不同母巖發(fā)育馬尾松土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)和豐度特征

趙 輝,周運超

1 貴州大學(xué)貴州省森林資源與環(huán)境研究中心/貴州省高原山地林木培育重點實驗室/林學(xué)院,貴陽 550025 2 銅仁學(xué)院,銅仁 554300

氮(N)在植物生長發(fā)育過程中具有不可替代的作用,它是合成植物體內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸的必需元素,同時其自身也參與植物信號的傳遞[1]。生物固氮是指將大氣中的N2轉(zhuǎn)化為可被植物吸收利用的含氮化合物的過程,每年大約有50%的大氣氮通過該途徑進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)[2]。生物固氮與具有生理功能的需氧和厭氧微生物密切相關(guān)[3]。目前,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)60多個屬的固氮微生物,主要包括固氮菌屬(Aztobacer)、固氮螺菌屬(Azospirillum)、假單孢菌屬(Pseudomonas)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)和脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)等[4]。固氮菌數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)對土壤固氮速率和氮循環(huán)有直接的影響,可作為衡量土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)[5]。生物固氮是由固氮酶催化,而固氮酶是一種能夠?qū)⒎肿拥€原成氨的酶,有兩個多亞基的金屬蛋白酶組成,分別為nifD,nifK基因編碼的鉬鐵蛋白和nifH基因編碼的鐵蛋白[6]。其中,nifH基因是系統(tǒng)進(jìn)化過程最古老的功能基因之一,在進(jìn)化過程中與16SrDNA保持一致[7]。因此nifH作為生物標(biāo)記基因被廣泛用于研究固氮微生物群落結(jié)構(gòu)[8]。

馬尾松(PinusmassonianaLamb.)是我國特有的針葉樹種之一,由于其適應(yīng)性強和耐干旱瘠薄等特點,廣泛分布于我國南方地區(qū),在我國生態(tài)環(huán)境建設(shè)和林業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[9]。因馬尾松屬于速生林,在生長過程中對土壤氮素的需求量較大。而目前在馬尾松生長的土壤環(huán)境中,有限的氮素利用率成為限制其林木速成豐產(chǎn)的關(guān)鍵因素[10]。對于很少有氮素施入的馬尾松林而言,生物固氮是維持馬尾松林生長的主要氮源,對馬尾松人工林速生豐產(chǎn)及地力維持具有重要作用。然而,由于馬尾松人工林主產(chǎn)區(qū)土壤母巖類型多樣,并且在造林過程中沒有做到因地經(jīng)營,因而導(dǎo)致大量低產(chǎn)林存在。因此,通過對不同母巖發(fā)育馬尾松土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)和豐度及其影響因素進(jìn)行研究,對了解母巖發(fā)育馬尾松土壤生物固氮及調(diào)節(jié)土壤氮素供應(yīng)具有極其重要的意義。

土壤母質(zhì)(巖)是巖石及礦物的風(fēng)化產(chǎn)物,決定著土壤的形成及發(fā)育,而不同母巖發(fā)育土壤自身養(yǎng)分的差異會引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化[11],并對植物生長發(fā)育有重要影響。相關(guān)研究認(rèn)為,土壤固氮微生物群落受到非生物和生物因素影響,非生物因子有土壤pH[12]、有效性氮[13]、土壤質(zhì)地[14]和土壤類型等[15]；生物因子有植被類型等[16],這些因素造成固氮微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性在不同母巖和植被下差異較大。目前,不同母巖發(fā)育土壤馬尾松人工林的研究主要集中在林木生長[17]、酶活性[18]和土壤養(yǎng)分[19]等方面。關(guān)于亞熱帶地區(qū)不同母巖發(fā)育馬尾松土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)、多樣性和豐度的研究未見報道。為此,本文運用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)對亞熱帶地區(qū)主要母巖發(fā)育馬尾松土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)及豐度進(jìn)行了研究,探討土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)和豐度在不同母巖發(fā)育土壤中的分布特征及其與土壤環(huán)境因子的關(guān)系,以揭示不同母巖發(fā)育土壤固氮能力及固氮菌生態(tài)功能,從固氮微生物角度來分析不同母巖土壤質(zhì)量狀況,為馬尾松人工林適地造林及速生豐產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況及試驗設(shè)計

