原位冷凍電子斷層掃描的發(fā)展及在生物研究方面的應(yīng)用

趙關(guān)芳，鄒天一，程思航，于 洋，王慧利，王宏達(dá)

（1.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所,電分析化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)春130022;2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué),合肥230026）

對(duì)生物大分子結(jié)構(gòu)的研究對(duì)于全面了解其生物學(xué)功能至關(guān)重要，尤其是對(duì)結(jié)構(gòu)的可視化對(duì)于其功能的理解很關(guān)鍵.而傳統(tǒng)研究生物大分子通常采用“還原論”或“分而治之”的方法：將生物大分子進(jìn)行分離純化，并通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法研究純化的成分［1］.X射線(xiàn)晶體學(xué)（X-ray crystallography）［2］、核磁共振（NMR）［3］以及可原位成像生物樣品的單分子成像技術(shù)［如原子力顯微鏡（AFM）和單分子熒光顯微鏡（SMFM）］［4，5］成為20世紀(jì)研究生物大分子的主要技術(shù).其中，X射線(xiàn)晶體學(xué)常被用來(lái)確定生物分子的高分辨率結(jié)構(gòu)，通過(guò)該方法已經(jīng)得到了多種蛋白和核酸的原子模型［6，7］.但是，該技術(shù)只能確定可以結(jié)晶的生物分子的結(jié)構(gòu)，不能用來(lái)確定無(wú)法結(jié)晶或者難以結(jié)晶的樣品的結(jié)構(gòu).單分子成像顯微鏡可以在原位生理環(huán)境中對(duì)生物樣品進(jìn)行成像，如本課題組［8，9］通過(guò)AFM從細(xì)胞膜兩側(cè)系統(tǒng)地分析了原位細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，提出了新的細(xì)胞膜模型，為研究細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能提供了新的見(jiàn)解.而通過(guò)SMFM能以很高的信噪比可視化樣品中目標(biāo)分子的分布，同時(shí)保留了目標(biāo)分子在生理環(huán)境中的關(guān)鍵特征.如通過(guò)SMFM原位表征活細(xì)胞中細(xì)胞膜上的單個(gè)蛋白等生物分子的分布特征［10，11］.然而，由于單分子成像顯微鏡的分辨率較低，雖然可以通過(guò)該方法對(duì)生物分子進(jìn)行原位成像，但無(wú)法可視化生物分子的三維結(jié)構(gòu).對(duì)于生物系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，大多數(shù)的生理功能是多種不同生物分子相互作用的結(jié)果［12］.而且生物分子的結(jié)構(gòu)形態(tài)和生理功能的執(zhí)行嚴(yán)格依賴(lài)其所處的生理環(huán)境，在保持生物分子結(jié)構(gòu)完整性的情況下不可能將其從所處生理環(huán)境中分離純化出來(lái).因此，以高分辨率表征生物分子在其原位環(huán)境中的三維結(jié)構(gòu)特征對(duì)于了解其功能具有重要的生理學(xué)意義.

冷凍電子斷層掃描（cryo-ET）［13］適用于冷卻至低溫并嵌入玻璃態(tài)冰中的樣品而不需要使樣品結(jié)晶，是唯一能夠在原位生理環(huán)境中直接以多種構(gòu)象可視化生物分子三維結(jié)構(gòu)的成像技術(shù)［14］.電子斷層掃描（ET）是獲取樣品三維結(jié)構(gòu)常用的方法，即通過(guò)以一個(gè)固定的角度間隔將樣品傾轉(zhuǎn)一定的角度（通常為—60°～+60°），用電子顯微鏡（EM）獲取樣品的投影圖像.在cryo-ET中，通過(guò)旋轉(zhuǎn)樣品可以得到不同角度的二維投影圖并對(duì)其進(jìn)一步重構(gòu)處理生成三維的斷層圖.該斷層圖就是包埋有樣品的玻璃態(tài)的冰.然后，可通過(guò)識(shí)別并分割該斷層圖中感興趣的目標(biāo)樣品，或通過(guò)提取并平均多個(gè)同種目標(biāo)樣品以獲得該樣品的中高分辨率的結(jié)構(gòu)［15］.近年來(lái)，隨著硬件技術(shù)的進(jìn)步（電子檢測(cè)器技術(shù)、相位板、能量過(guò)濾器等）與樣品制備技術(shù)的改進(jìn)，cryo-ET才逐漸得到了廣泛應(yīng)用［16～18］.此外，cryo-ET也是一種強(qiáng)大的無(wú)需標(biāo)記的成像技術(shù)，依靠生物樣品固有的質(zhì)量密度，可以得到生物結(jié)構(gòu)的全面電子密度圖像，因此可對(duì)原位的細(xì)胞或者細(xì)胞內(nèi)部以納米級(jí)分辨率進(jìn)行成像，從而保留每個(gè)生物結(jié)構(gòu)的構(gòu)象以及其與其它生物分子相互作用的完整信息.而樣品制備技術(shù)的改進(jìn)使得cryo-ET可對(duì)多種生物樣品進(jìn)行成像.目前已經(jīng)利用cryo-ET研究了一系列的生物樣品，例如分離的細(xì)胞器［19，20］、病毒［21］、細(xì)菌［22］、真核細(xì)胞［23］和組織切片［24］等.自動(dòng)化數(shù)據(jù)收集軟件的發(fā)展（serial EM）顯著提高了cryo-ET數(shù)據(jù)的收集效率.強(qiáng)大的數(shù)據(jù)處理工具的出現(xiàn)和計(jì)算方法的改進(jìn)將目標(biāo)樣品結(jié)構(gòu)的分辨率極限提高到了亞納米水平，如模板匹配（template matching）［25］、襯度傳遞函數(shù)（CTF）校正［26］、子斷層圖平均（sub-tomogram averaging）和分類(lèi)［27，28］.這使獲得的目標(biāo)樣品的結(jié)構(gòu)能夠準(zhǔn)確反應(yīng)出其原位環(huán)境中的生理構(gòu)象.

