南極紅藻Iridaea cordata和Curdiea racovitzae轉(zhuǎn)錄組分析及其極端光環(huán)境適應(yīng)相關(guān)基因的挖掘

劉晨臨，王秀良，林學(xué)政

( 1. 自然資源部第一海洋研究所，山東 青島 266061；2. 中國科學(xué)院海洋研究所，山東 青島 266071；3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋生物學(xué)與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237)

1 引言

生活在南極的大型海藻約有120～130種，其中有三分之一的是南極特有的[1]。在西南極半島，大型海藻廣泛生長在潮間帶或淺岸海底的礁石上。喬治王島（King George Island）的梅爾維爾角（Melville Cape），90%以上的巖石底層被海藻覆蓋。而在將軍灣（Admiralty Bay），夏季大型海藻帶幾乎環(huán)繞著整個(gè)海灣沿岸，覆蓋了約37%海灣面積。褐藻和紅藻在潮下帶巖石基底上呈垂直分布，最深可達(dá)100 m水深處[2–3]。大型海藻是近岸海洋系統(tǒng)重要的初級(jí)生產(chǎn)者，為其他海洋生物提供庇護(hù)和食物來源[4]。除生態(tài)學(xué)意義，許多大型海藻也具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，目前對(duì)南大洋海藻資源的開發(fā)利用日益成為熱點(diǎn)[5]。產(chǎn)膠紅藻Iridaea cordata（Turner）Bory和Curdiea racovitzaeHariot是南極和亞南極海岸潮間帶和潮下帶的常見物種[6]。I. cordata產(chǎn)卡拉膠[7]，其硫酸多糖具有抗癌活性[8]，C. racovitzae則是產(chǎn)瓊膠海藻[9]。

許多來自南極的物種只在低于5℃的溫度條件下生長和繁殖。低溫需求決定了它們?cè)谀蠘O的北部分布邊界。I. cordata的最適生長溫度在0～5℃，生存溫度的上限為11～16℃[10]。除冰凍和低溫外，海藻的生長發(fā)育也被南極地區(qū)多種極端的光環(huán)境影響。夏季，潮間帶海藻暴露在強(qiáng)烈的紫外線輻射下，需要有效的紫外線傷害的防御和修復(fù)能力[11–12]。在I. cordata中發(fā)現(xiàn)了能夠吸收紫外線，降低紫外輻射傷害的類菌胞素氨基酸[13]。而冬季由于極夜和海冰覆蓋，黑暗時(shí)間較長，海藻生長必須適應(yīng)弱光環(huán)境，降低其光合作用和生長對(duì)光照的需求量[14–15]。在南極漫長黑暗的冬季，因?yàn)榫哂休^高的光合效率和極低的光補(bǔ)償點(diǎn)和光飽和點(diǎn)，I. cordata仍然能夠持續(xù)生長[10]。

目前，對(duì)南極大型海藻的研究主要集中在生態(tài)分布、生物量和生物多樣性[2–3,6,15–16]、功能活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)[17–18]，以 及 光 合 生 理 活 性[10–12,19–20]等 方 面。迄 今 為止，除了南極綠藻Prasiola crispa的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[21]，未見其他南極海藻功能基因或轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的報(bào)道。南極藻類因其特有的耐受極端環(huán)境的能力，成為發(fā)現(xiàn)新基因和新代謝機(jī)制的理想材料。而轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析是發(fā)現(xiàn)這些基因資源最經(jīng)濟(jì)、有效的手段。我們從兩種南極紅藻的轉(zhuǎn)錄組序列中，挖掘了一些獨(dú)特的可能與其南極極端光環(huán)境，包括弱光和強(qiáng)紫外線輻射等適應(yīng)相關(guān)基因，為后續(xù)開展南極紅藻極端環(huán)境適應(yīng)機(jī)制研究提供了依據(jù)。同時(shí)從南極紅藻中發(fā)現(xiàn)的光修復(fù)酶基因，在化妝品領(lǐng)域也有開發(fā)利用的前景。

2 材料與方法

2.1 海藻樣品

2018年2 月，在第34次中國南極科學(xué)考察中，依托“向陽紅01”號(hào)科學(xué)考察船，在西南極南設(shè)得蘭群島喬治王島的長城站附近（62.216°S，58.960°W）潮間帶采集紅藻樣品。采樣時(shí)陰天有小雨，氣溫約2℃。用無菌海水清洗藻體后，置于船上?150℃冰箱保存。保持冷凍狀態(tài)至回國后，在實(shí)驗(yàn)室提取藻樣的總RNA。

