基于葉綠體DNA片段的槭屬雞爪槭組系統(tǒng)進(jìn)化和生物地理學(xué)研究

高 健,于 濤,李俊清,*

1 內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭師范學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院,包頭 014030 2 北京林業(yè)大學(xué)森林資源生態(tài)系統(tǒng)過程北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083

槭屬(AcerL.)是北半球地區(qū)僅次于櫟屬(QuercusL.)的第二大樹木屬,屬內(nèi)物種豐富(約124—200種),且廣泛分布于亞洲、歐洲及北美洲等地[1- 2]。東亞,特別是中國(guó)長(zhǎng)江流域及其以南地區(qū),是槭屬植物現(xiàn)代的多樣性中心[3]。雞爪槭組(sectionPalmataPax)是槭屬中物種多樣性最為豐富的分類組,組內(nèi)物種為多年生喬木或灌木,落葉或常綠[1]。雞爪槭組內(nèi)物種形態(tài)特征變化豐富,具有掌狀葉片從不裂(例如羅浮槭、濱海槭等)到3—13裂、葉邊緣從全緣到鋸齒、葉裂片從淺裂到深裂乃至全裂、花序類型多樣(圓錐花序、傘房花序等)及果實(shí)長(zhǎng)度變化較大(1—5 cm)等特征[2]。此外,雞爪槭組物種集中分布于東亞地區(qū)(除了AcercircinatumPursh.分布于北美),是東亞槭屬植物的代表類群[1- 2]。

雞爪槭組物種具有重要的生態(tài)價(jià)值和科研價(jià)值。例如雞爪槭(A.palmatumThunberg ex Murray)作為北溫帶廣泛分布的園藝觀賞樹種,其種內(nèi)人工選育出多種不同葉形及葉片顏色的雞爪槭變種、變型等,在園林造景、植被恢復(fù)等生態(tài)建設(shè)中發(fā)揮著重要的作用[4]。東亞地區(qū)作為雞爪槭組物種主要的分布區(qū),其地貌類型復(fù)雜多樣,且在末次冰期時(shí)未被大面積冰川所覆蓋,其生物地理歷史相較歐美地區(qū)來說更為復(fù)雜[5]。所以,雞爪槭組物種是了解東亞地區(qū)植物進(jìn)化歷史的一個(gè)代表性材料。因此,本文對(duì)雞爪槭組物種的起源、組內(nèi)物種的分化時(shí)間、物種的擴(kuò)散路徑等進(jìn)行了分析。該研究有助于了解雞爪槭組的進(jìn)化歷史,并為東亞地區(qū)植物的生物地理歷史提供了一個(gè)重要的范例。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取雞爪槭組內(nèi)18個(gè)物種(包含亞種),共27個(gè)個(gè)體作為研究材料(表1)。物種的鑒定與分類依據(jù)《Maples of the world》中的定義[2]。部分物種的序列于Genbank中下載得到(表1)。每個(gè)分類群選取1—3株個(gè)體,采集到的植物幼嫩葉片放入置有變色硅膠的取樣袋中干燥、備用。同時(shí),壓制憑證標(biāo)本,存放于內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭師范學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院。

1.2 DNA提取、PCR及測(cè)序

每份樣品取約0.2 g干燥葉片,全基因組DNA的提取使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN Beijing China)。依據(jù)本課題組前期對(duì)于雞爪槭高分辨率DNA條形碼的篩選結(jié)果,選取葉綠體基因片段psbA-trnH、rpl16和trnL-trnF作為本研究的遺傳片段[4]。葉綠體基因片段的PCR擴(kuò)增均在LabnetMultiGeneTM96-well Gradient Thermal Cycler上完成。PCR反應(yīng)體系為20 μL,包含DNA模板1 μL、Taq PCR Master Mix(萊楓,上海)10 μL、正反引物各1 μL(表2)、二次水(ddH2O)7 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s,52—58 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并純化后,送往北京生工生物工程股份有限公司在ABI3730XL遺傳分析儀上進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

