內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬肝癌SMMC-7721細(xì)胞模型的復(fù)制及金剛藤的干預(yù)

凌江紅,周芬敏,陳珺明,郭錦榮,上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院中醫(yī)科 上海市 200021

凌江紅,上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院消化科 上海市 200021

文一惠,廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科 廣西壯族自治區(qū)南寧市530021

0 引言

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)是一個(gè)真核生物維持細(xì)胞生存的重要的呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器.在某些生理及病理情況下,ER功能紊亂,細(xì)胞為維持自身穩(wěn)態(tài),發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)[1],進(jìn)而激活自噬[2].ERS-自噬是一種重要的細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制,維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài),能夠促進(jìn)細(xì)胞的生存,增加腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的耐藥性[3-5].研究表明[6],肝癌細(xì)胞內(nèi)存在ERS的活化.金剛藤具有利濕去濁、祛風(fēng)除痹、解毒散瘀的功效.金剛藤對(duì)多種實(shí)體腫瘤具有一定療效[7,8],課題組前期研究發(fā)現(xiàn)金剛藤具有良好的抗肝癌作用[9].本研究運(yùn)用ERS誘導(dǎo)劑二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)誘導(dǎo)人肝癌SMMC-772細(xì)胞ERS-自噬,并觀察金剛藤對(duì)DTT誘導(dǎo)的ERS-自噬SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響,旨在深入探討金剛藤抗肝癌的作用.

1 材料和方法

1.1 材料 SPF級(jí)SD大鼠購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證編號(hào)為SCXK(滬)2018-0004,雌雄不限,鼠齡8-10 wk,共8只.大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn),喂養(yǎng)期間大鼠自由進(jìn)食、水.人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株由上海中科院細(xì)胞庫(kù)提供.將SMMC-7721細(xì)胞按1×106個(gè)/板接種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基,于37 ℃、5%CO2、恒溫恒濕條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),1-2 d換液傳代1次.待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn).中藥金剛藤購(gòu)自廣西民族醫(yī)藥研究所,產(chǎn)地廣西,批號(hào)為161201,由桂林鼎康中藥飲片有限公司生產(chǎn).DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗混合液、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司.DTT購(gòu)自中國(guó)Solarbio公司.Apoptosis Detection Kit購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司.細(xì)胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):復(fù)蘇存活下來(lái)的SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,細(xì)胞接種106個(gè)/板.培養(yǎng)基為DMEM+10%FBS+1%雙抗,37 ℃、5%CO2恒溫恒濕的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).1-2 d換液傳代備用.

1.2.2 ERS-自噬模型的建立:實(shí)驗(yàn)分組及處理方法:取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SMMC-7721細(xì)胞按DTT不同濃度分為50、200、500 μmol/L組,同時(shí)設(shè)DTT 0 μmol/L為control組,將細(xì)胞按80%的匯合度接種到6孔板,每孔2 mL,細(xì)胞數(shù)量為2 × 105個(gè)/孔,培養(yǎng)基為DMEM+10%FBS+1%PS,每組3個(gè)復(fù)孔.置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜,次日分別更換不同濃度(0、50、200、500 μmol/L)培養(yǎng)基稀釋的DTT,置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h.

Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白表達(dá):將上述細(xì)胞去除培養(yǎng)基,PBS清洗兩遍,去除PBS后,加入100 μl含PMSF的裂解液,4 ℃裂解30 min.裂解完后,12000 r/min、4 ℃離心10 min,取上清,用BCA法測(cè)定蛋白濃度.以20 μg總蛋白上樣,行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜,用含5%脫脂奶粉封閉1 h.置于1×TBST緩沖液中,于搖床上緩慢洗滌3次,5 min/次.然后移入一抗β-actin (1:5000)、LC3-Ⅱ(1:1000),置于4 ℃孵育過(guò)夜.次日洗膜后加入二抗(羊抗兔1:50000)中,室溫?fù)u床孵育2 h.PBST洗3次,每次5 min,顯色.用Image軟件對(duì)每個(gè)條帶灰度值進(jìn)行分析.

1.2.3 透射電鏡觀察自噬小體:將細(xì)胞離心棄上清,加入電鏡固定液固定,50%、70%、80%、90%乙醇梯度脫水,丙酮置換,浸漬、包埋、切片,用醋酸雙氧鈾染色10 min后清洗,用透射電鏡檢測(cè).