本文從樣品制備和數(shù)據(jù)采集處理與分析等方面綜述了與cryo-ET相關(guān)技術(shù)和方法的進(jìn)展，總結(jié)了cryo-ET在生物研究中的應(yīng)用并討論了cryo-ET的主要挑戰(zhàn)及最新進(jìn)展.

1 Cryo-ET成像流程

1.1 樣品制備

一直以來(lái)，用于EM成像的生物樣品必須進(jìn)行化學(xué)固定、脫水和染色.雖然這些步驟對(duì)于穩(wěn)定生物樣品的狀態(tài)并提供較好的樣品襯度是必要的，但會(huì)嚴(yán)重破壞并改變生物樣品的超微結(jié)構(gòu)和分子組織.因此，近幾十年來(lái)EM一直無(wú)法達(dá)到X射線(xiàn)晶體學(xué)或NMR的分辨率.然而，隨著快速冷凍樣品保存方法的出現(xiàn)，這種情況發(fā)生了改變，即蛋白質(zhì)水溶液或整個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)快速冷凍可生成非晶冰而不是結(jié)晶冰［29，30］，再通過(guò)cryo-ET即可以高分辨率觀察近生理環(huán)境中冷凍水合狀態(tài)的生物樣品.目前用于制備cryo-ET冷凍樣品的方法有3種：快速冷凍（PF）［圖1（A）］［31，32］、噴射冷凍（JF）［33］和高壓冷凍（HPF）［圖1（B）］［34］.其中，PF是最常用的技術(shù)，因?yàn)樗粌H與蛋白質(zhì)復(fù)合物、分離的細(xì)胞組分以及整個(gè)細(xì)胞都兼容，而且可以完全自動(dòng)化［35，36］.HPF則適用于一些較厚或較大的樣品，如多細(xì)胞生物或組織，可以使厚度為200 μm的樣品形成玻璃態(tài)［37］.

Cryo-ET成像的一個(gè)主要限制因素是樣品厚度.受限于電子的透過(guò)能力，cryo-ET對(duì)生物樣品進(jìn)行成像的厚度極限為0.5～1 μm，太厚的樣品很難獲得高分辨率數(shù)據(jù)［38］.因此，最嚴(yán)格意義上的原位cryo-ET，即完整生理環(huán)境中的冷凍電子斷層掃描，僅限于足夠薄的生物樣品，如原核生物或真核細(xì)胞的外圍部分等.此外，在cryo-ET成像過(guò)程中，隨著樣品傾轉(zhuǎn)角度的增大，樣品厚度會(huì)明顯增加，這進(jìn)一步限制了cryo-ET成像的分辨率.因此，在大多數(shù)情況下，需要將生物樣品削薄以滿(mǎn)足cryo-ET對(duì)樣品進(jìn)行高分辨率成像的要求.

