電壓調(diào)制型高靈敏電化學(xué)發(fā)光分析

張晶晶，金 融，方丹君，江德臣

（1.南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,南京211166；2.南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,生命分析化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京210023）

電化學(xué)發(fā)光（ECL）是化學(xué)分子經(jīng)歷電化學(xué)反應(yīng)過(guò)程而產(chǎn)生的一種光輻射現(xiàn)象，是電化學(xué)方法和化學(xué)發(fā)光方法相結(jié)合的產(chǎn)物.由于無(wú)需額外的激發(fā)光源，從而有效避免了光散射對(duì)于檢測(cè)信號(hào)的干擾，因此ECL分析具有低背景和高檢測(cè)靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，已成為一種強(qiáng)大的分析技術(shù)，廣泛應(yīng)用于生物傳感器［1，2］、有機(jī)發(fā)光二極管［3］、食品［4，5］和藥物分析［6，7］等領(lǐng)域. 然而，ECL探針的發(fā)光效率較低，較難實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度分析物的檢測(cè).為了增強(qiáng)ECL信號(hào)、提高檢測(cè)靈敏度，基于各種信號(hào)放大策略的ECL分析方法不斷發(fā)展起來(lái).如，通過(guò)引入功能納米材料來(lái)提高信號(hào)分子的負(fù)載量或者促進(jìn)發(fā)光分子的電子傳遞速率，以實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大［8～10］；引入酶分子，通過(guò)酶催化反應(yīng)產(chǎn)生對(duì)發(fā)光分子具有增敏作用的物質(zhì)以增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度［11～13］；設(shè)計(jì)各種類(lèi)型的傳感模型來(lái)提高檢測(cè)靈敏度［14～16］. 鑒于ECL反應(yīng)受電極界面特征及電壓模式共同控制，若能發(fā)展新型電壓模式以增強(qiáng)ECL信號(hào)強(qiáng)度，則可建立一種通用性高的增強(qiáng)型ECL檢測(cè)方法.

Scheme 1 Schematic voltage modulated ECL mecha?nism for L012?hydrogen peroxide system

ECL方法通常依靠直流電壓來(lái)激發(fā)電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生光信號(hào).以經(jīng)典的ECL體系—魯米諾-過(guò)氧化氫為例，當(dāng)對(duì)檢測(cè)體系施加一定的電壓后，魯米諾和過(guò)氧化氫分子在電極表面發(fā)生電化學(xué)氧化反應(yīng)［17，18］，形成偶氮化合物、超氧基陰離子或過(guò)氧化氫陰離子，隨后相互反應(yīng)生成激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸離子，激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)會(huì)產(chǎn)生光輻射.這種快速的電化學(xué)反應(yīng)使電極表面液層內(nèi)魯米諾和過(guò)氧化氫分子的濃度迅速降低，產(chǎn)生濃差極化，不利于ECL過(guò)程的發(fā)生，進(jìn)而造成ECL強(qiáng)度下降.為了有效克服濃差極化對(duì)于ECL發(fā)光效率的影響，本文嘗試建立基于電壓調(diào)制的新型電壓驅(qū)動(dòng)模式，以提高ECL強(qiáng)度及檢測(cè)的靈敏度.如Scheme 1所示，采用的電壓調(diào)制模式是在原有恒定電壓基礎(chǔ)上，增加一個(gè)周期性的小幅度三角波電壓.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與恒定電壓激發(fā)的ECL信號(hào)相比，這種新型電壓 調(diào)制模式能夠?qū)CL信號(hào)強(qiáng)度提升約2倍，且調(diào)高的幅度與三角波電壓的頻率和幅度有關(guān).在最佳條件下，基于該電壓調(diào)制型ECL方法能夠?qū)Φ瓦_(dá)1.0 nmol/L的過(guò)氧化氫進(jìn)行高靈敏檢測(cè)，提高了檢測(cè) 的靈敏度.這種通過(guò)調(diào)制施加電壓的放大策略不僅提供了一種通用性高的增強(qiáng)型ECL技術(shù)；而且有助于深入理解電極界面上電化學(xué)過(guò)程的機(jī)理及調(diào)控機(jī)制，為研究電化學(xué)機(jī)理提供了一套新的技術(shù)和數(shù)據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并［3，4-d］噠嗪-1，4-（2H，3H）-二酮（L012）購(gòu)于日本W(wǎng)ako公司；過(guò)氧化氫（質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%）溶液購(gòu)于上海生工公司；PBS緩沖溶液（10×，80.0 g NaCl+2.0 g KCl+14.4 g Na2HPO4+2.4 g KH2PO4）溶于1.0 L超純水中，pH調(diào)至7.4.使用前，將10×PBS緩沖溶液用超純水稀釋成pH=7.4的1×PBS緩沖溶液.所用試劑均為分析純，使用前未經(jīng)純化處理.實(shí)驗(yàn)用超純水由Millipore UPH-Ⅱ-5T型水凈化系統(tǒng)制得（電阻率：18.2 MΩ/cm）.