研究區(qū)位于貴州大學(xué)造林生態(tài)園(106°40′42″E,26°25′41″N),海拔1100 m,屬于典型中亞熱帶季風(fēng)氣候,年相對濕度81%,年平均氣溫14.9℃,無霜期285 d左右,年平均日照總數(shù)為1274.2 h。

為盡量減少氣候和群落植被等外界環(huán)境因子差異對試驗造成的影響,采取了池栽試驗。選取貴州省馬尾松造林面積分布較廣泛的土體為研究對象,主要發(fā)育于四類母巖,分別為變余砂巖(Blastopsammite)、長石石英砂巖(Feldspathic quartz sandstone)、石英砂巖(Quartz sandstone)和玄武巖(Basalt)。四類母巖發(fā)育形成的土壤過1 cm篩后,分別裝入長×寬×深=5.0 m×1.2 m×0.5 m石框內(nèi)作為1個試驗小區(qū),每類母巖土壤重復(fù)3次,共計12個試驗小區(qū),每小區(qū)面積為6 m2。土壤基本情況見表1。于2014年4月向小區(qū)內(nèi)移栽生長發(fā)育良好且大小均一的1年生馬尾松實生苗木,每小區(qū)36株。試驗期間管理方式一致,均未施肥。

表1 不同土壤母巖土壤基本情況

1.2 樣品采集

2017年7月進(jìn)行土壤樣品采集。在每個試驗小區(qū)內(nèi)沿S形樣線用直徑5 cm土鉆均勻采取5個0—10 cm土壤樣品,混合成1個土樣,用低溫冰盒保存并迅速帶回實驗室。土樣在室內(nèi)去除石塊和植物根系等雜物并過2 mm篩后,最終分為三份,一份保存于-80℃冰箱,用于nifH基因群落結(jié)構(gòu)和豐度分析；一份4℃冰箱保存,用于土壤微生物生物量碳和氮測定；一份用于土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮測定,余下部分室內(nèi)風(fēng)干,過篩和研磨用于土壤化學(xué)指標(biāo)測定。

1.3 測定方法

1.3.1馬尾松株高和地徑測定

2017年7月對馬尾松株高和地徑進(jìn)行測定。株高采用鋼卷尺測定,地徑采用游標(biāo)卡尺測定。

1.3.2土壤化學(xué)性質(zhì)及微生物量碳氮測定

土壤化學(xué)性質(zhì)采用魯如坤方法測定[20]：土壤pH采用電位法；有機(jī)碳采用重鉻酸鉀氧化法；全氮采用凱氏定氮法；堿解氮采用堿解擴(kuò)散法；銨態(tài)氮采用靛酚藍(lán)比色法；硝態(tài)氮采用酚二磺酸比色法；速效磷采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法；速效鉀采用乙酸銨提取-火焰光度法。土壤微生物量碳和氮采用吳金水方法測定[21]：微生物量碳采用氯仿熏蒸-容量分析法,微生物量氮采取氯仿熏蒸-茚三酮比色法。

1.3.3土壤DNA提取及高通量測定

稱取0.5 g土壤,按照E.Z.N.A.? Soil DNAKit(Omega,GA,USA)試劑盒操作步驟提取土壤DNA。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性,用核酸定量儀(Nanodrop-NC2000)檢測DNA濃度和純度。