通過(guò)機(jī)械切片來(lái)減薄冷凍樣品早在1950年代即已奠定了基礎(chǔ)，但是很久以后才實(shí)現(xiàn)了更多的常規(guī)應(yīng)用.基于玻璃體切片的冷凍電子切片（CEMOVIS）技術(shù)的發(fā)展使cryo-ET首次觀察到了近似處于天然狀態(tài)的細(xì)胞.但是，該技術(shù)對(duì)操作人員的手動(dòng)操作能力要求較高，而且通過(guò)該技術(shù)得到的樣品質(zhì)量也較差（如外力導(dǎo)致的截面彎曲、劃痕和樣品壓縮）［39，40］.這些因素導(dǎo)致CEMOVIS在cryo-ET高分辨率成像上的應(yīng)用受到了限制［39］［圖1（C）］.為了克服這些問(wèn)題，可以采用聚焦離子束（FIB）銑削這種來(lái)自材料科學(xué)的方法，制備適用于cryo-ET成像的樣品［41～43］［圖1（D）］.FIB銑削在配備用于成像的掃描電子束和用于燒蝕材料的離子束（例如氦、鎵）的雙束顯微鏡上進(jìn)行.當(dāng)FIB銑削配備有氮?dú)鉁囟认逻\(yùn)行的專(zhuān)用平臺(tái)時(shí)，可以利用這些系統(tǒng)的高精度來(lái)制備適用于cryo-ET高分辨成像的生物樣品.使用FIB銑削，可以制備具有不同幾何形狀（“楔形”或“薄片”）和厚度（＜200 nm）的無(wú)變形的樣品［44］.此外，雙光束SEM的精確成像特性可對(duì)細(xì)胞的組分進(jìn)行相關(guān)成像并精確定位與生物學(xué)問(wèn)題相關(guān)的目標(biāo)區(qū)域，從而提高樣品通量.FIB銑削不僅可制備分離的細(xì)胞薄片，還可制備組織和多細(xì)胞生物的薄片［45～47］.

1.2 數(shù)據(jù)采集處理與分析

樣品制備技術(shù)的改進(jìn)極大地促進(jìn)了cryo-ET的應(yīng)用，EM硬件的改進(jìn)可將ET的分辨率提升到亞納米水平.單顆粒分析（SPA）和cryo-ET密切相關(guān)，因此有許多共同的概念.最近的“分辨率革命”［50］將SPA的分辨率提升到X射線(xiàn)晶體學(xué)和NMR水平，其本質(zhì)上是儀器硬件領(lǐng)域的一場(chǎng)革命.這包括能顯著改善顯微鏡的穩(wěn)定性的硬件設(shè)備（如透鏡、樣品架）以及能去除非彈性散射電子的能量過(guò)濾器［圖2（A）］，這些電子對(duì)高分辨率信息沒(méi)有幫助.然而，更重要的是，直接電子檢測(cè)器（DED）［51］的出現(xiàn)顯著提高了數(shù)據(jù)質(zhì)量.與傳統(tǒng)的電荷耦合檢測(cè)器（CCD）相比，DED的靈敏度顯著提高.此外，DED還具有更快的幀讀取速度，可以在圖像采集過(guò)程中校正電子束引起的樣品移動(dòng)［52］.同時(shí)，DED靈敏度的提高可以降低每個(gè)角度投影的電子劑量，從而可以總體降低整個(gè)傾轉(zhuǎn)系列中的電子累積量.通常，SPA采集數(shù)據(jù)的每個(gè)位置曝光的電子總劑量為20～60 e/?2（1?2=0.01 nm2）；但在cryo-ET中，通過(guò)繞軸旋轉(zhuǎn)（通常以固定步長(zhǎng)從±60°到?60°）［圖2（B）］來(lái)獲得樣品在每個(gè)角度上的投影圖［圖2（C）］. 因此，需要在整個(gè)傾轉(zhuǎn)系列上合理分配樣品可以承受的電子劑量，以避免輻射損傷.為了在整個(gè)傾轉(zhuǎn)系列上合理分配樣品可承受的電子劑量，根據(jù)對(duì)數(shù)據(jù)要求的不同，研究者提出了幾種不同的樣品臺(tái)傾轉(zhuǎn)方式（單向旋轉(zhuǎn)、雙向旋轉(zhuǎn)和對(duì)稱(chēng)旋轉(zhuǎn)）.因此，相比于SPA成像收集的數(shù)據(jù)，cryo-ET成像收集的數(shù)據(jù)中每個(gè)角度的圖像承受的電子劑量更低，襯度更低，信噪比（SNR）較差.若樣品不經(jīng)過(guò)染色等過(guò)程會(huì)導(dǎo)致其在cryo-ET成像過(guò)程中SNR較差，因此需要通過(guò)調(diào)整散焦值來(lái)提高樣品的SNR，但是調(diào)整散焦值會(huì)降低cryo-ET收集數(shù)據(jù)的分辨率，并且需要通過(guò)CTF校正散焦對(duì)cryo-ET圖像的影響［53］.因此，為了提高cryo-ET圖像的SNR，可在cryo-ET成像過(guò)程中插入相位板［54］，尤其是電壓相位板（VPP），在成像過(guò)程中會(huì)顯著提高樣品的襯度和SNR，在SPA成像和cryo-ET成像領(lǐng)域均顯示出巨大的潛力.通過(guò)相位板增強(qiáng)樣品的襯度和SNR對(duì)于cryo-ET成像尤為重要，因?yàn)樗粌H可以用來(lái)確定小分子（＜100 kDa）的結(jié)構(gòu)，而且無(wú)需校正調(diào)整散焦值對(duì)圖像帶來(lái)的混雜效應(yīng)［55］.

