尿激酶聯(lián)合低分子肝素對(duì)急性肺栓塞大鼠炎性反應(yīng)及肺血流動(dòng)力學(xué)的影響研究

孟燕，潘龍飛，馬強(qiáng)，龐宏剛

急性肺栓塞（acute pulmonary embolism，APE）是因內(nèi)源性或外源性栓子堵塞肺動(dòng)脈所致的肺循環(huán)障礙，主要臨床表現(xiàn)為呼吸困難、胸痛、咯血三聯(lián)征，并可引發(fā)肺動(dòng)脈高壓、右心衰竭、梗阻性休克、循環(huán)衰竭甚至死亡［1］?？鼓委熍c溶栓治療是APE患者的有效治療方法，二者均能迅速疏通阻塞的肺血管，改善肺血流動(dòng)力學(xué)，進(jìn)而改善全身血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)并減輕呼吸功能障礙［2］。低分子肝素（low molecular weight heparin，LMWH）、尿激酶（urokinase，UK）是臨床治療APE的常用藥物，但具體作用機(jī)制尚未完全明確［3］。研究表明，APE是一種炎癥浸潤(rùn)性疾病，可導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓持續(xù)升高、肺血流動(dòng)力學(xué)改變［4-5］。本研究采用自體血栓栓塞法制備APE大鼠動(dòng)物模型，旨在分析UK聯(lián)合LMWH對(duì)其炎性因子、肺血流動(dòng)力學(xué)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2018—2019年，選取80只健康雄性SD大鼠，12周齡，體質(zhì)量260～300 g，平均體質(zhì)量（282.4±10.3）g，均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（陜）2018-001。飼養(yǎng)條件：12 h/12 h明暗交替，溫度20～22℃，濕度50%～60%。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2020-238）。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備、藥物及試劑

1.2.1 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備 低溫高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)），電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)），小動(dòng)物心電監(jiān)護(hù)儀及肺動(dòng)脈漂浮導(dǎo)管和測(cè)壓設(shè)備（成都泰盟軟件有限公司生產(chǎn)），血?dú)夥治鰞x（美國(guó)Osmetech公司生產(chǎn)），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus生產(chǎn)）。

1.2.2 主要藥物與試劑 UK（南京南大藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：20200204），LMWH選擇依諾肝素鈉注射液〔賽諾菲（北京）制藥有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：8S13N〕。白介素1β（IL-1β）、白介素8（IL-8）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒均購(gòu)自北京晶美生物工程有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 將80只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（Sham）組、APE組、LMWH組、UK組及LMWH+UK組，每組16只。

1.3.2 模型制備 除Sham組外，其他組大鼠均采用自體血栓栓塞法制備APE大鼠動(dòng)物模型，具體方法如下：取大鼠尾靜脈血0.2 ml靜置，70 ℃水浴10 min，制成0.6 mm×0.8 mm的自體血栓，采用0.9%氯化鈉溶液洗滌，而后加入0.9%氯化鈉溶液2 ml并置于4 ℃環(huán)境下備用。腹腔注射20%烏拉坦（6 ml/kg）麻醉大鼠，沿頸前正中線(xiàn)作一2 cm切口，鈍性分離頸外靜脈，插入導(dǎo)管并迅速注入20～30個(gè)血栓（注栓速度為0.5 ml/s）。Sham組不注入血栓栓子，僅注入等量0.9%氯化鈉溶液。

1.3.3 建模成功標(biāo)準(zhǔn) 注入血栓后，可見(jiàn)大鼠呼吸深快，心率增加，雙耳、唇發(fā)紺，偶見(jiàn)抽搐，雙肺可聞及濕啰音；心電監(jiān)護(hù)可見(jiàn)血氧飽和度下降；肺動(dòng)脈壓先升高后降低，隨后再持續(xù)升高，肺動(dòng)脈收縮壓升高至40～60 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），且維持30 min無(wú)變化，提示APE大鼠模型制備成功［6-8］。

1.3.4 干預(yù)方法 模型制備成功后，LMWH組大鼠皮下注射依諾肝素鈉注射液0.01 ml/kg，1次/12 h，用藥至處死大鼠時(shí)。UK組大鼠靜脈滴注UK 20 000 U/kg，維持治療1 h［7-8］。UK+LMWH組大鼠靜脈滴注UK 20 000 U/kg、維持治療1 h；之后皮下注射依諾肝素鈉注射液0.01 ml/kg，1次/12 h，用藥至處死大鼠時(shí)。Sham組、APE組大鼠靜脈滴注等量0.9%氯化鈉溶液。術(shù)后各組大鼠均自由進(jìn)食、進(jìn)水，干預(yù)8、72 h后每組分別處死8只大鼠，留取血液及肺組織備用。

1.4 觀(guān)察指標(biāo)

