海南島不同林齡短枝木麻黃凋落物內(nèi)外真菌多樣性分析

左林芝,黃 蕊,張雅倩,陳 盼,李 蕾

海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/教育部熱帶島嶼生態(tài)學(xué)重點實驗室,海口 571158

凋落物是森林系統(tǒng)中重要的組成部分,凋落物的降解是林地土壤養(yǎng)分的重要來源。大量文獻已表明,凋落物表面附著的微生物及其內(nèi)生菌則對凋落物的降解具有重要作用[1- 2]。另外,凋落物表面附著的微生物及其內(nèi)生菌與植物次生產(chǎn)物代謝密切相關(guān),林地土壤微生物受趨化作用在凋落物表面聚集[3],進而影響凋落物的降解及其產(chǎn)物合成,內(nèi)生菌則直接以聯(lián)合代謝的方式參與植物次生代謝產(chǎn)物的合成[4]。

海南島海防林是由短枝木麻黃(CasuarinaequisetifoliaL.)單一樹種構(gòu)成的純林,林下凋落物主要是木麻黃衰老死亡的枯枝。關(guān)于木麻黃凋落物的研究表明,木麻黃凋落物分解緩慢,對林地養(yǎng)分的貢獻較小[5]；而凋落物中的次生代謝產(chǎn)物則可通過淋溶等途徑進入土壤,并在土壤中積累,通過化感作用,抑制了自身種子或其他植物種子的萌發(fā)和幼苗生長[6- 8]。

目前關(guān)于木麻黃微生物的研究主要集中于木麻黃林地土壤微生物、植株內(nèi)生真菌的傳統(tǒng)分離、鑒定及其化感作用等方面[9-12],對凋落物微生物的組成及其群落演替特征則較少涉及,而此研究對于探討木麻黃林地微生物在凋落物的降解、化感物質(zhì)積累等方面的生態(tài)功能具有重要作用。因此,本研究通過Illumina Miseq高通量測序法分析不同林齡木麻黃凋落物內(nèi)外真菌的多樣性變化,比較不同林齡木麻黃凋落物內(nèi)外真菌群落結(jié)構(gòu)的差異,為探討微生物在木麻黃凋落物降解過程和次生產(chǎn)物代謝中的作用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

以海南省?？谑泄鹆盅箝_發(fā)區(qū)濱海的短枝木麻黃林為研究對象,該地(20.02°N,110.52°E)屬熱帶海洋季風(fēng)氣候,日照時間長,熱量豐富,年平均氣溫23.8℃。年降水量1500—2000 mm,平均相對濕度約85%,干、濕兩季分明,5—10月為多雨季。常年以東風(fēng)和東北風(fēng)為主,年平均風(fēng)速為3.4 m/s,6—10月為臺風(fēng)頻發(fā)期[13]。

1.2 樣品采集與預(yù)處理

2016年10月到研究樣地的幼齡林(林齡5—8年)、中齡林(林齡15—20年)和成熟林(林齡30年及以上)中,以“S型取樣法”選取15個樣點,采集5—15 cm厚度的木麻黃凋落物及林地土壤。將樣品充分混勻后裝入無菌袋,用冰盒帶回實驗室并置于-80℃冰箱中保存。收集并混勻洗滌凋落物后的無菌水檢測其外生真菌；用75%乙醇(1 min)、20% NaClO(10 min)和無菌水表面滅菌后檢測凋落物內(nèi)生真菌[14]。

1.3 凋落物內(nèi)外真菌測序

取適量預(yù)處理后的樣品,提取宏基因組DNA,采用真菌ITS區(qū)域作為目標DNA序列,以通用引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA- 3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC- 3′)進行PCR擴增并純化,進行熒光定量及Miseq文庫構(gòu)建后利用Illumina Miseq PE300平臺測序,測序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.4 凋落物和土壤樣品理化性質(zhì)測定