隨著計(jì)算機(jī)算法的快速發(fā)展，研究人員研發(fā)了各種算法和程序用來(lái)重構(gòu)和處理cryo-ET數(shù)據(jù)（如IMOD和TOM等）［57～59］.在cryo-ET數(shù)據(jù)的重構(gòu)過(guò)程中，首先需要對(duì)傾轉(zhuǎn)系列中每個(gè)角度的投影圖進(jìn)行對(duì)齊.通常是追蹤在樣品快速冷凍前吸附在樣品上的高密度基準(zhǔn)標(biāo)記（如金納米顆粒）來(lái)對(duì)齊傾轉(zhuǎn)系列中各個(gè)角度的投影圖.但是這些高密度基準(zhǔn)標(biāo)記不僅無(wú)法應(yīng)用在FIB切割的薄片上［46］，而且可能會(huì)降低樣品的質(zhì)量或損害樣品的完整性.因此，在此情況下可以使用碎片追蹤的方法來(lái)對(duì)傾轉(zhuǎn)系列中的圖像進(jìn)行對(duì)齊，該方法將傾轉(zhuǎn)系列中的圖像分割成碎片，然后計(jì)算不同圖像中碎片的互相關(guān)性以校正圖像間的相對(duì)位置來(lái)進(jìn)行對(duì)齊.因此，這種方法通常不如基準(zhǔn)標(biāo)記追蹤精確，尤其是在傾轉(zhuǎn)系列中傾轉(zhuǎn)角較高或圖像的SNR太低的情況下，碎片追蹤可能容易出錯(cuò)，這會(huì)嚴(yán)重影響重構(gòu)后圖像的分辨率.傾轉(zhuǎn)系列中的圖像對(duì)齊后，可以使用直接傅里葉反演來(lái)重構(gòu)生成斷層圖像.除了傅里葉合成外，還有幾種用于重構(gòu)的迭代算法，如同時(shí)迭代重建技術(shù)（SIRT）或同步代數(shù)重構(gòu)技術(shù)（SART）［60，61］.但是，cryo-ET數(shù)據(jù)重構(gòu)最常用的算法是非迭代加權(quán)反投影（WBP），因?yàn)樗梢宰畲蟪潭鹊乇Ａ魳悠返母叻直媛市畔ⅲ蹐D2（D）］.通過(guò)WBP重構(gòu)得到的三維的斷層圖非常精細(xì)，可以手動(dòng)或半自動(dòng)標(biāo)記斷層圖中較大的感興趣的目標(biāo)結(jié)構(gòu)（如膜或細(xì)胞器）.

Fig.2 Principles of data collection and processing in cryo?ET[14,56]