1.4.1 炎性因子 分別于干預(yù)8、72 h時(shí)取大鼠血清2 ml，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清炎性因子水平，包括IL-1β、IL-8、TNF-α。

1.4.2 肺血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)及血?dú)庵笜?biāo) 分別于干預(yù)8、72 h時(shí)腹腔注射20%烏拉坦麻醉大鼠，分離右側(cè)頸外靜脈，插入聚苯乙烯管進(jìn)肺動(dòng)脈、右心房、右心室，連接小動(dòng)物心電監(jiān)護(hù)儀，檢測(cè)平均肺動(dòng)脈壓（mPAP）、右心室壓力（RVP）；取右頸動(dòng)脈血2 ml，使用血?dú)夥治鰞x檢測(cè)動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）及動(dòng)脈血二氧化碳分壓（PaCO2）。

1.4.3 肺組織病理學(xué) 分別于干預(yù)8、72 h時(shí)處死大鼠，取右肺組織標(biāo)本，甲醛固定48 h，常規(guī)石蠟切片、HE染色，顯微鏡下觀(guān)察各組大鼠肺組織病變情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 炎性因子 干預(yù)8、72 h，各組血清IL-1β、IL-8、TNF-α水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù) 8、72 h，APE組血清IL-1β、IL-8、TNF-α 水平高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù)8、72 h，LMWH組和UK組血清IL-1β、IL-8、TNF-α水平高于Sham組，但低于A(yíng)PE組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù)8 h UK+LMWH組血清IL-1β水平低于A(yíng)PE組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)72 h UK+LMWH組血清IL-1β水平高于Sham組，但低于A(yíng)PE組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù)8 h UK+LMWH組血清IL-8水平低于A(yíng)PE組和LMWH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)72 h UK+LMWH組血清IL-8水平高于Sham組，但低于A(yíng)PE組、LMWH組、UK組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù)8、72 h，UK+LMWH組血清TNF-α水平高于Sham組，但低于A(yíng)PE組、LMWH組、UK組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表1）。

2.2 肺血流動(dòng)力學(xué)及血?dú)庵笜?biāo) 干預(yù)8、72 h，各組mPAP、RVP、PaO2比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各組PaCO2比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)8、72 h，APE組mPAP、RVP高于Sham組，但PaO2低于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù)8、72 h，LMWH組和UK組mPAP、RVP高于Sham組，但低于A(yíng)PE組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù)8、72 h，LMWH組和UK組PaO2低于Sham組，但高于A(yíng)PE組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù)8 h UK+LMWH組mPAP高于Sham組，但低于A(yíng)PE組和LMWH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)72 h UK+LMWH組mPAP高于Sham組，但低于A(yíng)PE組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。UK+LMWH組干預(yù)8 h RVP低于A(yíng)PE組和LMWH組，干預(yù)72 h RVP低于A(yíng)PE組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù)8 h UK+LMWH組PaO2低于Sham組，但高于A(yíng)PE組和LMWH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)72 h UK+LMWH組PaO2高于A(yíng)PE組、LMWH組及UK組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表2）。

表1 各組大鼠干預(yù)8、72 h血清炎性因子水平比較（±s，ng/L）Table 1 Comparison of serum levels of inflammatory factors in each group 8 and 72 hours after intervention

表1 各組大鼠干預(yù)8、72 h血清炎性因子水平比較（±s，ng/L）Table 1 Comparison of serum levels of inflammatory factors in each group 8 and 72 hours after intervention

注：Sham=假手術(shù)，APE=急性肺栓塞，LMWH=低分子肝素，UK=尿激酶，IL-1β=白介素1β，IL-8=白介素8，TNF-α=腫瘤壞死因子α；與Sham組比較，aP＜0.05；與APE組比較，bP＜0.05；與LMWH組比較，cP＜0.05；與UK組比較，dP＜0.05

組別 只數(shù) IL-1β IL-8 TNF-α干預(yù)8 h 干預(yù)72 h 干預(yù)8 h 干預(yù)72 h 干預(yù)8 h 干預(yù)72 h Sham 組 8 27.21±4.41 27.04±4.39 437.92±18.64 442.25±20.79 174.30±12.00 177.92±9.75 APE 組 8 37.79±4.64a 44.71±5.05a 527.39±21.19a 646.05±17.14a 262.66±12.41a 340.29±14.41a LMWH 組 8 32.63±4.61ab 35.28±5.17ab 471.32±18.58ab 496.04±13.64ab 224.08±16.14ab 246.35±18.62ab UK 組 8 31.82±4.36ab 34.26±4.06ab 462.11±13.45ab 485.63±15.38ab 223.63±15.05ab 244.81±14.67ab UK+LMWH 組 8 28.59±4.51b 31.95±5.21ab 450.80±14.39bc 464.67±13.65abcd 193.35±15.14abcd 210.02±17.47abcd F值 6.667 14.513 31.093 194.017 44.894 126.504 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 肺組織病理學(xué) 干預(yù)8、72 h，Sham組大鼠肺組織與血管內(nèi)皮細(xì)胞、管壁正常。APE組、LMWH組、UK組、UK+LMWH組大鼠肺組織均可見(jiàn)肺動(dòng)脈栓塞。APE組大鼠肺泡可見(jiàn)大量滲出，肺泡間隔增厚，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。LMWH組、UK組、UK+LMWH組大鼠肺泡滲出、肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)輕于A(yíng)PE組。UK+LMWH組肺泡滲出、肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)輕于LMWH組、UK組，詳見(jiàn)圖1。