2.2 總RNA提取和cDNA文庫的構(gòu)建

首先將冷凍的海藻樣品浸入液氮中，用冷卻的研缽研磨成細(xì)粉。使用天根植物RNAprep試劑盒提取總RNA。采用微量核酸定量?jī)x檢測(cè)RNA的質(zhì)量和濃度。測(cè)序文庫使用TruSeq RNA樣品制備試劑盒（Illumina, USA）構(gòu)建。用Illumina PCR引物進(jìn)行15個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，選擇性富集兩端連接接頭分子的DNA片段，并用AMPure XP系統(tǒng)純化（Beckman Coulter,USA）。采用安捷倫（Agilent）生物分析儀2100系統(tǒng)中的高靈敏度DNA分析技術(shù)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量。Illumina Hiseq測(cè)序委托上海派森諾生物技術(shù)有限公司完成。

2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝和功能注釋

在數(shù)據(jù)組裝前先過濾原始數(shù)據(jù)。使用Cutadapt（v1.15）軟件刪除引物或接頭序列。過濾掉超過10%堿基質(zhì)量低于Q20的或未知核苷酸（Ns）堿基超過5%的序列。使用Trinity （v2.5.1）軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行拼接[22]。選擇每個(gè)基因最長的轉(zhuǎn)錄本作為該基因的代表性序列稱為非冗余基因。BlastX同源搜索NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫NR （http://www.ncbi.nlm.nih.gov），E-value＜10–5。利用真核生物直系同源蛋白質(zhì)聚類EggNOG（Evolutionary Genealogy of Genes: Non-supervised Orthologous Groups，http://eggnog.embl.de/version_3.0/）對(duì)非冗余基因進(jìn)行功能分類注釋[23]。利用京都基因與基因組百科全書KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.kegg.jp/）進(jìn)行代謝通路注釋，獲得物種內(nèi)分子間相互作用和反應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)。KEGG代謝通路注釋以雙向最佳匹配（BBH）的方法，采用KAAS軟件完成[24]。使用PrimerPro（http://webdocs.cs.ualberta.ca/～yifeng/PrimerPro/）的微衛(wèi)星搜索模塊（MISA）篩選簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSRs）。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建用MEGA X軟件完成[25]，將選擇的序列經(jīng)MUSCLE比對(duì)后，采用默認(rèn)參數(shù)，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)樹。經(jīng)過1000次自展值的檢驗(yàn)，顯示一致性的系統(tǒng)樹。

3 結(jié)果與討論

3.1 南極紅藻Iridaea cordata和Curdiea racovitzae轉(zhuǎn)錄組組裝和注釋

南極紅藻I. cordata和C. racovitzae的形態(tài)如圖1所示。紅藻的鑒定采用克隆的18S rRNA基因與Gen-Bank已知序列進(jìn)行比對(duì)，相似性為100%。

每種紅藻的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序量約為6 G，I. cordata和C. racovitzae的轉(zhuǎn)錄組序列分別拼接成了14055條和12006條非冗余基因（表1）。非冗余基因的平均長度分別為1473 bp和1448 bp。I. cordata的鳥嘌呤和胞嘧啶（GC）含量約為53.82%，C. racovitzae的GC含量約為47.28%。GC含量在一定程度上反映了基因組的熱穩(wěn)定性。角叉菜Chondrus crispus的GC含量約為55.6%[26]，而龍須菜Gracilariopsis lemaneiformisGC含量為48.13%[27]。南極紅藻的GC含量與常溫紅藻的GC含量差別不大。

I. cordata和C. racovitzae轉(zhuǎn)錄組序列在各個(gè)數(shù)據(jù)庫的注釋情況見表2。在NR數(shù)據(jù)庫，I. cordata和C.racovitzae分別有4788條（34.07%）和4468條（37.21%）非冗余基因得到注釋。在Swissprot數(shù)量庫中I. cordata和C. racovitzae則分別有4864（34.61%）和4938（41.13%）條非冗余基因得到注釋。紫菜Pyropia tenera轉(zhuǎn)錄組序列在UniProt數(shù)據(jù)庫（不含其他紫菜屬物種的基因組和轉(zhuǎn)錄組序列）中也僅有33.6%的重疊群匹配到同源序列[28]。這說明了紅藻基因與公共數(shù)據(jù)庫中已知基因序列間的同源性較低，繼續(xù)豐富不同種類紅藻基因數(shù)據(jù)資源是很有必要的[29]。

圖1 南極紅藻Iridaea cordata （a）和Curdiea racovitzae （b）的形態(tài)Fig. 1 The morphology of Iridaea cordata (a) and Curdiea racovitzae (b)