將凋落物和土壤樣品風(fēng)干,研磨后過1mm的篩,混勻備用。參照《土壤理化分析實驗指導(dǎo)》、《土壤分析技術(shù)規(guī)范》分析木麻黃凋落物和林地土壤理化性質(zhì)[15-16]。采用烘干法測定樣品含水率(WC)(GB 7833—1987)；電位測定法測定pH值(土液比1∶2.5)(GB 7859—1987)；凱氏定氮法測定全氮(TN)(GB 7173—1987)；KCl浸提-比色法測定銨態(tài)氮(AN)；酚二磺酸-比色法測定硝態(tài)氮(NN)；NaOH熔融-鉬銻抗比色法測定全磷(TP)(GB 7852—1987)；環(huán)刀法測定容重(BD)(GB 7844—1987)；重鉻酸鉀-消化爐加熱法測定有機質(zhì)(OM)(GB 7857—1987)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)overlap關(guān)系對Miseq測序得到的PE reads進行拼接,同時對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾,根據(jù)不同的相似度水平對所有序列進行OTU劃分,對97%相似水平下的OTU進行生物信息統(tǒng)計分析。利用Mothur軟件 (version v.1.30.1 http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity)計算凋落物內(nèi)外真菌Alpha多樣性(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Chao1指數(shù)),分析真菌群落的多樣性和豐富度[17- 19]。運用R程序和Mothur進行OTUs的維恩(Venn)分析,統(tǒng)計內(nèi)外真菌共有和特有OTU數(shù)?；趖ax_summary_a文件夾中的數(shù)據(jù)表,利用R語言工具作真菌群落柱形圖,統(tǒng)計各樣本在各分類水平上含有的真菌種類及比例。使用R v.2.15.2(統(tǒng)計計算的R基礎(chǔ)2)和純素包(2.0- 7版)生成真菌的分類分布熱圖。利用LEfSe軟件(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/root?tool_id=lefse_upload)根據(jù)分類學(xué)組成進行線性判別分析(LDA),找出對樣本差異具有顯著影響的菌群。采用QIIME (Quantitative Insights to microecology)軟件包1.9.1(Caporaso,J.G.,et al,2010)進行主坐標分析(PCoA)。使用軟件Canoco for Windows 4.5作RDA/CCA圖,分析凋落物真菌群落組成與環(huán)境因子的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 凋落物真菌群落多樣性與組成分析

2.1.1凋落物內(nèi)外真菌多樣性

3林齡木麻黃凋落物的18個樣品經(jīng)測序得到669,476條有效序列,其中凋落物內(nèi)生真菌分屬于6門23綱56目108科177屬255種,外生真菌分屬于5門21綱55目114科198屬293種。所有樣品的文庫覆蓋率均在99.6%以上,說明測序條數(shù)足以覆蓋凋落物樣品中絕大部分微生物,能夠反映絕大多數(shù)真菌信息(表1)。由Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Chao1指數(shù)看,木麻黃凋落物外生真菌的多樣性和豐富度高于內(nèi)生真菌。由3林齡的Chao1指數(shù)可看出,中齡林的豐富度高于幼齡林,成熟林最低。

表1 不同林齡木麻黃凋落物內(nèi)外真菌多樣性指數(shù)表

YDI：幼齡林凋落物內(nèi)生真菌,endophytic fungal communities of the litter in the young-aged forest；MDI：中齡林凋落物內(nèi)生真菌,endophytic fungal communities of the litter in the middle-aged forest；ADI：成熟林凋落物內(nèi)生真菌,endophytic fungal communities of the litter in the mature-aged forest；YDE：幼齡林凋落物外生真菌,epiphytic fungal communities of the litter in the young-aged forest；MDE：中齡林凋落物外生真菌,epiphytic fungal communities of the litter in the middle-aged forest；ADE：成熟林凋落物外生真菌,epiphytic fungal communities of the litter in the mature-aged forest；同一列中不同字母表示差異顯著(P≤0.05)

2.1.2凋落物內(nèi)外真菌的OTUs分析

對97%相似水平下的OUT進行Venn圖分析發(fā)現(xiàn)(圖1),木麻黃凋落物內(nèi)生真菌OTUs總數(shù)為644,外生真菌為841,其中,555個OTUs為凋落物內(nèi)、外真菌共有,分別占內(nèi)、外真菌總數(shù)的86.18%、65.99%,表明大多內(nèi)生真菌可能與外生真菌具有相同來源。從林齡上看,3林齡的共有OTUs數(shù)均遠多于特有OTUs,表明凋落物內(nèi)、外真菌群落差異由少數(shù)菌群決定,而特有的內(nèi)生真菌則可能由種子來源[20-21]。