3 討論

APE是臨床常見(jiàn)疾病，其發(fā)病率為（100～200）/10萬(wàn)，病死率位居各類(lèi)心血管疾病第三位［9］，其治療原則為迅速疏通阻塞的肺血管并預(yù)防新血栓形成［10］。溶栓治療與抗凝治療是經(jīng)循證證據(jù)證實(shí)的治療APE的有效方法，二者能迅速溶解血栓、改善肺血流動(dòng)力學(xué)、恢復(fù)肺組織灌注、降低病死率，且二者聯(lián)合應(yīng)用效果明顯優(yōu)于單純抗凝治療［11］，但具體作用機(jī)制尚不十分清楚。有研究表明，APE發(fā)生后局部炎性反應(yīng)是導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓持續(xù)升高及肺血流動(dòng)力學(xué)障礙加重的原因之一［4-5］，因此減輕炎性反應(yīng)是APE的重要治療措施。本研究旨在探討UK聯(lián)合LMWH對(duì)APE大鼠炎性反應(yīng)及肺血流動(dòng)力學(xué)的影響。

圖1 各組大鼠干預(yù)8、72 h肺組織病理學(xué)（HE染色，×100）Figure 1 Pathology of lung tissue in each group 8 and 72 hours after intervention

表2 各組大鼠干預(yù)8、72 h肺血流動(dòng)力學(xué)及血?dú)庵笜?biāo)比較（±s，mm Hg）Table 2 Comparison of pulmonary hemodynamics and blood gas indexes in each group 8 and 72 hours after intervention

表2 各組大鼠干預(yù)8、72 h肺血流動(dòng)力學(xué)及血?dú)庵笜?biāo)比較（±s，mm Hg）Table 2 Comparison of pulmonary hemodynamics and blood gas indexes in each group 8 and 72 hours after intervention

注：mPAP=平均肺動(dòng)脈壓，RVP=右心室壓力，PaO2=動(dòng)脈血氧分壓，PaCO2=動(dòng)脈血二氧化碳分壓；與Sham組比較，aP＜0.05；與APE組比較，bP＜0.05；與LMWH組比較，cP＜0.05；與UK組比較，dP＜0.05

組別 只數(shù) mPAP RVP PaO2 PaCO2干預(yù)8 h 干預(yù)72 h 干預(yù)8 h 干預(yù)72 h 干預(yù)8 h 干預(yù)72 h 干預(yù)8 h 干預(yù)72 h Sham 組 8 15.42±2.53 15.36±2.19 38.24±3.10 38.32±2.41 95.80±2.12 95.72±2.34 42.39±4.72 42.22±4.41 APE 組 8 30.52±3.06a 25.48±2.97a 50.94±3.00a 47.16±3.75a 75.43±3.38a 77.14±3.90a 44.76±4.24 44.38±4.74 LMWH 組 8 23.32±2.91ab 20.03±3.30ab 46.93±3.07ab 42.07±2.45ab 82.18±3.13ab 86.46±2.85ab 43.60±4.10 43.36±3.97 UK 組 8 21.40±3.24ab 19.38±3.82ab 44.77±3.03ab 41.59±2.74ab 84.84±3.40ab 88.23±3.60ab 42.46±4.11 42.55±3.97 UK+LMWH 組 8 19.37±2.46abc 18.65±3.34ab 41.46±4.08bc 40.95±3.43b 87.22±3.28abc94.85±2.46bcd 41.44±3.38 41.22±4.15 F值 30.584 10.656 17.795 9.170 46.050 47.181 0.763 0.625 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.556 0.648