采用引物nifH-F(5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC- 3′)與nifH-R(5′-TTGTTSGCSGCRTACATS GCCATCAT- 3′)擴(kuò)增固氮菌nifH基因[22]。PCR體系(25 μL)：5×ExTaq緩沖液5.0 μL,dNPT(2.5 μmol/L)2.0 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL,DNA模板2.0 μL(1—10 ng),ExTaq(5 U/μL)0.25 μL,最后用超純水(ddH2O)補至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 3 min；94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,30個循環(huán)；72℃ 5 min。以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。樣品送至上海派森諾測序公司(Personalbio,China),運用Illumina MiSeq測序平臺進(jìn)行測序。

1.3.4nifH基因豐度測定

利用熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)檢測nifH基因拷貝數(shù),反應(yīng)在ABI7500熒光定量PCR儀(ABI,CA,USA)上進(jìn)行,反應(yīng)引物同1.3.3所示。反應(yīng)體系為：2×SYBR real-time PCR premixture(Bioteke,Beijing)10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,DNA模板1.0 μL(1—10 ng),最后用超純水(ddH2O)補至20 μL。熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 15 s,60℃ 30 s,40個循環(huán)。按照Poly方法[23],獲得含有nifH基因的重組質(zhì)粒,分別以10倍梯度稀釋基因重組質(zhì)粒得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算基因豐度,nifH豐度最終被計算為每克干土的拷貝數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用FLASH軟件對通過質(zhì)量初篩的雙端序列根據(jù)重疊堿基進(jìn)行配對連接,從而獲得每個樣本的有效序列。通過QIIME軟件調(diào)用USEARCH檢查并剔除嵌合體序列。將優(yōu)質(zhì)序列聚類成操作分類單元(Operational Taxonomic Unit,OTU),閾值設(shè)置為97%,并選取每個OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列。應(yīng)用RDP-classifier在GenBank中對OTU進(jìn)行分類注釋,統(tǒng)計各樣品門和屬水平上群落組成；使用QIIME軟件,對Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)進(jìn)行計算。

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件,通過單因素方差分析(one-way ANOVA,n=3,P<0.05)和多重比較檢驗四類母巖發(fā)育土壤化學(xué)性質(zhì)、馬尾松株高、地徑、固氮菌α多樣性指數(shù)、豐度和群落組成相對豐度的差異顯著性(P<0.05)；相關(guān)性分析用SPSS21.0和R軟件完成；固氮菌群落結(jié)構(gòu)聚類分析、非度量多維尺度分析(Non-metric multidimensional scaling,NMDS)和冗余分析(Redundancy analysis,RDA)用R軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬尾松株高和地徑

四類母巖馬尾松株高和地徑之間差異顯著(P<0.05)(圖1)。BL、FQS、QS和BA發(fā)育土壤下的馬尾松株高(地徑)分別為282.30 cm(2.78 cm)、292.93 cm(2.84 cm)、305.17 cm(3.05 cm)和340.83 cm(3.36 cm),其中BA土壤下馬尾松株高和地徑顯著高于BL和FQS(P<0.05)。由此可知,BA發(fā)育的土壤有利于馬尾松生長。

圖1 不同母巖發(fā)育土壤馬尾松株高和地徑Fig.1 Height and ground diameter of Pinus massoniana soils developed from different parent rocksBL：變余砂巖 Blastopsammite；FQS：長石石英砂巖 Feldspathic quartz sandstone；QS：石英砂巖 Quartz sandstone；BA：玄武巖 Basalt

2.2 土壤化學(xué)性質(zhì)和微生物量碳氮

不同母巖馬尾松土壤化學(xué)性質(zhì)如表2所示。四類母巖發(fā)育馬尾松土壤均呈弱酸性(pH<6.5),QS土壤pH最低為4.71,顯著低于其他母巖(P<0.05)。土壤有機(jī)碳、全氮和堿解氮含量均是BA最高,分別為28.34 g/kg、1.32 g/kg和168.54 mg/kg,并與其他母巖差異顯著(P<0.05)。BA土壤銨態(tài)氮含量最低,硝態(tài)氮含量最高,分別與其他母巖差異不顯著。BL土壤速效磷含量最高,速效鉀含量最低。