ECL檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)室自行搭建的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行.

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

實(shí)驗(yàn)采用三電極體系：用O型圈在氧化銦錫（ITO）電極上固定直徑為4.0 mm的導(dǎo)電面積作為工作電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑絲為輔助電極.電解液為包含500 μmol/L L012的1×PBS緩沖溶液（pH=7.4）.在電壓調(diào)制模式下，施加電壓范圍為（V0－?V）～（V0+?V）（V0為恒定電壓，?V為三角波電壓幅度），電壓頻率在5～750 Hz范圍內(nèi)變換.ECL信號(hào)通過(guò)光電倍增管收集.在檢測(cè)過(guò)氧化氫實(shí)驗(yàn)中，不同濃度的過(guò)氧化氫被加入到溶液中，并依次收集所產(chǎn)生的ECL信號(hào).

2 結(jié)果與討論

2.1 電壓調(diào)制模式下ECL光強(qiáng)的增大幅度

實(shí)驗(yàn)中選擇具有更強(qiáng)ECL發(fā)光效率的魯米諾衍生物L(fēng)012分子作為ECL發(fā)光物質(zhì)，研究其在不同周期和幅度電壓條件下的ECL光強(qiáng).鑒于L012分子的氧化電壓約為1.0 V，故選擇恒定電壓為1.0 V，三角波電壓暫選為50 mV，將施加在電極上的電壓從0.95～1.05 V進(jìn)行線性掃描，頻率為250 Hz，結(jié)果如圖1（A）所示.施加電壓后，立即觀測(cè)到ECL信號(hào)（曲線a）；隨后，由于L012分子在電極界面被消耗而形成濃差極化現(xiàn)象，導(dǎo)致ECL光強(qiáng)下降.與恒定電壓（1.05及1.0 V）條件下的ECL光強(qiáng)（曲線b和c）相比，通過(guò)引入三角波的電壓調(diào)制型ECL光強(qiáng)明顯增大.該結(jié)果證明，由于施加電壓處于變化過(guò)程中，其所產(chǎn)生的濃差極化程度將小于恒定電壓條件下的狀況，因此可有效提高ECL光強(qiáng)，顯示出電壓調(diào)制型ECL增大光強(qiáng)的可行性.

在1.0 V電壓基礎(chǔ)上分別施加不同幅度的三角波電壓，并記錄ECL光強(qiáng).由圖1（B）（曲線a）可以看出，隨著三角波電壓的增大，ECL曲線呈逐漸上升趨勢(shì).這主要由于施加較高的電壓會(huì)促進(jìn)L012在電極表面的ECL反應(yīng)速度，從而導(dǎo)致ECL光強(qiáng)增大.類(lèi)似的現(xiàn)象在對(duì)電極施加恒定電壓時(shí)也會(huì)發(fā)生.如圖1（B）曲線b所示，在1 V電壓基礎(chǔ)上增加一個(gè)恒定的微擾電壓后，ECL光強(qiáng)隨著電壓的升高而變大.但是，通過(guò)對(duì)比電壓調(diào)制型和恒電壓型ECL平均光強(qiáng)發(fā)現(xiàn)，圖1（C）所示的比值在電壓幅度為50 mV時(shí)達(dá)到最大，增強(qiáng)近2倍.該結(jié)果表明電壓調(diào)制型ECL通過(guò)輸入周期變化的電壓，可以有效緩解濃差極化現(xiàn)象帶來(lái)的的ECL信號(hào)下降問(wèn)題，起到增大發(fā)光強(qiáng)度的作用.為了驗(yàn)證該放大策略的通用性，對(duì)另外一個(gè)電化學(xué)發(fā)光經(jīng)典體系—聯(lián)吡啶釕-三乙胺（［Ru（bpy）3］2+-TPA）進(jìn)行了研究.與恒定電壓（1.25 V）條件下的發(fā)光信號(hào)相比，施加電壓幅度為50 mV的電壓調(diào)制模式（1.20～1.30 V）可以使電化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度提升1.4倍.該結(jié)果表明基于電壓調(diào)制調(diào)制模式的信號(hào)放大策略可用于多種電化學(xué)發(fā)光體系.