1.2.4 金剛藤對(duì)ERS-自噬肝癌細(xì)胞模型增殖能力的影響:金剛藤水煎液及含藥血清的制備:(1)金剛藤水煎液的制備:200 g金剛藤飲片,加水至高出藥物表面2 cm處,浸泡2 h武火煮沸后改用文火煎煮30 min,冷卻,過(guò)濾取汁(濾液1),濾渣如上法再煎2次,得到濾液2,濾液3,混合3次得到的藥液,濃縮至100 mL,得到2 g/mL的藥液,4 ℃保存?zhèn)溆? (2)含藥血清的制備:SPF級(jí)SD大鼠8只,隨機(jī)分為空白組(control組)、金剛藤組(JGT組)、每組4只;JGT組以2 g/mL的金剛藤水煎液灌胃4 mL,control組給予等體積生理鹽水灌胃,每天灌胃2次、間隔12 h,連續(xù)給藥3 d; 末次給藥1 h后以CO2窒息法處死小鼠,心臟取血,靜置后離心15 min取血清,合并同組血清,過(guò)濾、滅活除菌后得到含藥血清,-80 ℃凍存?zhèn)溆?

實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SMMC-7721細(xì)胞分為control組、JGT-L組、DTT+JGT組,用DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL,加入96孔培養(yǎng)板、每孔0.1 mL,在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜,待細(xì)胞貼壁70%-80%時(shí),棄去細(xì)胞培養(yǎng)液.Control、JGT組分別加入空白含藥血清和金剛藤含藥血清分別培養(yǎng)12 h.DTT+JGT組則予DTT 500 μmol/L孵育24 h后更換金剛藤含藥血清繼續(xù)培養(yǎng)12 h.

CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率:每組重復(fù)6個(gè)副孔,每孔分別加入10 μL的CCK-8,繼續(xù)置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h.用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處各孔的光密度值(OD值),計(jì)算細(xì)胞的存活率,存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件.計(jì)量資料以mean ± SD表示,多組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 SMMC-7721細(xì)胞ERS模型的建立

2.1.1 各組SMMC-7721細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá):與contorl組比較,各濃度處理組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)均顯著升高(P均＜0.05).與200 μmol/L組比較,500 μmol/L組LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)顯著升高(P＜0.05,表1,圖1).

2.1.2 各組細(xì)胞自噬小體的檢測(cè):DTT干預(yù)各組細(xì)胞內(nèi)均可見(jiàn)自噬小體(如箭頭所示),并且隨著DTT濃度的增加,自噬小體數(shù)量逐漸增加,DTT 500 μmol/L組可見(jiàn)大量自噬小體(圖2).

2.2 金剛藤對(duì)ERS肝癌細(xì)胞模型存活率的影響JGT、DTT+JGT組細(xì)胞存活率均顯著低于control組(P＜0.05); JGT組細(xì)胞存活率顯著低于DTT+JGT組(P＜0.05,表2).

3 討論

ER是存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),具有調(diào)控細(xì)胞生理功能和維持細(xì)胞生存的作用,是細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)合成后進(jìn)行正確折疊和翻譯后修飾的重要細(xì)胞器,維持著細(xì)胞生存及功能,在某些情況下,如鈣穩(wěn)態(tài)失衡、氧化應(yīng)激、感染等導(dǎo)致ER功能紊亂,致未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白堆積,則引發(fā)ERS[10].研究表明,在多種實(shí)體腫瘤中,腫瘤細(xì)胞快速增殖,使得腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)的過(guò)程中,普遍存在缺血、缺氧的情況[11]; 此外,腫瘤細(xì)胞的快速增殖,需要合成大量蛋白質(zhì),這便可能有部分蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤或者未折疊產(chǎn)生并堆積[12].有研究發(fā)現(xiàn),肝癌患者肝癌細(xì)胞ERS是被激活的[6].DTT是一種ERS誘導(dǎo)劑,可阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基的氧化,干擾蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase,PDI)在蛋白質(zhì)二硫鍵形成中的催化作用,導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊的蛋白大量堆集,從而誘發(fā)ERS[13].Cheng等[14]成功利用DTT復(fù)制癌細(xì)胞ERS模型.嚴(yán)冬梅等[15]等運(yùn)用DTT誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞ERS,并觀察了SMMC-7721細(xì)胞ERS狀態(tài)下組蛋白的表達(dá).

圖 1 各組SMMC-7721細(xì)胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ的表達(dá).LC3-Ⅱ:微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ.