不同母巖土壤微生物量碳和氮差異顯著(P<0.05)(圖2),且微生物量碳含量高于微生物量氮。BL土壤微生物量碳含量顯著高于其他母巖(P<0.05),BA土壤微生物量碳含量最低,為147.13 mg/kg,但其土壤微生物量氮含量顯著高于其他母巖(P<0.05)。由此可知,不同母巖發(fā)育馬尾松土壤微生物量碳和氮呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。

表2 不同母巖發(fā)育馬尾松土壤化學(xué)性質(zhì)

2.3 固氮微生物nifH基因豐度

不同母巖馬尾松土壤固氮微生物nifH基因豐度差異顯著(P<0.05)。由圖3可見,四類母巖土壤nifH基因豐度范圍為0.19×105—1.5×105copies/g干土。BA土壤nifH基因豐度顯著高于其他三類母巖(P<0.05),而BL、FQS和QS之間差異不顯著(P>0.05),大小順序為BA>BL>QS>FQS。

圖2 不同母巖發(fā)育馬尾松土壤微生物量碳和氮 Fig.2 Microbial biomass carbon and nitrogen of Pinus massoniana soils developed from different parent rocks不同小寫字母表示不同處理間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)

圖3 不同母巖發(fā)育馬尾松土壤樣品nifH基因豐度 Fig.3 Abundance of nifH gene in Pinus massoniana soils developed from different parent rocks不同小寫字母表示不同處理間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)

為明確不同母巖土壤固氮微生物nifH基因豐度差異的影響因素,由nifH基因豐度與土壤化學(xué)性質(zhì)、馬尾松株高和地徑進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明(圖4),nifH基因豐度分別與土壤有機(jī)碳、全氮、堿解氮、微生物量氮含量和株高之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01),與地徑呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。可知,固氮菌數(shù)量與土壤氮素供應(yīng)和馬尾松生長之間關(guān)系密切。

圖4 群落多樣性指數(shù)、nifH基因豐度與土壤化學(xué)性質(zhì)、株高和地徑相關(guān)性Fig.4 Correlation between community diversity index,nifH gene abundance and soil chemical properties,Height,ground diameter*和**分別表示相關(guān)性顯著在P<0.05和P<0.01水平。SMBC：土壤微生物量碳 Soil microbial biomass carbon；SMBN：土壤微生物量氮 Soil microbial biomass nitrogen；H：株高 Height；Gd：地徑 Ground diameter；nifH：nifH基因豐度 Abundance of nifH gene；Chao1：Chao1指數(shù) Chao1 index；ACE：ACE指數(shù) ACE index；Simpson：辛普森指數(shù) Simpson index；Shannon：香農(nóng)指數(shù) Shannon index

2.4 固氮微生物測序結(jié)果和α多樣性

利用Illumina MiSeq平臺對固氮微生物nifH基因測序分析,BL、FQS、QS和BA土壤中獲得質(zhì)控后序列數(shù)分別為41338、34229、38223和45441條(表3)。把相似度水平≥97%的序列聚為一個操作分類單元(OTU),其中BA土壤含有的OTUs數(shù)最多(2206個),FQS土壤OTUs數(shù)最少(1471個)。由單因素方差分析可知(表3),不同母巖發(fā)育馬尾松土壤α多樣性指數(shù)差異顯著(P<0.05)。四類母巖土壤α多樣性指數(shù)變化趨勢一致,大小順序均為BA>BL>QS>FQS。說明BA發(fā)育馬尾松土壤固氮菌多樣性相對更為豐富。