Fig.1 Curves for voltage modulated(a)ECL with an applied voltage between 0.95 and 1.05 V,and constant ECLs with a constant voltage of 1.05(b)and 1 V(c)(A),normalized luminescence ratio of vol-tage modu?lated(a)ECL and constant ECL(b)with different voltage amplitudes(B),increase fold between voltage modulated ECL and constant ECL with different voltage amplitudes(C),normalized luminescence ratio of voltage modulated ECL with different frequencies(D)

除了施加電極上的電壓會(huì)對(duì)電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生影響外，三角波電壓的頻率也會(huì)影響電極界面的濃差極化現(xiàn)象，從而對(duì)ECL光強(qiáng)產(chǎn)生影響.因此，將三角波的電壓頻率從5 Hz調(diào)節(jié)到750 Hz，并記錄所產(chǎn)生的ECL光強(qiáng).由圖1（D）可見(jiàn)，隨著電壓頻率的上升ECL信號(hào)增強(qiáng)，并在頻率為250 Hz時(shí)達(dá)到最高.鑒于平板電極表面建立穩(wěn)定雙電層的時(shí)間常數(shù)在毫秒級(jí)別，進(jìn)一步增加頻率會(huì)導(dǎo)致施加于電極界面電壓的時(shí)間小于時(shí)間常數(shù)，造成電極界面中雙電層難以迅速建立.由此可導(dǎo)致雙電層的有效電壓下降，使電化學(xué)發(fā)光進(jìn)程受阻，最終表現(xiàn)為信號(hào)開(kāi)始下降.根據(jù)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定了電壓調(diào)制型ECL發(fā)光方法的最佳實(shí)驗(yàn)條件：三角波電壓幅度為50 mV；頻率為250 Hz.

2.2 電壓調(diào)制型ECL檢測(cè)過(guò)氧化氫

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，利用電壓調(diào)制型ECL方法對(duì)過(guò)氧化氫進(jìn)行檢測(cè).過(guò)氧化氫在該條件下會(huì)被氧化形成活性氧組分，與L012氧化的中間體發(fā)生反應(yīng)，并釋放出ECL信號(hào).利用電壓調(diào)制模式，在施加50 mV微擾電壓的條件下考察了過(guò)氧化氫增強(qiáng)L012 ECL的性能，結(jié)果如圖2（A）所示.隨著過(guò)氧化氫的引入，ECL強(qiáng)度開(kāi)始上升，其上升的幅度隨著過(guò)氧化氫濃度的增大而逐漸提高.以不同過(guò)氧化氫濃度下的ECL強(qiáng)度對(duì)過(guò)氧化氫濃度作圖，如圖2（B）所示［插圖為ECL強(qiáng)度與過(guò)氧化氫濃度（1.0 nmol/L～2.0 μmol/L）的關(guān)系圖］.ECL強(qiáng)度與過(guò)氧化氫濃度在1.0 nmol/L～200 μmol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為I=131.1+27.6c，相關(guān)系數(shù)R=0.986，對(duì)過(guò)氧化氫的檢出限為0.24 nmol/L（S/N=3）.該結(jié)果表明，利用電壓調(diào)制型ECL可以對(duì)過(guò)氧化氫進(jìn)行靈敏檢測(cè).

為了進(jìn)一步證明該方法檢測(cè)過(guò)氧化氫的靈敏性，將該分析結(jié)果與其它方法進(jìn)行了比較.由表1可見(jiàn)，電壓調(diào)制型ECL檢測(cè)技術(shù)在檢測(cè)限和靈敏度方面均優(yōu)于其它檢測(cè)方法，表明通過(guò)抑制濃差極化現(xiàn)象可顯著提高檢測(cè)的靈敏度，為高靈敏ECL分析提供了一種新技術(shù).更為重要的是，這種檢測(cè)方法證實(shí)了可通過(guò)對(duì)電極界面上電化學(xué)基本過(guò)程的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)基于物理策略的信號(hào)放大.該研究將有助于深入理解電極界面電化學(xué)過(guò)程的機(jī)理及調(diào)控機(jī)制.

Fig.2 Luminescence curves of voltage modulated ECL with different concentrations of hydro?gen peroxide(A)and correlation of integrated luminescence with different concentrations of hydrogen peroxide(B)

Table 1 Comparison of the detection limits using different ECL methods

3 結(jié) 論

報(bào)道了一種通用性高的電壓調(diào)制型電化學(xué)發(fā)光分析技術(shù).與傳統(tǒng)的恒電壓方法相比，該新型電壓調(diào)制模式能有效提高ECL信號(hào).該方法對(duì)過(guò)氧化氫的檢測(cè)具有較寬的線性范圍和較低的檢出限，為高靈敏ECL分析提供了新技術(shù).