圖1 不同林齡木麻黃凋落物內(nèi)外真菌Venn圖Fig.1 Venn diagram of endophytic and epiphytic fungi of C. equisetifolia litter at different ages YDI：幼齡林凋落物內(nèi)生真菌,endophytic fungal communities of the litter in the young-aged forest；MDI：中齡林凋落物內(nèi)生真菌,endophytic fungal communities of the litter in the middle-aged forest；ADI：成熟林凋落物內(nèi)生真菌,endophytic fungal communities of the litter in the mature-aged forest；YDE：幼齡林凋落物外生真菌,epiphytic fungal communities of the litter in the young-aged forest；MDE：中齡林凋落物外生真菌,epiphytic fungal communities of the litter in the middle-aged forest；ADE：成熟林凋落物外生真菌,epiphytic fungal communities of the litter in the mature-aged forest

2.1.3凋落物內(nèi)外真菌群落組成

不同林齡木麻黃凋落物真菌由6個門組成(圖2),擔子菌門(Basidiomycota)和子囊菌門(Ascomycota)在內(nèi)生真菌中比例較高,分別占44.19%、43.78%；子囊菌門在外生真菌中比例最高(占74.63%),尤其在幼林齡外生真菌中占優(yōu)勢。隨著林齡的增加,子囊菌門在內(nèi)外真菌中所占比例呈先減后增的趨勢,擔子菌門則相反。

在目分類水平上,3林齡凋落物內(nèi)生真菌共56目,外生真菌共55目,其中7個目為分類不明確目(圖2)。煤炱目(Capnodiales)和炭角菌目(Xylariales)為內(nèi)、外真菌共同優(yōu)勢目,糙孢孔目(Trechisporales)為內(nèi)生真菌最優(yōu)勢目,格孢腔菌目(Pleosporales)為外生真菌最優(yōu)勢目。另外,隨著林齡的增加,內(nèi)生真菌群落均勻度先降低后升高,外生真菌則相反。

結(jié)果還表明,Rozellomycota為內(nèi)生真菌特有菌門,且僅分布于中林齡凋落物內(nèi)部。從目水平看,Coniochaetales、Magnaporthales、未分類壺菌門和未分類Rozellomycota等4個目始終定殖于凋落物內(nèi)部,而蛙糞霉目(Basidiobolales)、絲孢酵母目(Trichosporonales)和未命名傘菌綱始終附生于凋落物外部。

圖2 不同林齡木麻黃凋落物內(nèi)外真菌在不同分類水平中的群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Community structure of fungi of C. equisetifolia litter at different classification levels

2.1.4凋落物內(nèi)外真菌PCoA分析

主坐標(PCoA)分析顯示不同樣本中97%相似性O(shè)TU的組成,反映木麻黃凋落物內(nèi)外真菌群落組成的相似性和差異性。本研究中PC1、PC2是造成樣品差異的兩個最大差異性特征,累計解釋了35.99%的真菌群落變化(圖3)。整體上看,凋落物外生真菌群落分布較內(nèi)生真菌集中,兩者分布區(qū)域有部分重疊,表明內(nèi)、外真菌群落結(jié)構(gòu)存在一定共性。幼、中林齡真菌群落結(jié)構(gòu)的分布區(qū)域有較大重疊,表明兩者的真菌群落組成較相似。大多數(shù)成熟林樣本在PC2軸上與幼、中林齡較遠,表明該林齡真菌群落組成與其他林齡有較大差異。

圖3 不同林齡木麻黃凋落物內(nèi)外真菌主坐標分析Fig.3 Principal co-ordinates analysis (PCoA) for endophytic and epiphytic fungal communities of the litter in differently aged C. equisetifolia forestsDEF：凋落物外生真菌,epiphytic fungal communities of the litter；DIF：凋落物內(nèi)生真菌,endophytic fungal communities of the litter；ADF：成熟林凋落物真菌,fungal communities of the litter in the mature-aged forest；MDF：中齡林凋落物真菌,fungal communities of the litter in the middle-aged forest；YDF：幼齡林凋落物真菌,fungal communities of the litter in the young-aged forest