相關(guān)性分析結(jié)果表明(圖4),Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)與土壤全氮呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。Simpson指數(shù)與土壤有機(jī)碳(r=0.651,P<0.05)和堿解氮(r=0.688,P<0.05)均呈顯著正相關(guān)關(guān)系；與全氮(r=0.709,P<0.01)和微生物量氮(r=0.750,P<0.01)呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。Shannon指數(shù)與土壤有機(jī)碳(r=0.791,P<0.01)、全氮(r=0.864,P<0.01)、堿解氮(r=0.814,P<0.01)和微生物量氮(r=0.808,P<0.01)均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系,與株高(r=0.594,P<0.05)和地徑(r=0.628,P<0.05)呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

表3 不同母巖發(fā)育馬尾松土壤固氮菌α多樣性

2.5 固氮微生物群落組成

通過對樣品獲得的OTUs進(jìn)行歸類,得到6個門、14個綱、41個目、69個科和122個屬。在門水平上,分別為變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和浮霉菌門(Planctomycetes)(圖5)。變形菌門和藍(lán)藻門為主要優(yōu)勢類群,相對豐度分別為84.05%—94.71%和0.57%—3.94%。藍(lán)藻門和疣微菌門在四類母巖發(fā)育馬尾松土壤之間差異極顯著(P<0.01),其中藍(lán)藻門相對豐度在BL土壤最高。變形菌門、厚壁菌門和放線菌門在四類母巖土壤之間差異顯著(P<0.05)。變形菌門相對豐度在BA土壤顯著高于其他母巖(P<0.05)；厚壁菌門相對豐度在FQS土壤最高(1.19%),QS土壤最低(0.02%)；放線菌門相對豐度在QS土壤最高(0.17%),FQS土壤最低(0.04%)；疣微菌門在QS土壤不存在；浮霉菌門僅在QS土壤存在,相對豐度為0.02%。

圖5 不同母巖發(fā)育馬尾松土壤固氮菌門和屬水平組成Fig.5 The nitrogen-fixing microbial community composition at the phylum and genus levels in Pinus massoniana soils developed from different parent rocks*P<0.05,**P<0.01

在屬水平上,將平均相對豐度<0.3%類群歸類為其他,得到20個類群(圖5)。其中,慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、眉藻屬(Calothrix)、根瘤菌屬(Rhizobium)和固氮螺菌屬(Azospirillum)為主要優(yōu)勢類群,相對豐度分別為65.13%—77.78%、0.26%—11.24%、1.14%—7.72%和1.71%—4.14%。慢生根瘤菌屬在四類母巖發(fā)育土壤之間差異顯著(P<0.05)。眉藻屬、根瘤菌屬和固氮螺菌屬在四類母巖發(fā)育土壤之間差異極顯著(P<0.01)。慢生根瘤菌屬和固氮螺菌屬相對豐度均在BA土壤最高；眉藻屬相對豐度在QS土壤最高,BA土壤最低；根瘤菌屬相對豐度在BL土壤最高,BA土壤最低。

2.6 固氮菌群落結(jié)構(gòu)及其與土壤化學(xué)性質(zhì)的關(guān)系

基于OTU層次聚類分析結(jié)果顯示(圖6),四類母巖發(fā)育馬尾松土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯,相同處理的3個重復(fù)都聚類在一起。NMDS分析進(jìn)一步證實了四類母巖發(fā)育馬尾松土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯(圖6)。四類母巖土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)在NMDS1和NMDS2發(fā)生明顯分離,分布在不同象限內(nèi)。其中,BA與FQS、BL和QS距離較遠(yuǎn),說明BA土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)與其他母巖差異較大；FQS和QS相距較近,說明這二類母巖發(fā)育土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高。

圖6 不同母巖土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)的層次聚類樹和NMDS分析Fig.6 Hierarchical clustering tree and nonmetric multidimensional scaling of the nitrogen-fixing microbial community structure in Pinus massoniana soils developed from different parent rocks