序列通過ClustalX[11]進(jìn)行比對(duì),并使用BioEdit 7.1.11[12]進(jìn)行人工矯正。此外,對(duì)3個(gè)DNA片段的相容性進(jìn)行ILD檢測(cè)[13],1000次重復(fù)啟發(fā)式搜索后顯示片段間沒有顯著的沖突(P= 0.16)。故將3個(gè)片段合并后進(jìn)行后續(xù)的聯(lián)合分析。

金錢槭(DipteroniasinensisOliver)與云南金錢槭(DipteroniadyerianaHenry)在系統(tǒng)發(fā)育分析中作為外類群[14- 15]。最大似然法(ML)、最大簡(jiǎn)約法(MP)以及貝葉斯推理(BI)等分析分別使用PhyML 3.0[16]、PAUP*4.0b10[17]、MrBayes 3.2[18]進(jìn)行計(jì)算。最佳的取代模型通過Modeltest 3.7[19]進(jìn)行分析獲取。

表1 實(shí)驗(yàn)物種基本信息

表2 基因片段PCR擴(kuò)增的引物信息

1.4 分子定年及多樣性速率分析

采用BEAST v.1.8.2[20]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,并推測(cè)雞爪槭組物種間的分化時(shí)間。采用槭屬與金錢槭屬的分化時(shí)間(62 Mya)[21]和雞爪槭組的分化時(shí)間(27.99 Mya)[22]作為化石校準(zhǔn)點(diǎn)進(jìn)行分子定年。進(jìn)行1000000000次的MCMC模擬運(yùn)算,每100000筆運(yùn)算進(jìn)行一次取樣,總?cè)咏Y(jié)果的前2500次取樣不計(jì)入后續(xù)分析當(dāng)中。

通過隨機(jī)分枝過程(stochastic branching process,SBP)[23]繪制支系隨時(shí)間累積趨勢(shì)圖(lineages through time,LTT),采用reversible-jump馬爾可夫鏈蒙特卡爾(rjMCMC)模擬進(jìn)行貝葉斯非參數(shù)估計(jì)(Bayesian non-parametric estimation)[24]來評(píng)估多樣性速率。利用R語言的package APE[25]繪制LTT,并以APE中的mltt.plot功能,重新繪制以貝葉斯進(jìn)化分析軟件構(gòu)建的1000次取樣,以此來評(píng)估支系隨時(shí)間累積的偏差。rjMCMC分析進(jìn)行1000000次模擬,其中每1000次模擬提取1筆數(shù)據(jù),對(duì)前10%的不穩(wěn)定數(shù)據(jù)剔除后進(jìn)行后續(xù)分析。γ統(tǒng)計(jì)被用來通過時(shí)間評(píng)估多樣性速率的變異規(guī)律[26]。

1.5 祖先分布區(qū)重建

參考香茶菜屬(Isodon)[27]、芭蕉科(Musaceae)[28]等祖先分布區(qū)重建研究中,依據(jù)地形對(duì)亞洲地理區(qū)塊進(jìn)行劃分的方法,再結(jié)合本研究中雞爪槭組物種主要分布于東亞、東南亞的特點(diǎn),把雞爪槭組物種的分布區(qū)范圍主要?jiǎng)澐譃?個(gè)區(qū)塊：(A)中國(guó)華東、華中、華南、華北、東北部分地區(qū)及朝鮮半島；(B)中國(guó)西南及東南亞北沿地區(qū)(云貴高原、青藏高原等地)；(C)日本地區(qū)；(D)中國(guó)臺(tái)灣島。采用R語言中的BioGeoBEARS軟件包進(jìn)行雞爪槭組生物地理歷史的推測(cè)[29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA擴(kuò)增片段分析

序列比對(duì)后rpl16片段為909bp,含114個(gè)(12.5%)變異位點(diǎn)和74個(gè)(8.1%)有效信息位點(diǎn)；psbA-trnH片段為421bp,含72個(gè)(17.1%)變異位點(diǎn)和48個(gè)(11.4%)有效信息位點(diǎn)；trnL-trnF片段為902bp,含155個(gè)(17.1%)變異位點(diǎn)和109個(gè)(12.1%)有效信息位點(diǎn)。3個(gè)葉綠體DNA片段聯(lián)合后,矩陣長(zhǎng)度為2232bp,具有341個(gè)(15.2%)變異位點(diǎn)和231個(gè)(10.3%)有效信息位點(diǎn)。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