在對(duì)cryo-ET數(shù)據(jù)進(jìn)行三維重構(gòu)生成斷層圖后，需要對(duì)斷層圖中目標(biāo)結(jié)構(gòu)進(jìn)行識(shí)別和挑選.對(duì)于較大的分子復(fù)合物（如核糖體和蛋白酶體）來(lái)說(shuō)，在斷層圖中很容易被識(shí)別，可手動(dòng)識(shí)別并標(biāo)注其位置.但是這種方法不適用于較大的數(shù)據(jù)集，因此，為了批量處理較大的數(shù)據(jù)集，研究人員研發(fā)了一些功能強(qiáng)大的全自動(dòng)圖像處理算法，這些算法可根據(jù)目標(biāo)分子的結(jié)構(gòu)特征和大小自動(dòng)識(shí)別和定位斷層圖中的目標(biāo)分子.對(duì)于通過(guò)cryo-ET成像的純化大分子，可使用模板匹配的算法快速識(shí)別定位斷層圖中目標(biāo)分子（如pytom）［圖3（A）］［62，63］. 模板匹配是在斷層圖中搜索定位目標(biāo)分子復(fù)合物的計(jì)算方法［64］，使用目標(biāo)分子的已知結(jié)構(gòu)信息（如晶體結(jié)構(gòu)、分子的粗糙形態(tài)或已知的結(jié)合分子的結(jié)構(gòu)）通過(guò)低通濾波來(lái)創(chuàng)建用于自動(dòng)識(shí)別并拾取粒子的模板.此外，也可通過(guò)斷層圖直接生成模板.模板匹配算法是將創(chuàng)建或生成的目標(biāo)結(jié)構(gòu)的模板與斷層圖中的每個(gè)位置進(jìn)行比較，該算法通過(guò)運(yùn)行互相關(guān)計(jì)算會(huì)生成模板與斷層圖中每個(gè)位置的一個(gè)互相關(guān)值，因此斷層圖中的每個(gè)像素點(diǎn)都會(huì)得到一個(gè)對(duì)應(yīng)的相似度得分.然后，可從斷層圖中提取與高相似度分值相對(duì)應(yīng)的子斷層圖，并在進(jìn)一步分析前手動(dòng)對(duì)這些子斷層圖進(jìn)行篩選，以消除明顯的假陽(yáng)性結(jié)果［63］.然而，對(duì)這些子斷層圖進(jìn)行分類(lèi)比較困難.盡管模板匹配的算法可以手動(dòng)清除明顯的假陽(yáng)性的子斷層圖，但在處理尺寸較小、特征比較差的異質(zhì)性顆粒數(shù)據(jù)集時(shí)結(jié)果通常不理想.對(duì)于這種更復(fù)雜的斷層圖，可以使用基于卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（CNN）［圖3（B）］［65］的斷層圖標(biāo)記工具來(lái)識(shí)別目標(biāo)結(jié)構(gòu)特征（如EMAN2）［66］.這種神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)只需很少的人為訓(xùn)練即可學(xué)習(xí)各種可能的目標(biāo)結(jié)構(gòu)特征類(lèi)型，且其本身的結(jié)構(gòu)是固定的.一旦對(duì)CNN進(jìn)行了訓(xùn)練以識(shí)別某個(gè)特征，就可以將其用在通過(guò)相似的成像條件得到的斷層圖中以識(shí)別標(biāo)記相同的特征而無(wú)需額外的訓(xùn)練.因此，這種神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可以輕易區(qū)分結(jié)構(gòu)的細(xì)微差異，如線(xiàn)粒體的雙層膜與其它細(xì)胞器的單層膜.該算法主要應(yīng)用在延伸的細(xì)絲（如微管蛋白或肌動(dòng)蛋白）、膜（彎曲/平面）和呈周期排列的或孤立的大分子等類(lèi)型的斷層圖中.隨后，可從每個(gè)斷層圖中提取CNN識(shí)別標(biāo)記的特定特征的子斷層圖.近年來(lái)，深度學(xué)習(xí)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)因其強(qiáng)大的功能而得到廣泛應(yīng)用［67］.但是，對(duì)于膜蛋白等很多與膜相關(guān)的處在原位的生物分子，由于它們之間存在相互作用且處在較復(fù)雜的的生理環(huán)境中，故對(duì)這些生物分子在生理環(huán)境中的檢測(cè)和精確定位變得更加困難.對(duì)于這種樣品，可以使用一種無(wú)模板的圖像處理軟件（Pyseg）［圖3（C）］［68］來(lái)識(shí)別定位斷層圖中的目標(biāo)分子，它改編并擴(kuò)展了基于離散摩爾斯理論（discrete Morse theory）的現(xiàn)有分割方法，能精確追蹤斷層圖中電子密度的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)并自動(dòng)檢測(cè)和定位生物分子的位置；且該軟件中的算法還可以定位原位環(huán)境中尺寸比較小的生物分子，這些小分子的尺寸遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于模板匹配的極限.此外，由于沒(méi)有模板，該軟件還可以識(shí)別并定位異質(zhì)性或處在不同組成和構(gòu)象狀態(tài)的分子復(fù)合物.而基于隨機(jī)采樣選點(diǎn)或深度學(xué)習(xí)的無(wú)模板采樣方法僅適用于比較大的分子復(fù)合物，且在模擬和真實(shí)數(shù)據(jù)集上均無(wú)法達(dá)到該軟件所能達(dá)到的分辨率.綜上所述，對(duì)于不同的數(shù)據(jù)可以采用不同的軟件和方法在斷層圖識(shí)別和定位感興趣的目標(biāo)分子，并將這些目標(biāo)分子所對(duì)應(yīng)的子斷層圖提取出來(lái)［圖2（E）］.隨后就可以通過(guò)角度搜索［63，69，70］或快速旋轉(zhuǎn)匹配（FRM）［71］等方法對(duì)這些子斷層圖進(jìn)行迭代對(duì)齊. 每次迭代過(guò)程都會(huì)對(duì)子斷層圖中的目標(biāo)分子進(jìn)行平均，從而相對(duì)于各個(gè)子斷層圖提高目標(biāo)分子的SNR.