為進(jìn)一步分析土壤化學(xué)性質(zhì)對固氮菌群落結(jié)構(gòu)的影響,對固氮菌群落結(jié)構(gòu)與土壤化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行冗余分析(圖7)。結(jié)果表明,第1軸(A x i s 1)和第2軸(A x i s 2)分別解釋了46.99%和30.56%的變異,兩者累計解釋變異量為77.55%。由此可知,前兩軸能夠很好地反映土壤固氮菌群落組成與土壤化學(xué)成分之間的關(guān)系。土壤有機(jī)碳、全氮、堿解氮和微生物量氮對固氮菌群落有極顯著影響。

圖7 屬水平固氮菌群落和土壤化學(xué)性質(zhì)的冗余分析Fig.7 Redundancy analysis between the nitrogen-fixing microbial community structureat the genus level and soil chemical properties

3 討論

3.1 不同母巖發(fā)育馬尾松土壤對固氮菌豐度和多樣性的影響

土壤能夠為微生物生長提供所需養(yǎng)分,土壤養(yǎng)分的差異直接導(dǎo)致微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[24]。閆小莉和王德爐[25]研究認(rèn)為,土壤母巖對其發(fā)育土壤理化性質(zhì)有顯著影響。因此,母巖也將間接對土壤微生物種群數(shù)量和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要影響。本研究中四類母巖發(fā)育馬尾松土壤固氮菌豐度與α多樣性指數(shù)變化規(guī)律相同,均是玄武巖土壤顯著高于其他母巖。大量研究表明,土壤有機(jī)碳[26]、氮[27- 28]和根系分泌物[29]是影響nifH基因豐度的主要因素。Herbert[30]研究認(rèn)為,微生物固氮所需能量主要來源于土壤有機(jī)碳,每固定一分子氮將需要16個ATP。Coelho等[27]研究認(rèn)為,土壤氮含量增加將導(dǎo)致nifH基因豐度降低；然而Juraeva等[28]研究認(rèn)為,nifH基因豐度隨土壤氮含量增加而增加。楊亞東等[29]研究認(rèn)為,植物生長越旺盛,根系分泌物越多,越有利于固氮菌生長。Nelson和Mele[31]研究表明,土壤質(zhì)地對固氮菌數(shù)量影響較大,黏質(zhì)土壤比沙質(zhì)土壤具有更多的nifH基因豐度,與本研究結(jié)果相似。本研究中玄武巖土壤nifH基因豐度顯著高于其他母巖,這可能由于玄武巖土壤的有機(jī)碳和氮養(yǎng)分含量高,馬尾松生長快,根系分泌物代謝物較多,為固氮菌生長提供較多的碳源和氮源；而變余砂巖、石英砂巖和長石石英砂巖土壤養(yǎng)分含量低,不能為固氮菌生長提供充足的碳源和養(yǎng)分,因此造成固氮微生物數(shù)量較少。Huang等[32]研究認(rèn)為,植物會對土壤理化性質(zhì)產(chǎn)生直接或間接的影響。與栽種前相比,本研究中四類母巖馬尾松生長的土壤pH均有所下降,這可能由于馬尾松生長過程中根系分泌物或針葉在分解過程中產(chǎn)生酸性物質(zhì)所致。Silva等[33]研究認(rèn)為,土壤pH與nifH基因豐度有顯著相關(guān)性。然而,本研究中土壤pH與nifH基因豐度沒有顯著相關(guān)性,與楊亞東等[29]研究結(jié)果一致；但是土壤pH在不同母巖發(fā)育土壤之間差異顯著,因此土壤pH可能通過改變土壤理化性質(zhì)[34],間接對固氮菌數(shù)量產(chǎn)生一定影響。