本研究結(jié)果顯示，干預(yù)8、72 h，APE組大鼠肺泡可見(jiàn)大量滲出，肺泡間隔增厚，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且APE組血清IL-1β、IL-8、TNF-α水平均高于Sham組，提示APE啟動(dòng)了復(fù)雜的炎性反應(yīng)，分析其原因可能與受損的血管內(nèi)皮或肺上皮細(xì)胞激活局部炎性反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致IL-1β、IL-8、TNF-α過(guò)度釋放有關(guān)；而上述炎性因子又可增加肺泡毛細(xì)血管通透性，進(jìn)而影響氣體交換并導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生低氧血癥［12-13］。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)8、72 h，LMWH組和UK組血清IL-1β、IL-8、TNF-α水平均高于Sham組，但低于A(yíng)PE組，提示LMWH和UK均能有效減輕APE大鼠炎性反應(yīng)，分析其機(jī)制主要如下：LMWH作為肝素和凝血因子X(jué)結(jié)合的五糖衍生物，可通過(guò)抑制凝血因子X(jué)和細(xì)胞間黏附分子1、阻斷T細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)等途徑而發(fā)揮抗炎作用［14］；而UK作為從健康人新鮮尿液中提取的蛋白消解酶，能直接作用于內(nèi)源性纖維蛋白系統(tǒng)，通過(guò)催化裂解纖溶酶、降解凝血因子、解除肺動(dòng)脈栓塞等途徑而間接拮抗炎性因子的釋放［15-16］。本研究結(jié)果還顯示，干預(yù)8 h UK+LMWH組血清IL-8水平低于LMWH組，干預(yù)72 h UK+LMWH組血清IL-8水平低于LMWH組、UK組，干預(yù)8、72 h UK+LMWH組血清TNF-α低于LMWH組、UK組，提示LMWH聯(lián)合UK對(duì)APE大鼠炎性反應(yīng)的抑制作用優(yōu)于單用LMWH及UK，分析其原因可能為UK與LMWH聯(lián)用發(fā)揮協(xié)同作用，繼而可更有效地抑制炎性反應(yīng)，改善肺栓塞病理生理過(guò)程。

肺血流動(dòng)力學(xué)障礙是APE的主要病理生理特征，可表現(xiàn)為肺動(dòng)脈壓持續(xù)升高、肺血管灌注減少和換氣功能障礙等［17-18］，其中栓子堵塞是其主要原因。而LMWH除具有抗凝、阻止繼發(fā)性血栓形成作用外，還能抑制內(nèi)皮素1、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)，可修復(fù)受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞、拮抗APE后肺血管重構(gòu)［7，19］。UK能直接或間接作用于纖溶酶原，降解纖維蛋白原、凝血因子，進(jìn)而發(fā)揮溶栓作用；此外其還能提高血管二磷酸腺苷酶活性，抑制血小板聚集、預(yù)防血栓形成［20-21］，但其t1/2較短（20～30 min），有停藥后血栓復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，故其與LMWH聯(lián)用能增強(qiáng)機(jī)體纖溶酶活性、減緩血栓形成速度，進(jìn)而降低肺動(dòng)脈高壓發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［22-23］。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)8、72 h，APE組mPAP、RVP高于Sham組，但PaO2低于Sham組，提示APE后機(jī)體存在肺血流動(dòng)力學(xué)障礙和低氧血癥，分析其原因主要為：高濃度炎性因子聚集除可加劇心肌組織損傷、誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡、導(dǎo)致心室功能損傷外，還可激活凝血系統(tǒng)，誘導(dǎo)血管損傷與血栓形成［24］，進(jìn)而導(dǎo)致右心功能損傷及血栓性肺動(dòng)脈高壓［25］。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)8、72 h，LMWH組和UK組mPAP、RVP低于A(yíng)PE組，PaO2高于A(yíng)PE組，提示單用LMWH、UK可有效降低APE大鼠肺動(dòng)脈壓力，改善肺血流動(dòng)力學(xué)、矯正低氧血癥，分析其原因可能與LMWH、UK能抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，干預(yù)8 h UK+LMWH組mPAP和RVP低于LMWH組，PaO2高于LMWH組；干預(yù)72 h UK+LMWH組PaO2高于LMWH組及UK組，提示LMWH聯(lián)合UK對(duì)APE大鼠肺血流動(dòng)力學(xué)及換氣功能的改善效果優(yōu)于單用LMWH及UK，與既往研究結(jié)果一致［26-27］。

綜上所述，UK聯(lián)合LMWH能有效減輕APE大鼠炎性反應(yīng)，改善肺血流動(dòng)力學(xué)及換氣功能，且效果優(yōu)于單用UK及LMWH；但本研究觀(guān)察時(shí)間較短，且未進(jìn)一步闡述UK聯(lián)合LMWH減輕炎性反應(yīng)、改善肺血流動(dòng)力學(xué)的分子機(jī)制。

作者貢獻(xiàn)：孟燕、潘龍飛進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，研究的實(shí)施與可行性分析，結(jié)果的分析與解釋?zhuān)⑦M(jìn)行論文的修訂；孟燕、馬強(qiáng)、龐宏剛進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；孟燕撰寫(xiě)論文，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理；潘龍飛負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。