Fig.3 Procedures to identify structures of interest in tomograms

通過(guò)子斷層圖的對(duì)齊和平均生成高分辨率分子結(jié)構(gòu)的方式有2種：傳統(tǒng)的子斷層圖對(duì)齊和平均［72，73］以及每個(gè)目標(biāo)分子和每個(gè)傾轉(zhuǎn)角度的精確細(xì)化.傳統(tǒng)的方式利用的是現(xiàn)有的子斷層圖對(duì)齊和平均的算法.對(duì)齊的算法采用的是一種可以很好地適應(yīng)顆粒尺寸變化的非常有效的分級(jí)分層的方法.整個(gè)分子結(jié)構(gòu)細(xì)化的過(guò)程采用類(lèi)似于SPA中的“gold-standard”算法［74］，并使用傅里葉殼相關(guān)（FSC）評(píng)估得到的分子結(jié)構(gòu)的分辨率和測(cè)量迭代過(guò)程間的收斂程度.這些算法已經(jīng)運(yùn)用在了Relion中.而另一種方式則不使用子斷層圖，而是使用子傾轉(zhuǎn)系列.當(dāng)整個(gè)傾轉(zhuǎn)系列對(duì)齊時(shí)，我們假設(shè)每個(gè)傾轉(zhuǎn)角度的圖像都是剛體的投影.考慮到電子束引起的樣品移動(dòng)、電荷和輻射損傷所帶來(lái)的影響，要使樣品在1 μm的跨度內(nèi)保持整體剛度一致是非常困難的，而且最大可接受的樣品移動(dòng)偏差要＜1 nm.對(duì)于生物樣品來(lái)說(shuō)，局部移動(dòng)偏差很常見(jiàn)，并且這些移動(dòng)偏差很可能會(huì)導(dǎo)致研究對(duì)象在各個(gè)傾轉(zhuǎn)角度的圖像內(nèi)未對(duì)齊.為了消除這種影響因素，研究者們開(kāi)發(fā)了一種對(duì)每個(gè)傾轉(zhuǎn)角度中每個(gè)目標(biāo)分子進(jìn)行細(xì)化的算法，其中對(duì)每個(gè)傾轉(zhuǎn)角度中的每個(gè)目標(biāo)分子的對(duì)齊都進(jìn)行了單獨(dú)的細(xì)化并對(duì)每個(gè)目標(biāo)分子的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估.實(shí)際上，這種方法是子斷層圖平均與傳統(tǒng)SPA的相結(jié)合的產(chǎn)物，其中的一些技術(shù)已經(jīng)運(yùn)用在了EMClarity中［75］.

通常，SPA處理的樣品非常均一，而原位的cryo-ET由于具有更大程度的可變性和更復(fù)雜的背景干擾，可能更具有挑戰(zhàn)性.由于目標(biāo)分子處在原位環(huán)境中，因此cryo-ET在成像過(guò)程中可能會(huì)檢測(cè)到目標(biāo)分子大量不同的構(gòu)象或狀態(tài)，所以需要將目標(biāo)分子分成更多的類(lèi).自動(dòng)對(duì)焦的三維分類(lèi)［63］可以無(wú)差別的對(duì)斷層圖中的目標(biāo)分子進(jìn)行分類(lèi)，并可分辨目標(biāo)分子中不同功能或組裝狀態(tài)的細(xì)微結(jié)構(gòu)差異.目前，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一些軟件包，這些軟件包集成并簡(jiǎn)化了模板匹配、子圖平均和分類(lèi)等流程.

盡管取得了上述進(jìn)步，但cryo-ET成像的分辨率通常比SPA低.目前，只有少數(shù)原位cryo-ET對(duì)樣品的成像能夠達(dá)到亞納米水平.但是，通過(guò)為每個(gè)檢測(cè)到的目標(biāo)分子提供其在原位環(huán)境中的信息，可以彌補(bǔ)這種較低的分辨率帶來(lái)的不足.由于cryo-ET成像技術(shù)的分辨率跨越了很大的空間數(shù)量級(jí)范圍，因此可以與低分辨率的成像技術(shù)結(jié)合使用（如熒光顯微鏡）.綜上所述，隨著有關(guān)cryo-ET數(shù)據(jù)處理的算法和軟件的發(fā)展，cryo-ET不僅可以表征目標(biāo)分子在其原位環(huán)境中的分布狀態(tài)和特征，而且可以獲得目標(biāo)分子在其原位環(huán)境中的高分辨率的三維結(jié)構(gòu).

2 Cryo-ET在生物學(xué)上的應(yīng)用

Cryo-ET特別適合以分子分辨率研究天然可變或高度復(fù)雜的生物分子結(jié)構(gòu)，特別是表征某些異質(zhì)性的超分子組裝體、多型病毒、細(xì)胞器和細(xì)胞組分，或表征完整的細(xì)胞和組織.