微生物α多樣性指數(shù)是評價土壤微生物群落多樣性的重要指標(biāo),多樣性指數(shù)越高表明微生物群落豐富度和多樣性越高,土壤肥力越高,土壤生態(tài)環(huán)境越穩(wěn)定[35]。Chao1或ACE指數(shù)越大,表明群落豐富度越高。Simpson和Shannon指數(shù)越高表明群落多樣性越高。周燕等[36]研究認(rèn)為,固氮微生物多樣性與植物凋落物和根系分泌物關(guān)系密切。本研究表明,玄武巖土壤固氮菌α多樣性指數(shù)均顯著高于其他母巖,表明玄武巖土壤固氮菌的豐富度和多樣性較高,可能由于馬尾松生長較快,凋落物和根系分泌物增多,導(dǎo)致養(yǎng)分歸還和轉(zhuǎn)化速率加快[37],土壤可利用養(yǎng)分含量增加,有利于固氮微生物生長繁殖。本研究結(jié)果進(jìn)一步佐證了土壤肥力(養(yǎng)分)增高可促進(jìn)土壤微生物多樣性升高的論點[38]。石英砂巖和長石石英砂巖馬尾松由于生長緩慢,凋落物和根系分泌物較少,限制了固氮菌生長,因而導(dǎo)致固氮微生物豐富度和多樣性指數(shù)較低。

本研究中土壤有機(jī)碳、全氮和堿解氮與nifH基因豐度和多樣性指數(shù)之間呈顯著正相關(guān)性關(guān)系,進(jìn)一步表明不同母巖發(fā)育馬尾松土壤有機(jī)碳、全氮和堿解氮含量差異是影響固氮菌數(shù)量和多樣性的重要因素。有研究表明土壤氮素含量是微生物生長的限制因子,其與微生物數(shù)量和群落組成關(guān)系密切[39]。然而,本研究中土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量與固氮菌豐度和多樣性指數(shù)并無顯著相關(guān)性,這和何冬華[40]等研究結(jié)果一致,說明土壤環(huán)境因子對固氮菌的影響較為復(fù)雜。

3.2 固氮菌群落與土壤質(zhì)量之間的關(guān)系

固氮菌群落組成對土壤地力維持和植物生長有重要影響[41]。Poly等[23]研究表明,土壤類型和養(yǎng)分狀況對固氮菌群落結(jié)構(gòu)影響較大。本研究中四類母巖土壤優(yōu)勢門和屬類群相似,但不同母巖中優(yōu)勢類群相對豐度存在顯著差異(圖5)；層次聚類和NMDS分析也表明,四類母巖發(fā)育土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)分離明顯,因此母巖對土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響。本研究中變形菌門和藍(lán)藻門是主要優(yōu)勢類群,且在不同母巖發(fā)育土壤中差異顯著。相關(guān)研究認(rèn)為,變形菌門廣泛分布于土壤中且有較高的相對豐度,屬于異養(yǎng)型微生物,具有嗜營養(yǎng)特點,與土壤有機(jī)碳含量關(guān)系緊密,可用來指示土壤肥力狀況[42- 43]。Anderson等[44]研究表明,植物可以增強母巖土壤風(fēng)化速率和促進(jìn)養(yǎng)分釋放。玄武巖土壤在有機(jī)碳含量高和馬尾松生長旺盛共同作用下促進(jìn)變形菌門菌群生長,導(dǎo)致變形菌門相對豐度顯著高于其他母巖。其中,慢生根瘤菌屬相對豐度在玄武巖土壤最高；然而眉藻屬相對豐度在玄武巖土壤最低；可知變形菌門中不同屬群對相同環(huán)境因子的響應(yīng)存在差異,具有各自的生態(tài)位。藍(lán)藻門為水生環(huán)境中優(yōu)勢固氮類群,在濕潤環(huán)境下生長較好[45- 46]。目前,關(guān)于藍(lán)藻門對氮固定的貢獻(xiàn)大小一直未達(dá)成共識[47]。Beversdorf等[48]研究認(rèn)為藍(lán)藻門對氮固定的貢獻(xiàn)較大,然而Ferber等[49]研究認(rèn)為藍(lán)藻門對氮的固氮在整個環(huán)境氮庫中貢獻(xiàn)較小。本研究中藍(lán)藻門相對豐度在玄武巖土壤最低,變余砂巖土壤最高；可能是由于玄武巖土壤為砂質(zhì)粘壤土[19],土壤透水好,抑制了藍(lán)藻門固氮菌的生長；變余砂巖土壤為壤質(zhì)粘土[19],土壤透水性差,且7月雨水較多,土壤易于板結(jié)和積水,有利于其生長繁殖；同時變余砂巖土壤藍(lán)藻門相對豐度高導(dǎo)致銨態(tài)氮含量較高,然而銨態(tài)氮含量與其他母巖差異不顯著,可見藍(lán)藻門在變余砂巖土壤中可能對氮固定的貢獻(xiàn)不大。厚壁菌門具有寡營養(yǎng)特點,同時分泌大量有害物質(zhì),干擾植物正常氮素代謝,不利于植物生長[13]。厚壁菌門相對豐度在長石石英砂巖土壤最高,因此推測長石石英砂巖馬尾松生長緩慢可能與該菌群有關(guān)。疣微菌門極富生態(tài)多樣性,對環(huán)境耐受能力強,具有降解烴類能力[50]。在馬尾松生長過程中,疣微菌門固氮的同時所降解的烴類物質(zhì)可能是馬尾松所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,次級代謝產(chǎn)物的積累將不利于其生長[51]。本研究中疣微菌門相對豐度在玄武巖和長石石英砂巖土壤較高,變余砂巖土壤較少,石英砂巖土壤未檢測到。因此,不同母巖發(fā)育土壤中疣微菌門的減少或消失,可能也是抑制馬尾松生長的一個重要因素。