三種方法(ML,MP和BI)所構(gòu)建的物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系基本一致。18個(gè)雞爪槭組物種(包含亞種)的27個(gè)個(gè)體形成單系群(99/95/1.0)(節(jié)點(diǎn)A)(圖1)。稀花槭(A.pauciflorum)與濱海槭(A.sino-oblongum)的親緣關(guān)系較近(99/57/0.64)。在節(jié)點(diǎn)B中,藏南槭(A.campbellii)種下的4個(gè)亞種之間沒有歸并為單系群。此外,羽扇槭(A.japonicum)與雞爪槭(A.palmatum)被高度支持為單系群(96/94/1.0)；秀麗槭(A.elegantulum)與羅浮槭(A.fabri)間的親緣關(guān)系比較近(76/70/0.96)(圖1)。

圖1 基于rpl16,trnH-psbA以及trnL-F片段合并序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 The tree combined chloroplast rpl16,trnH-psbA and trnL-F regionsML、MP分析中自展值高于50%及BI分析中后驗(yàn)概率高于50%被依次標(biāo)于分枝上

2.3 分化時(shí)間及多樣性速率估計(jì)

分子定年得出的物種樹(圖2)與基因樹(圖1)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系基本一致。結(jié)果顯示：粗柄槭(A.tonkinense)較早從雞爪槭組分化而出；臨安槭(A.linganense)(浙江、安徽南)和飛蛾槭(A.sino-oblongum)(廣東沿海)兩個(gè)現(xiàn)代的局限分布種,分別約在19.92 Mya與15.58 Mya分化而來；12.42 Mya分化出雞爪槭與羽扇槭的共同祖先,進(jìn)而在4.18Mya分化出這兩個(gè)物種；五裂槭(A.oliverianum)與其亞種臺(tái)灣五裂槭(A.oliverianumsubsp.formosanum)的分化時(shí)間約為2.91 Mya；藏南槭在4.71 Mya開始其種內(nèi)亞種的分化(圖2b)。LTT結(jié)果顯示,雞爪槭組內(nèi)物種的多樣性速率保持相對(duì)穩(wěn)定(圖2a)。

圖2 雞爪槭組物種的支系隨時(shí)間累積趨勢(shì)(a)及基于3個(gè)葉綠體DNA片段構(gòu)建的雞爪槭組植物分子定年結(jié)果圖(b)Fig.2 The lineage-through-time (LTT) of Sect. Palmata (a) and Chronogram for Sect. Palmata reconstructed by three cpDNA sequences (b)

2.4 生物地理分析

通過BioGeoBears分析得出,進(jìn)行雞爪槭組生物地理分析的最佳模型是DEC模型(AIC=96.54,lnL=-45.92)。根據(jù)DEC模型的分析得出,A加B區(qū)域可能是雞爪槭組物種的祖先分布區(qū)(圖3)。此外,可能曾發(fā)生物種從亞洲大陸擴(kuò)散至周邊島嶼的情況,從而形成了日本特有種羽扇槭，我國(guó)臺(tái)灣特有種臺(tái)灣五裂槭以及目前分布于我國(guó)華南及臺(tái)灣地區(qū)的嶺南槭(A.tutcheri)(圖3)。