SPA可以用于研究純化的生物分子，使其達(dá)到亞納米級(jí)的分辨率.但是，該方法需要成千上萬(wàn)個(gè)相同生物分子的平均，因此不能應(yīng)用于具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的大分子.在此情況下，cryo-ET是一種可選擇的技術(shù)，因?yàn)樗芤詭准{米的分辨率直接提供單個(gè)大分子的三維圖像.如，通過(guò)cryo-ET研究進(jìn)化趨異的生物和人類(lèi)患者中與疾病相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)蛋白（TRAP）復(fù)合物突變的纖維細(xì)胞中的天然轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)，揭示了中心易位子組分的分子結(jié)構(gòu)，增加了我們對(duì)膜蛋白的了解，并闡明了TRAP在人類(lèi)先天性糖基化疾病中的作用［76］.此外，已有報(bào)道［77］通過(guò)cryo-ET研究分離的軸突提出了正常的和引起原發(fā)性睫狀運(yùn)動(dòng)障礙的RSPH1突變型人類(lèi)呼吸道纖毛的天然三維結(jié)構(gòu)，并揭示了RSPH1突變型纖毛中先前未知的初級(jí)缺陷和異質(zhì)次級(jí)缺陷.這極大地加深了對(duì)纖毛和鞭毛運(yùn)動(dòng)以及動(dòng)力蛋白在此過(guò)程中作用機(jī)理的了解.純化制劑與全細(xì)胞斷層成像的結(jié)合特別有效，通過(guò)cryo-ET成像和模板匹配的方法來(lái)表征70S核糖體揭示了分離的核糖體、休眠核糖體的二聚體和活性多核糖體的空間組織以及在細(xì)胞中的精確定位［78］［圖4（A）］.

Cryo-ET已被廣泛應(yīng)用于多型病毒的研究，如對(duì)包膜病毒（例如牛痘、單純皰疹、流感或人類(lèi)免疫缺陷病毒）的結(jié)構(gòu)與功能的研究.大量的工作揭示了病毒外殼的結(jié)構(gòu)特征及糖蛋白峰、病毒包膜、基質(zhì)和核糖蛋白之間的相互作用.如通過(guò)cryo-ET成像和子斷層圖平均確定了完整病毒和重組核衣殼樣裝配體內(nèi)的埃博拉病毒核衣殼的結(jié)構(gòu)［79］；而且還通過(guò)cryo-ET和CTF校正的子斷層圖平均研究了組裝的未成熟的HIV病毒的主要蛋白Gag晶格的結(jié)構(gòu).子斷層圖平均在該領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，將cryo-ET的分辨率降低至了2 nm以下［80］［圖4（B）］.此外，cryo-ET快速成像提出了一種新的病毒與宿主膜融合的模型，直接成像了血凝素的結(jié)構(gòu)中間體及其在膜融合過(guò)程中與膜相互作用的過(guò)程，以及伴隨膜融合過(guò)程中的病毒的超微結(jié)構(gòu)變化，揭示了病毒體的內(nèi)在化，并闡明了如何通過(guò)cryo-ET快速成像研究動(dòng)態(tài)膜過(guò)程［81］.

Fig.4 Some biological applications of cryo?ET

雖然大多數(shù)真核細(xì)胞很厚以至于無(wú)法通過(guò)cryo-ET進(jìn)行完全研究，但是，從細(xì)胞或組織中純化出來(lái)的真核細(xì)胞器通常足夠薄可以直接進(jìn)行cryo-ET成像.如利用cryo-ET直接研究來(lái)自李氏綜合征患者和正常人的培養(yǎng)成纖維細(xì)胞中的線(xiàn)粒體.通過(guò)對(duì)患者和正常人的線(xiàn)粒體的cryo-ET成像對(duì)照分析，發(fā)現(xiàn)ATP合成酶二聚體的損失會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體cr超微結(jié)構(gòu)的嚴(yán)重紊亂，揭示了ATP合成酶在調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體cr結(jié)構(gòu)中起到的關(guān)鍵作用［20］.此外，還通過(guò)cryo-ET成像技術(shù)與其它技術(shù)的結(jié)合獲得了迄今為止人類(lèi)核孔復(fù)合體最完善的三維模型［82］.

諸如突觸小體（保留大部分功能特征的神經(jīng)末梢）之類(lèi)的細(xì)胞部分也可以在快速冷凍后直接通過(guò)cryo-ET進(jìn)行研究.突觸小體的cryo-ET成像分析揭示了突觸間隙中存在的復(fù)雜的復(fù)合物，并揭示了突觸前細(xì)胞基質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其在神經(jīng)遞質(zhì)釋放中的作用［83］.對(duì)通過(guò)進(jìn)一步分離突觸小體獲得的突觸小泡進(jìn)行cryo-ET成像，揭示了新的內(nèi)吞突觸小泡的網(wǎng)格蛋白皮層的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以及皮層與小泡之間的相互作用.此外，由于神經(jīng)元細(xì)胞可以吸附在多孔碳膜支撐的金網(wǎng)上并鋪展開(kāi)來(lái)，樣品厚度滿(mǎn)足cryo-ET成像的要求，所以將cryo-ET與熒光顯微鏡聯(lián)用研究了海馬神經(jīng)元完整的興奮性和抑制性突觸，并直接觀察了處于原位狀態(tài)的突觸和大分子的三維結(jié)構(gòu)，提出了興奮性和抑制性突觸超微結(jié)構(gòu)的更新的觀點(diǎn)［84］［圖4（C）］.