I. cordata和C. racovitzae中被EggNOG注釋的非冗余基因分別有4523和4238條（圖2）。除了一般功能預(yù)測(cè)和功能未知的分類，翻譯后修飾、蛋白反轉(zhuǎn)和分子伴侶類別的非冗余基因（579，581）最多，其次依次是翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和起源（485，485）、信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制（389，321）、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（301，280）、能量的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換（259，279）、RNA加工和修飾（237，221）、復(fù)制、重組和修復(fù)（209，176）、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移、分泌和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)（209，220）、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（201，209）以及轉(zhuǎn)錄（198，193）等分類。

3.2 南極紅藻轉(zhuǎn)錄組序列與常溫近緣紅藻基因組序列的比較

表1 南極紅藻Iridaea cordata和Curdiea racovitzae轉(zhuǎn)錄本和非冗余基因Table 1 The contigs and unigenes of Iridaea cordata and Curdiea racovitzae

表2 Iridaea cordata和Curdiea racovitzae轉(zhuǎn)錄組序列在各個(gè)數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果Table 2 The annotation results of Iridaea cordata and Curdiea racovitzae transcriptome

在已完成全基因組測(cè)序的紅藻中，角叉菜與I. cordata都屬于杉菜目，親緣關(guān)系最近。龍須菜與C.racovitzae同屬于江蘺目，有較近的親緣關(guān)系。我們將所測(cè)的兩種南極紅藻的轉(zhuǎn)錄組序列分別與角叉菜（基因組GenBank序列收錄號(hào)：PRJEA78309、PRJNA 193762）和龍須菜 （PRJNA361418） 的基因組的蛋白編碼序列用本地BlastX（E-value＜10?5）進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)有5955條I. cordata的非冗余基因與4059條角叉菜的序列匹配。C. racovitzae的4964條非冗余基因匹配到了3596條龍須菜基因序列（圖3），但是兩兩物種間，互相不匹配的序列占有更大比例，說明同目的紅藻間遺傳差異較大。

圖2 Iridaea cordata和Curdiea racovitzae轉(zhuǎn)錄組序列的EggNOG功能分類Fig. 2 EggNOG function classification of Iridaea cordata and Curdiea racovitzae

3.3 捕光復(fù)合物基因家族

在光系統(tǒng)中，捕光復(fù)合物L(fēng)HC (Light-Harvesting Complex) 負(fù)責(zé)捕獲光能并將能量轉(zhuǎn)移到反應(yīng)中心。除了吸收光，這些蛋白質(zhì)還參與了光保護(hù)反應(yīng)，以清除光合作用過程中產(chǎn)生的活性氧[30]。我們從紅藻角叉菜、龍須菜和耐受酸熱環(huán)境的單細(xì)胞紅藻Galdieria sulphuraria(PRJNA13023) 的基因組序列，以及兩種南極紅藻轉(zhuǎn)錄組序列中，通過BlastP比對(duì)、KEGG注釋分析和Pfam注釋查找有CB (Chloro a/b-bind) 結(jié)構(gòu)域的序列[31]，篩選了假定的LHC家族基因，利用這些基因編碼的蛋白序列構(gòu)建了系統(tǒng)樹（圖4）。之前的研究認(rèn)為紅藻中僅有光系統(tǒng)I（PSI）相關(guān)的，與葉綠素a和類胡蘿卜素結(jié)合的LHC天線蛋白，稱為LHCR[32–33]。LHCR的數(shù)目在不同紅藻間存在差異，蛋白分離純化的結(jié)果表明紫球藻有6種不同的LHCR蛋白，G. sulphuraria有5種，而Cyanidioschyzon merolae只有3種[33]。

從角叉菜、龍須菜和G. sulphuraria的基因組序列中各找到了5、13和10條Lhc序列。角叉菜的5條Lhcr基因均編碼紅藻型LHC蛋白，龍須菜有7條Lhcr基因，6條其他類型的Lhc基因。G. sulphuraria中有9條Lhcr基因和1條其他類型的Lhc基因。從I. cordata和C. racovitzae轉(zhuǎn)錄組中分別找到了8條和5條Lhc基因。分別包括4條Lhcr和1條Lhcf基因。Lhcf編碼巖藻黃質(zhì)和Chla/c結(jié)合蛋白，屬于PSI天線復(fù)合體。LHCF是硅藻和褐藻中的主要天線蛋白，但還未見在紅藻中的報(bào)道[34–35]。此外，I. cordata轉(zhuǎn)錄組中還包含多條與綠藻LHC蛋白同源的序列，參照萊茵衣藻LHC的分類，分別為Lhca2，Lhca6和Lhcb基因（圖5）。在萊茵衣藻中，LHCa2和LHCa6屬于PSI，而LHCb屬于PSII。