本研究發(fā)現(xiàn),土壤有機(jī)碳、全氮、堿解氮和微生物量氮是固氮菌群落結(jié)構(gòu)的主要影響因素。Orr等[52]研究也認(rèn)為土壤有機(jī)碳和氮對固氮菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響,同時有機(jī)碳、全氮和堿解氮相互之間有顯著相關(guān)性；由此可知,固氮菌群落結(jié)構(gòu)可能由幾個關(guān)聯(lián)性較強的化學(xué)指標(biāo)共同進(jìn)行調(diào)控。綜上所述,玄武巖土壤有機(jī)碳、全氮、堿解氮和微生物量氮顯著高于其他母巖,土壤肥力較高,有利于馬尾松生長,對優(yōu)化固氮菌群落結(jié)構(gòu)和促進(jìn)土壤氮固定具有重要作用。今后研究中需要開展相應(yīng)的野外試驗,與池栽試驗進(jìn)行相互印證；同時對參與馬尾松凋落物分解和拮抗致害真菌等重要微生物功能類群進(jìn)行深入的研究,有利于進(jìn)一步解釋不同母巖發(fā)育馬尾松土壤質(zhì)量差異的微生物機(jī)理,為馬尾松適地造林提供充分的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

四類母巖土壤固氮菌(nifH)基因豐度和群落α多樣性指數(shù)差異顯著,表現(xiàn)為玄武巖>變余砂巖>石英砂巖>長石石英砂巖。變形菌門和藍(lán)藻門相對豐度占到固氮菌總量的87.99%—95.29%,是四類母巖土壤共有的優(yōu)勢群落,其中玄武巖土壤所占比例最高。厚壁菌門和疣微菌門通過自身代謝產(chǎn)物對馬尾松生長具有重要影響。土壤有機(jī)碳、全氮和堿解氮是影響四類母巖土壤固氮菌豐度、群落結(jié)構(gòu)和α多樣性的主要因素。因此,馬尾松在不同母巖發(fā)育土壤栽種時,應(yīng)根據(jù)母巖特性采取有效措施,改善土壤養(yǎng)分狀況,優(yōu)化土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu),提高土壤固氮能力,實現(xiàn)人工林速生豐產(chǎn)及可持續(xù)經(jīng)營。