某些黏附的真核細(xì)胞外圍的厚度也滿(mǎn)足cryo-ET成像的要求，如可以詳細(xì)分析片狀脂蛋白和絲狀偽足中的肌動(dòng)蛋白的骨架組織，并研究其在細(xì)胞黏附中的作用［85，86］.此外，還通過(guò)CEMOVIS對(duì)諸如肝臟、大腦或皮膚等哺乳動(dòng)物組織進(jìn)行了研究，但是與該技術(shù)有關(guān)的困難和外力造成的偽像使其無(wú)法廣泛應(yīng)用于組織樣品.

Cryo-ET可以相對(duì)容易地應(yīng)用于原核細(xì)胞.許多細(xì)菌都足夠薄，可以在快速冷凍后通過(guò)cryo-ET直接成像.大量研究已經(jīng)提供了有關(guān)細(xì)菌膜組織、內(nèi)部隔室、化學(xué)受體陣列或鞭毛運(yùn)動(dòng)的詳細(xì)結(jié)構(gòu)解析.如通過(guò)cryo-ET和子斷層圖平均得到了新月形芽孢桿菌的表層蛋白的結(jié)構(gòu)，并達(dá)到了0.74 nm的分辨率，該結(jié)構(gòu)與通過(guò)X射線(xiàn)晶體學(xué)得到的結(jié)構(gòu)一致.這項(xiàng)研究將X射線(xiàn)晶體學(xué)與cryo-ET以及亞納米分辨率的子斷層圖平均相結(jié)合，跨越了從原子到細(xì)胞的不同空間尺度［87］.此外，cryo-ET還可與定量質(zhì)譜結(jié)合用于檢測(cè)、計(jì)數(shù)和定位人類(lèi)病原體鉤端螺旋體細(xì)胞質(zhì)內(nèi)特定的蛋白質(zhì)復(fù)合物，描述了視覺(jué)蛋白質(zhì)組學(xué)的一種新穎的評(píng)分功能，并在實(shí)際條件下評(píng)估了這種評(píng)分功能的性能和準(zhǔn)確性，為鑒定和定位完整細(xì)菌內(nèi)部的大分子提供了驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)［圖4（D）］［88］.

3 總結(jié)與展望

以往，降低樣品復(fù)雜性可能是獲得大分子復(fù)合物高分辨結(jié)構(gòu)的必要步驟，但樣品制備、數(shù)據(jù)處理以及硬件方面的最新改進(jìn)使原位cryo-ET得以廣泛應(yīng)用，致使我們?cè)诔上襁^(guò)程中會(huì)獲得更多關(guān)于樣品細(xì)節(jié)的信息.此外，由于采用了更先進(jìn)的樣品制備技術(shù)（如FIB銑削），樣品的純化和分級(jí)分離已不再是必要的步驟.因此，可以在同一原位生理環(huán)境中以高分辨率對(duì)不同的生物分子及其相互作用的整個(gè)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行建模.盡管目前已經(jīng)取得了以上進(jìn)步，但cryo-ET仍有進(jìn)一步的改進(jìn)空間.

由于DED相機(jī)的發(fā)展在很大程度上提高了成像的分辨率，因此對(duì)其進(jìn)一步的改進(jìn)似乎更為重要.更高的相機(jī)像素密度、靈敏度及更快的幀讀取速度，將會(huì)進(jìn)一步減少樣品的輻射損傷進(jìn)而保留樣品的更多高分辨率信息.同時(shí)，硬件儀器的進(jìn)步將需要對(duì)控制顯微鏡和執(zhí)行圖像處理的軟件進(jìn)行改進(jìn).最近，Hagen等［89］提出了新的樣品臺(tái)傾轉(zhuǎn)方案，該方案可在低傾轉(zhuǎn)角附近對(duì)稱(chēng)地分配電子劑量，這進(jìn)一步減少了電子束對(duì)樣品的損壞，并可顯著改善所得斷層圖的數(shù)據(jù)質(zhì)量和分辨率.但是，對(duì)于子斷層圖平均，限制分辨率的主要因素仍然是圖像對(duì)齊.為了進(jìn)一步提高分辨率的極限，需要提出對(duì)齊傾轉(zhuǎn)系列圖像的新方案，例如可引入滲透進(jìn)入細(xì)胞的納米顆粒作為基準(zhǔn)標(biāo)記的物理方案，或研發(fā)可用于單個(gè)傾轉(zhuǎn)角度圖像降噪的軟件.隨著軟件和硬件的不斷進(jìn)步，原位cryo-ET的使用范圍將更廣泛，并將在接近原位的條件下提供更完整的細(xì)胞整體圖像.