目前關(guān)于LHC蛋白的進(jìn)化還缺少切實(shí)的證據(jù)，一種觀點(diǎn)認(rèn)為，紅藻、綠藻和高等植物L(fēng)hc基因家族是共同起源，獨(dú)立進(jìn)化的[32]。在進(jìn)化過程中，由于藻膽體的丟失，有些Lhca(LhcI) 的基因功能進(jìn)一步分化，成為PSII的天線蛋白[33]。綠藻中編碼Chla/b-和Chla/c結(jié)合蛋白的基因在LHCI / LHCII分化之前就已經(jīng)彼此分離[36]。LHCb是植物生長和光保護(hù)反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白。目前對(duì)PSII中LHC蛋白的研究主要在高等植物和綠藻中，而其他物種中則少見報(bào)道[36]。對(duì)于南極紅藻I. cordata特有的Lhc基因的蛋白產(chǎn)物還需要蛋白分離純化等生物化學(xué)的方法進(jìn)行驗(yàn)證。但是Lhc基因家族的擴(kuò)張能夠增強(qiáng)I. cordata在光限制環(huán)境中的光吸收和能量轉(zhuǎn)移能力，可能是適應(yīng)南極冬季弱光環(huán)境生存的關(guān)鍵。

圖3 角叉菜Chondrus crispus與Iridaea cordata，龍須菜Gracilariopsis chorda與Curdiea racovitzae匹配基因數(shù)目的韋恩圖Fig. 3 Diagram of the matching gene numbers between Chondrus crispus and Iridaea cordata, Gracilariopsis chorda and Curdiea racovitzae

3.4 光裂解酶基因家族

環(huán)境非生物脅迫，如干旱或紫外線，可誘導(dǎo)藻類DNA損傷。目前發(fā)現(xiàn)的兩種光裂解酶，環(huán)丁烷嘧啶二聚體（CPD）光裂解酶和6?4光裂解酶，可以特異性地修復(fù)不同類型的UV誘導(dǎo)的DNA損傷，CPD和6?4嘧啶酮光產(chǎn)物 (6?4 PP)[37]。光裂解酶屬于紫外線/藍(lán)光激活蛋白家族—光裂解酶/隱花色素（CPF）家族，這個(gè)超家族包括光裂解酶、隱花色素（Cry）和Cry-DASH。這三類成員有很高的同源性，都含有能結(jié)合兩個(gè)生色團(tuán)的PHR（Photolyase Homology Region）功能區(qū)[38]，但是Cry-DASH和隱花色素的PHR無光裂解酶活性[39]。

從紅藻角叉菜、龍須菜和G. sulphuraria的基因組序列，以及南極紅藻的轉(zhuǎn)錄組序列中通過Pfam注釋，選取了所有含PHR功能區(qū)的序列，作為假定的光裂解酶/隱花色素CPF家族蛋白序列，同時(shí)參考Fortunato等[40]構(gòu)建的CPF超級(jí)家族系統(tǒng)樹，選擇其中的綠藻、硅藻、褐藻和擬南芥的序列，與我們篩選的紅藻CPF家族蛋白序列一起構(gòu)建了的系統(tǒng)進(jìn)化樹，并對(duì)進(jìn)化樹的分支進(jìn)行了功能劃分（圖6）。I. cordata的轉(zhuǎn)錄組序列中有4條CPF家族基因，分別屬于6?4光裂解酶，光裂解酶CPD I和CPD II家族。C. racovitzae轉(zhuǎn)錄組序列中有6條CPF家族基因，分別編碼隱花色素Cry、Cry-DASH、Cry-DASH II和光裂解酶CPD II。6?4光裂解酶分支的物種，包括紅藻、硅藻、褐藻、綠藻和高等植物。Fortunato等[40]未在角叉菜中發(fā)現(xiàn)6?4光裂解酶基因，認(rèn)為只有單細(xì)胞紅藻中有6?4光裂解酶，但是我們?cè)诔鼵. racovitzae之外的所有紅藻中，都找到了6?4光裂解酶同源序列，說明其在紅藻中是廣泛存在的。光裂解酶CPD，分為2個(gè)分支，CPD II廣泛分布于各類生物物種[40]，與我們的結(jié)果一致。而CPD I則主要存在于細(xì)菌、古細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌和真菌中[37,40]。Fortunato等[40]未在灰色藻、甲藻和紅藻角叉菜中找到CPD I家族基因，但是在我們構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中，在紅藻I. cordata，龍須菜以及硅藻中都找到了CPD I的同源序列。我們認(rèn)為在少數(shù)種類的硅藻和紅藻中存在的CPD I基因可能是通過水平基因轉(zhuǎn)移從原核生物中獲得的，用于修復(fù)其因生活環(huán)境嚴(yán)酷而造成的DNA損傷。在I. cordata轉(zhuǎn)錄組中未找到紅藻中普遍存在的Cry和Cry-DASH序列，同時(shí)在C. racovitzae轉(zhuǎn)錄組中未發(fā)現(xiàn)6?4光裂解酶，可能是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序未能完全覆蓋基因組中所有編碼序列導(dǎo)致的。