自噬系統(tǒng)是真核生物細(xì)胞蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)之一[16].ERS可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[2,17].本研究發(fā)現(xiàn),不同濃度DTT(50、200、500 μmol/L)處理SMMC-7721細(xì)胞24 h后,細(xì)胞中的自噬小體增多,以DTT 500 μmol/L組更為明顯.微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3),參與了自噬體的形成.自噬時(shí),微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅰ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅰ,LC3-Ⅰ)轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3-Ⅱ,LC3-Ⅱ附著在自噬體膜上,是自噬體結(jié)構(gòu)蛋白,蛋白活性與細(xì)胞自噬水平呈正相關(guān),是自噬發(fā)生的標(biāo)志[18].本研究運(yùn)用不同濃度DTT 處理SMMC-7721細(xì)胞24 h,觀察到DTT可顯著上調(diào)SMMC-7721細(xì)胞中自LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá),隨著DTT濃度的增加,LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)增加,DTT 500 μmol/L組LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)最高,與Control組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.由此可見(jiàn),DTT可誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞ERS-自噬的發(fā)生.

無(wú)限增殖是惡性腫瘤細(xì)胞的重要特征之一,許多抗癌藥物都是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用.課題組前期用MMT法檢測(cè)10種壯藥含藥血清對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制情況,觀察到金剛藤、藤梨根、葉下珠、半枝蓮的含藥血清具有較好的抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖的作用,其中金剛藤對(duì)SMMC-7721細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)[9],課題組另一項(xiàng)研究表明金剛藤能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡,將其阻滯于S期,機(jī)制可能與下調(diào)癌基因POLD1的表達(dá)有關(guān)[19].本研究選用CCK-8法檢測(cè)金剛藤對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響,觀察到金剛藤可以抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖,與課題組前期研究結(jié)果相一致.有研究表明[5],ERS-自噬對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用是腫瘤細(xì)胞化療藥物耐藥的重要原因之一.ERS-自噬可抑制化療藥物順鉑抗人肝癌HepG2細(xì)胞的作用[20].本研究結(jié)果顯示,DTT+JGT組對(duì)SMMC-7721細(xì)胞抑制作用較Control組強(qiáng)(P＜0.05),但較JGT組弱(P＜0.05),提示DTT誘導(dǎo)的ERS-自噬,增加了SMMC-7721細(xì)胞對(duì)金剛藤的抵抗性,使SMMC-7721細(xì)胞在金剛藤的干預(yù)下細(xì)胞存活率的抑制作用減弱.

4 結(jié)論

綜上所述,DTT可誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞ERS-自噬,金剛藤可抑制SMMC-7721細(xì)胞的存活率,DTT誘導(dǎo)的ERS-自噬可抵抗金剛藤抑制SMMC-7721細(xì)胞的存活率.由此推測(cè),抑制ERS-自噬在化療藥物耐藥方面可能具有潛在的應(yīng)用價(jià)值.

表1 各組SMMC-7721細(xì)胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ的表達(dá)(mean ± SD,n=3)

表2 各組SMMC-7721細(xì)胞存活率的比較(mean ± SD,n=3)

圖2 各二硫蘇糖醇處理組SMMC-7721細(xì)胞的自噬情況.A:Control組; B:DTT 50 μmol/L組; C:DTT 200 μmol/L組; D:DTT 500 μmol/L組.DTT:二硫蘇糖醇.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

肝癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤,死亡率位居世界第2位.金剛藤具有抑制肝癌細(xì)胞的作用,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)-自噬的保護(hù)作用能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞生存,因而探尋肝癌細(xì)胞ERS-自噬對(duì)金剛藤抑制肝癌細(xì)胞作用的影響具有重要意義.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

臨床治療肝癌主要采用手術(shù)及化療的方法,但大部分確診患者已失去手術(shù)機(jī)會(huì),而化療存在副作用大且易產(chǎn)生耐藥性.中醫(yī)藥治療肝癌具有療效穩(wěn)定且副作用小的特點(diǎn),因而探尋金剛藤抗肝癌細(xì)胞的深層機(jī)制對(duì)于其臨床運(yùn)用及新的研究方向具有重要指導(dǎo)意義.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

探討二硫蘇糖醇(Dithiothreitol,DTT)誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞ERS-自噬及金剛藤的干預(yù)。

實(shí)驗(yàn)方法

ERS-自噬模型的復(fù)制:DTT處理SMMC-7721細(xì)胞,采用透射電鏡觀察自噬小體和Western blot法檢測(cè)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)蛋白的表達(dá).金剛藤的干預(yù):運(yùn)用金剛藤干預(yù)ERS-自噬肝癌SMMC-7721細(xì)胞模型,采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的存活率.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

DTT能夠誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞ERS-自噬; DTT誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的ERS-自噬可抵抗金剛藤抑制SMMC-7721細(xì)胞的存活率.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

DTT可誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞ERS-自噬,且DTT誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的ERS-自噬可抵抗金剛藤抑制SMMC-7721細(xì)胞的存活率.

展望前景

抑制ERS-自噬在化療藥物耐藥方面可能具有潛在的應(yīng)用價(jià)值.