2.2 真菌群落差異分析

2.2.1凋落物內(nèi)外真菌物種豐度分析

選取豐度排名前10的3林齡凋落物內(nèi)外真菌目,對樣本間的相對豐度進行聚類分析后得Heatmap圖(圖4)。糙孢孔目和未分類傘菌綱在內(nèi)生真菌中的豐度顯著高于外生真菌,煤炱目則相反。從林齡上看,未分類傘菌綱在中林齡凋落物內(nèi)部顯著富集,而外部豐度極低。糙孢孔目主要聚集在幼、中林齡凋落物內(nèi)部。傘菌目(Agaricales)在幼、中林齡凋落物內(nèi)部的豐度高于外部,成熟林則相反。相反地,木耳目(Auriculariales)在幼、中林齡凋落物內(nèi)的豐度低于外部,成熟林相反。

圖4 不同林齡木麻黃凋落物真菌在目水平上的物種豐度熱圖Fig.4 Heat maps of species abundance of endophytic and epiphytic fungi in differently aged C. equisetifolia forests at the order level

2.2.2凋落物內(nèi)外真菌LEfSe分析

通過LEfSe分析(LDA閾值為4)發(fā)現(xiàn),對3林齡間差異有顯著影響的內(nèi)生真菌有：幼林齡糙孢孔目、中林齡低孔菌科(Hyponectriaceae)(從科到屬)和成熟林肉杯菌科(Sarcoscyphaceae)(從科到屬)。對3林齡間差異有顯著影響的外生真菌有：幼林齡的叢赤殼屬(Nectria)、球腔菌科(Mycosphaerellaceae)和成熟林的扁孔腔菌科(Lophiostomataceae)(從科到屬)(圖5)。由物種豐度分析發(fā)現(xiàn),以上所述糙孢孔目和煤炱目的球腔菌科屬于木麻黃凋落物真菌群落優(yōu)勢物種。

圖5 不同林齡木麻黃凋落物內(nèi)外真菌LEfSe分析Fig.5 LDA Effect Size analysis (LEfSe) of endophytic and epiphytic fungal communities of the litter in differently aged C. equisetifolia forests

2.3 凋落物內(nèi)外真菌與凋落物、土壤理化性質(zhì)的RDA/CCA分析

研究分析了木麻黃凋落物內(nèi)外真菌群落結(jié)構(gòu)與凋落物、林地土壤含水率(WC)、pH值、全氮(TN)、銨態(tài)氮(AN)、硝態(tài)氮(NN)、全磷(TP)、有機碳(OC)、容重(BD)、全鉀(TK)、有機質(zhì)(OM)等理化性質(zhì)的相關(guān)性。結(jié)果表明,木麻黃凋落物內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)與凋落物pH值和有機碳有顯著相關(guān)性,與土壤理化因子關(guān)系不顯著；而外生真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤容重和銨態(tài)氮有顯著相關(guān)性,與凋落物理化性質(zhì)關(guān)系不顯著(圖6)。

在內(nèi)外真菌共同的優(yōu)勢目中,煤炱目與凋落物pH、全磷、全氮及土壤含水率相關(guān)；炭角菌目與凋落物pH和土壤全磷相關(guān)性較大；木耳目與凋落物pH、土壤銨態(tài)氮和容重相關(guān)性較大。傘菌目、糙孢孔目等內(nèi)生真菌特有優(yōu)勢目中,前者與凋落物全磷相關(guān)性較大,后者與凋落物含水率相關(guān)性較大。格孢腔菌目、肉座菌目(Hypocreales)等外生真菌優(yōu)勢目中,格孢腔菌目與土壤pH相關(guān)性較大,肉座菌目與凋落物全氮相關(guān)性較大(圖7)。

圖6 真菌群落與凋落物及土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析Fig.6 RedundancyAnalysis (RDA)/Canonical Correspondence Analysis (CCA) between fungal communities and the physicochemical property of the forest litter and soil pH：pH值；AN：銨態(tài)氮；NN：硝態(tài)氮；TN：全氮；TP：全磷；WC：含水率； OC：有機碳；BD：容重；TK：全鉀；OM：有機質(zhì)。黑色倒三角和黑色箭頭表示高豐度類群