3.5 簡(jiǎn)單重復(fù)序列SSR

從轉(zhuǎn)錄組序列中篩選的SSR序列，因?yàn)槠湄S富性且與編碼基因緊密相關(guān)，成為在物種適應(yīng)性、生物地理分布和進(jìn)化研究中的重要分子標(biāo)記。利用MISA軟件分別從I. cordata的3014條非冗余基因中鑒定出5560個(gè)SSR位點(diǎn)，從C. racovitzae的1636條非冗余基因中鑒定出2473個(gè)SSR位點(diǎn)。其中單核苷酸重復(fù)最多。紫菜P. seriata中三核苷酸的數(shù)目最多[29]。SSR的頻率和分布被認(rèn)為取決于各種因素，如數(shù)據(jù)集的大小、工具和使用的標(biāo)準(zhǔn)[41]。

圖4 捕光復(fù)合物的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of the light harvesting complex superfamily

圖5 Iridaea cordata的Lhca2、Lhca6和Lhcb基因編碼的蛋白序列與綠藻LHC序列的比較Fig. 5 Alignment of Lhca2, Lhca6 and Lhcb of Iridaea cordata with homologous LHCs in green algae

南極歷史上的冰川期對(duì)潮間帶物種造成了毀滅性的破壞，但是南極大陸架邊緣仍有零散的冰川未影響到的區(qū)域，成為潮間帶海藻的庇護(hù)所。在過去的500萬年間，南極地區(qū)至少發(fā)生了38個(gè)冰期?間冰期循環(huán)[42]。由此可能會(huì)導(dǎo)致南極潮間帶生物生殖隔離和遺傳分化的產(chǎn)生[43]。利用單一基因的DNA條形碼序列研究冰川期棲息地減少對(duì)南極半島和南設(shè)得蘭群島常見的6種大型紅藻遺傳多樣性的影響，由于得到的遺傳多樣性水平極低，無法有效劃分海藻的種群，難以確定南極海藻起源的冰川庇護(hù)所的位置[6]。采用SSR標(biāo)記獲得海藻種內(nèi)的更精細(xì)的遺傳學(xué)分化，則有希望解決這一問題。同時(shí)SSR標(biāo)記還可以應(yīng)用于研究南極的地質(zhì)演變以及預(yù)測(cè)氣候變化對(duì)南極生態(tài)系統(tǒng)的影響。

4 結(jié)論

南極紅藻是南極地區(qū)重要的生物資源，作為極端環(huán)境生物，對(duì)其轉(zhuǎn)錄組序列的研究有助于新基因和代謝途徑的發(fā)現(xiàn)。由于實(shí)驗(yàn)材料獲取和運(yùn)輸保藏的困難，很難獲取新鮮的材料提取RNA用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，這可能是目前南極大型海藻轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究較少的原因。我們依托“向陽紅01”號(hào)的船載超低溫冰箱，保證了從樣品采集到實(shí)驗(yàn)室RNA提取的過程中，材料保存完好。提取到了符合建庫要求的RNA，順利完成了兩種產(chǎn)膠紅藻的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作。通過分析轉(zhuǎn)錄組序列，我們發(fā)現(xiàn)了一些可能與南極紅藻光限制和紫外線輻射等極端光環(huán)境適應(yīng)相關(guān)的特有基因，南極紅藻更加多樣化的Lhc基因可能是增強(qiáng)I. cordata在光限制環(huán)境中的光吸收和能量轉(zhuǎn)移能力，適應(yīng)南極冬季弱光環(huán)境生存的關(guān)鍵。而光裂解酶基因與其適應(yīng)極地的強(qiáng)紫外線輻射密切相關(guān)。這些基因的功能仍有待于進(jìn)一步的驗(yàn)證。通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的SSR標(biāo)記也為南極紅藻的適應(yīng)性和遺傳多樣性的研究開展奠定了基礎(chǔ)。

圖6 光裂解酶/隱花色素超家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 6 Phylogenetic tree of the cryptochrome/photolyase family