圖3 雞爪槭組植物祖先分布區(qū)重建Fig.3 The reconstruction of ancestral area for Sect. Palmata

3 討論與結(jié)論

3.1 組內(nèi)種間的系統(tǒng)位置

雞爪槭組內(nèi)物種(包含亞種)被高度支持為單系群(99/95/1.0)(圖1)[21,30]。在槭屬分類書籍《Maples of the world》中記載A.campbellii中有4個(gè)亞種,理論上應(yīng)當(dāng)形成單系群,但結(jié)果顯示這4個(gè)亞種分散在不同的分支中(圖1)。而在相對(duì)較新的分類學(xué)著作《Flora of China》中,這4個(gè)亞種被處理為4個(gè)獨(dú)立的物種,即：毛脈槭(A.campbelliisubsp.chekiangense)對(duì)應(yīng)A.pubinerve；三峽槭(A.campbelliisubsp.wilsonii)對(duì)應(yīng)A.wilsonii；扇葉槭(A.campbelliisubsp.flabellatum)對(duì)應(yīng)A.flabellatum；中華槭(A.campbelliisubsp.sinense)對(duì)應(yīng)A.sinense。此外,依據(jù)形態(tài)學(xué)證據(jù),4個(gè)物種也存在較明顯的差別。例如三峽槭葉片較其他3個(gè)物種(多為5裂,少7裂)來說多為3裂(少5裂),中華槭葉片較扇葉槭、毛脈槭(紙質(zhì)或膜質(zhì))來說近革質(zhì),扇葉槭子房與花盤較毛脈槭(有毛)來說無毛等等。從地理分布上分析可以得出,4個(gè)物種主要集中分布于長(zhǎng)江以南地區(qū),但三峽槭、扇葉槭側(cè)重分布于華南南部及西南地區(qū)(甚至延伸至越南、緬甸等地),而毛脈槭、中華槭側(cè)重分布于華南及華東南部等地。所以,基于本研究結(jié)果以及形態(tài)特征、地理分布等證據(jù)支持《Flora of China》的分類結(jié)果,即把這4個(gè)亞種分別作為獨(dú)立的物種進(jìn)行分類處理。此外,研究結(jié)果支持雞爪槭與羽扇槭間親緣關(guān)系較近(圖1)。

3.2 雞爪槭組的起源

雞爪槭組的起源時(shí)間約為28 Mya左右(漸新世中晚期)[22],且物種多樣性在中新世時(shí)出現(xiàn)大幅度的增加(圖2)。在漸新世中晚期至中新世,全球的氣候變暖致使南極冰川的覆蓋范圍縮小[31],且在中新世中期(17—15 Mya)出現(xiàn)了氣溫的高點(diǎn)[32]。Donoghue和Smith對(duì)66個(gè)物種間斷分布格局的形成進(jìn)行了總結(jié),得出絕大多數(shù)北溫帶森林物種在亞洲起源及物種多樣化,且中新世是物種多樣化的活躍期之一[33]。此外,在漸新世晚期至中新世初期,昆蟲出現(xiàn)了植食現(xiàn)象(insect herbivory),隨后昆蟲的物種多樣性在中新世得到了大大的提高[34]?？傊?氣候變化可能是影響雞爪槭組物種起源及多樣性增加的一個(gè)主要驅(qū)動(dòng)力。

通過雞爪槭組的生物地理分析得出,分布于我國(guó)廣西、貴州南部、西藏東南部、云南東南部以及馬來西亞、泰國(guó)、越南北部等地區(qū)的粗柄槭是組內(nèi)較為早期分化出的物種(圖3),也就是說雞爪槭組中相對(duì)較為原始物種的分布區(qū)位于我國(guó)西南部及東南亞北部。鄭維艷等指出我國(guó)西南部是亞熱帶常綠闊葉林許多科屬的保存中心、現(xiàn)代分布中心和分化中心,且亞熱帶常綠闊葉林植物區(qū)系可能起源于我國(guó)的西南部[35]。徐廷志曾提出槭樹科的起源地可能在我國(guó)橫斷山區(qū)附近[3,36],而雞爪槭組在槭屬中又被認(rèn)為是較原始的類群[3,21]。加上本研究結(jié)果支持雞爪槭組起源于A區(qū)域加B區(qū)域(圖3),所以有理由推斷雞爪槭組的起源地位于我國(guó)西南部地區(qū)。這也從側(cè)面支持了槭樹科起源于橫斷山區(qū)[3,36]及槭屬起源于亞洲的結(jié)論[22]。