圖7 優(yōu)勢真菌群落與凋落物及土壤理化性質(zhì)的RDA分析Fig.7 RDA analysis between dominant fungal communities and the physicochemical property of the forest litter and soil

3 結(jié)論與討論

3.1 凋落物內(nèi)外真菌群落組成

凋落物真菌多樣性分析表明,不同林齡木麻黃凋落物外生真菌多樣性和豐富度高于內(nèi)生真菌,這與Gang等的研究結(jié)果“植物根際真菌群落的多樣性高于根內(nèi)生真菌”相似[22]。凋落物內(nèi)、外真菌共有物種數(shù)目占較大比例,說明木麻黃凋落物內(nèi)、外真菌群落組成有較大共性,說明外生真菌群落來源部分由于菌群的趨化作用而聚集外[3],大部分可能來源于凋落物的降解。分析結(jié)果顯示,蛙糞霉目等3個目始終附生于凋落物外部,Coniochaetales 等4個目始終定殖于凋落物內(nèi)部,這些內(nèi)生真菌特有種可能來源于木麻黃種子或空氣環(huán)境[20-21,23],外生真菌特有種則可能是在凋落物降解過程中林地土壤真菌不斷向其轉(zhuǎn)移的結(jié)果。

不同林齡間,凋落物內(nèi)外真菌群落組成大多與木麻黃林齡無顯著相關(guān)性,可能表明木麻黃枝葉作為凋落物脫離母體后,植株對真菌的影響逐漸減弱,而受所處環(huán)境的影響逐漸增加。藍麗英等和徐璇等的研究表明,在凋落物分解過程中,土壤動物以選擇性牧食作用來調(diào)控微生物種群數(shù)量,其排泄物還可刺激微生物生長[24-25]。

3.2 凋落物內(nèi)外真菌優(yōu)勢物種

分析3林齡木麻黃凋落物內(nèi)外真菌群落的相似性和差異性發(fā)現(xiàn),子囊菌門和擔子菌門為最優(yōu)勢門,在目水平上,煤炱目、炭角菌目和木耳目為凋落物內(nèi)、外真菌共同優(yōu)勢目。據(jù)文獻報道,子囊菌門和擔子菌門在蘭科[26]、鐵皮石斛[27]和楊樹[28]等多種植物中為主導(dǎo)菌門,煤炱目、炭角菌目是植物中較為普遍的內(nèi)生真菌[29-30],與我們的研究結(jié)果一致。

前人研究還顯示,子囊菌門大多菌群可分解新鮮植物殘體[31],我們研究中,子囊菌門的格孢腔菌目、肉座菌目等為凋落物外生真菌的優(yōu)勢菌群,表明這些外生真菌優(yōu)勢物種可能在凋落物降解過程中起重要作用。

3.3 凋落物內(nèi)外真菌群落與環(huán)境因子的關(guān)系

RDA/CCA分析結(jié)果表明,凋落物內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)受凋落物pH值和有機碳顯著影響,而凋落物外生真菌群落結(jié)構(gòu)則與土壤容重和銨態(tài)氮顯著相關(guān)。說明宿主植物養(yǎng)分是內(nèi)生真菌群落組成的主要決定因素,而附著于凋落物表面真菌的生長則主要依賴土壤提供的養(yǎng)分。

前人的研究也表明,pH和有機質(zhì)對真菌群落組成具有重要影響[32-33],另外,總磷的增加導(dǎo)致真菌群落多樣性降低[34]。本研究發(fā)現(xiàn)與幼、中林齡相比,成熟林土壤全磷含量最高,而該林齡凋落物內(nèi)外真菌多樣性及豐富度均最低,表明較高的磷含量不利于真菌群落的生長。另外,中林齡凋落物真菌群落較幼、成林高,該林土壤有機質(zhì)、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮較幼、成林高,課題組前期的研究表明,中林土壤微生態(tài)環(huán)境適合植株生長[35],真菌群落在其中發(fā)揮著重要作用。