，4R，5S，6R）-吡喃環(huán)上的親水性基團6-氨甲基和5-羥基。初步推測，如果將殘基Leu227轉(zhuǎn)化為親水氨基酸，它將促進NEO與ScFv的結(jié)合。有趣的是，當(dāng)殘基Leu227突變?yōu)锳sp227時，總結(jié)合能從-21.306降至-32.776 kJ/mol。此時，6-氨甲基基團可以與Asp227形成氫鍵作用。（2R，3R，4R，4R，5S，6R）-吡喃環(huán)上，質(zhì)子化的3-氨基基團可以與Trp34形成Pi-H相互作用。這些結(jié)果表明，突變后的單鏈抗體與NEO之間的結(jié)合更加穩(wěn)定。因此，在該研究中Leu227被Asp取代，用于制備ScFv突變體。

2.4 建立IC-ELISA檢測結(jié)果 用IC-ELISA方法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示，相關(guān)線性回歸方程為y=-0.186 5x+ 0.558 0（R2=0.989 9）。IC 50為1.58 ng/mL，最低檢測線（IC 10）為 19.84～285.60 ng/mL，相比于未突變前的親代ScFv的IC 50： 26.23 ng/mL，靈敏度提高了16.6倍。說明經(jīng)過分子對接和定向進化，獲得了靈敏度更高的抗新霉素的單鏈抗體，并建立了間接競爭ELISA檢測方法，為食品中的新霉素殘留提供了靈敏度更高的檢測方法。

2.5 交叉特異性分析

建立的IC-ELISA檢測方法的特異性取決于抗NEO-ScFv的交叉反應(yīng)性，試驗選取與新霉素結(jié)構(gòu)類似的慶大霉素、卡那霉素和鏈霉素為競爭物，用已建立的新霉素IC-ELISA檢測方法檢測競爭物，其交叉反應(yīng)性見表2，結(jié)果表明建立的新霉素IC-ELISA檢測方法具有良好的特 異性。

3 討論與結(jié)論

目前，針對動物源性食品抗生素殘留的檢測方法主要為超高效液相色譜分析法，但該方法所需儀器昂貴并且操作復(fù)雜，浪費時間和人力，適合對可疑樣品進行確證檢測;而免疫分析法因為操作簡便、節(jié)約時間而適合對大批量樣品進行初步篩查。免疫法中需要利用的抗體是制約發(fā)展的瓶頸之一，隨著基因工程技術(shù)的不斷進步，單鏈抗體的出現(xiàn)解決了這一問題。單鏈抗體是僅具有一條鏈的合成抗體，對抗原具有特定的親和力。與常規(guī)的單抗和多抗相比，單鏈抗體可以在分子水平上進行研究，并且可以通過基因突變進行改造以提高其抗原結(jié)合親和力 [15]。

該項研究中，在已有能分泌抗新霉素單克隆抗體的雜交瘤細胞中提取了總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用cDNA作為模板擴增VH和VL編碼序列，并添加互補的接頭序列。通過SOE-PCR拼接整個ScFv基因，然后將基因轉(zhuǎn)入大

腸桿菌表達系統(tǒng)進行表達，得到抗NEO初代的單鏈抗體。為進一步提高其靈敏度，通過同源建模和分子對接等方式，分析兩者結(jié)合的主要作用力和抗體與小分子NEO結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基，并進行定向改造，從而得到親和力更高、靈敏度更強的抗NEO-ScFv突變體。以突變體為基礎(chǔ)，建立間接競爭ELISA檢測方法，其IC 50達1.58 ng/mL，與初代相比靈敏度提高了16.6倍。該研究為動物性食品在上市前檢測新霉素殘留提供了靈敏度更高、特異性更強的檢測方法。

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