3.3 雞爪槭組的生物地理歷史

雞爪槭組植物在進(jìn)化的歷程中,存在多次的生物地理事件。例如,雞爪槭與羽扇槭約在4.18 Mya出現(xiàn)分化(圖2)。雞爪槭的現(xiàn)代分布區(qū)域極廣,廣泛分布于中國(guó)、朝鮮半島及日本地區(qū),而羽扇槭作為雞爪槭最近緣的物種卻僅僅局限分布于日本。與之相類似的還有五裂槭(廣布種)與臺(tái)灣五裂槭(臺(tái)灣特有種),兩者的分化時(shí)間約在2.91 Mya(臺(tái)灣島形成時(shí)間約3—2 Mya)。兩組物種的分化可能與第四紀(jì)冰期(開始于3—2 Mya)有直接的聯(lián)系。第四紀(jì)冰期氣候的變化導(dǎo)致了中國(guó)東海海平面的抬升與降低,在海平面下降時(shí),亞洲大陸與日本、中國(guó)臺(tái)灣等島嶼之間形成了東海陸橋,為分布于該地區(qū)的生物提供了遷徙的走廊[37,38]。而且,在4—3 Mya左右時(shí),青藏高原的持續(xù)隆起[39],太平洋季風(fēng)增強(qiáng)帶來的豐沛降水[40]均對(duì)分布于東亞地區(qū)物種的擴(kuò)散和多樣化創(chuàng)造了客觀條件。所以,對(duì)于雞爪槭和五裂槭來講,由于兩物種較強(qiáng)的適應(yīng)能力,冰期時(shí)可能借由東海陸橋分別擴(kuò)散至日本島、中國(guó)臺(tái)灣島,而冰后期兩島嶼與亞洲大陸不再相連,地理隔離導(dǎo)致物種局地適應(yīng),而分別形成了現(xiàn)在的羽扇槭和臺(tái)灣五裂槭(圖3)。此外,依據(jù)中國(guó)植物志中的介紹,嶺南槭種下包含分布于我國(guó)華南地區(qū)的嶺南槭(原變種)與僅分布于中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)的小果嶺南槭[1],所以嶺南槭也可能曾借由東海陸橋進(jìn)行物種的遷徙(圖3)。

值得一提的是,縱觀雞爪槭組生物地理特征的結(jié)果,不難發(fā)現(xiàn)B區(qū)域物種是由A區(qū)域多次獨(dú)立擴(kuò)散而來的(圖3)。而且,B區(qū)域物種同一進(jìn)化分支中的姐妹種,多分布于A區(qū)域南部(亞熱帶地區(qū)),例如：稀花槭,秀麗槭,杈葉槭(A.ceriferum),中華槭等[1]。B區(qū)域多為高原地形,海拔較高,氣溫相對(duì)同緯度地區(qū)較低。所以,在周期性環(huán)境壓力的背景下(例如：冰期與間冰期),雞爪槭組物種為尋求合適生境,可存在多次往B區(qū)域擴(kuò)散的現(xiàn)象(圖3)。Qiu等通過對(duì)多種落葉闊葉林植物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),亞熱帶地區(qū)闊葉林存在局部地區(qū)高低海拔遷移的現(xiàn)象[38]。由此而言,雞爪槭組物種在進(jìn)化歷程中,可能存在方向性的擴(kuò)散過程。

綜上所述,可以推斷得出以下結(jié)論：(1)我國(guó)西南地區(qū)可能是雞爪槭組的起源地；(2)東海陸橋的隱沒與抬升可能影響著羽扇槭、臺(tái)灣五裂槭及嶺南槭等雞爪槭組物種的遷徙與擴(kuò)散過程；(3)分布于亞熱帶亞洲大陸的雞爪槭組物種,可能存在多次往同緯度高海拔地區(qū)擴(kuò)散的現(xiàn)象。

致謝：感謝臺(tái)灣師范大學(xué)生命科學(xué)系廖培鈞教授、黃秉宏博士在數(shù)據(jù)處理上的幫助。