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    剛竹屬3個(gè)竹種根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)

    2020-11-11 00:12:16況小寶曾慶南黃思遠(yuǎn)盧玉生
    世界竹藤通訊 2020年5期
    關(guān)鍵詞:竹根竹種毛竹

    李 怡 程 平 余 林 況小寶 曾慶南 黃思遠(yuǎn) 盧玉生

    (江西省林業(yè)科學(xué)院 南昌 330013)

    植物根際微生物參與植物與土壤間的物質(zhì)循環(huán),因此其對(duì)于植物生長(zhǎng)以及土壤生態(tài)環(huán)境有著十分重要的意義[1]。根際微生物能夠通過分泌激素來調(diào)控植物生長(zhǎng)代謝,此外它們也可通過多種方式抵御根際有害微生物[2]。植物的根際通過產(chǎn)生分泌物逐漸改變土壤的理化性質(zhì),進(jìn)而影響根際微生物群落結(jié)構(gòu),提高植物的抗逆性[3-5]。每種植物都能形成其特異性的根際微生物群落,特別是菌根菌、固氮菌等一些與植物聯(lián)系較為緊密的微生物[6-7]。李菁等[8]研究發(fā)現(xiàn),3種杓蘭屬植物菌根真菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著,且指示物種互不相同;葉文雨等[9]研究發(fā)現(xiàn),2種菌草根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也有較明顯的差異。植物物種間的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)距離越大,根際微生物群落組成差異就越顯著[10],如農(nóng)澤梅等[11]研究發(fā)現(xiàn)不同甘蔗品種的根際細(xì)菌群落主要差異表現(xiàn)在優(yōu)勢(shì)菌屬豐度上。Hartmann等[12]研究幾種豆科植物發(fā)現(xiàn),豌豆與羽扇豆根際微生物群落結(jié)構(gòu)相似,而與蠶豆卻有顯著差異。

    江西省林科院竹種園的竹林成林后施肥量低,土壤微生物群落結(jié)構(gòu)因施肥所產(chǎn)生的影響較小,故本研究選擇竹種園內(nèi)生長(zhǎng)情況良好的剛竹屬竹種,以毛竹、雷竹以及黃稈烏哺雞竹這3個(gè)竹種的根際土壤作為研究對(duì)象,采用Illumina Hi Seq高通量測(cè)序方式對(duì)3個(gè)竹種的根際微生物群落進(jìn)行分析,通過比較3種不同竹種的根際微生物群落的差異,為竹種專用微生物菌肥的開發(fā)與利用提供研究基礎(chǔ)。

    1 試驗(yàn)地概況

    研究試驗(yàn)地位于江西省林業(yè)科學(xué)院竹種園,地處28°44′41′′N,115°48′46′′E,屬亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)型氣候,年平均氣溫19 ℃,年平均降雨量1 713.5 mm。試驗(yàn)地為紅壤土,土層厚60 cm以上,pH值約4.1~5.0,有機(jī)質(zhì)含量2.0%~3.5%。成林后每年施復(fù)合肥50 kg/667 m2、尿素25 kg/667 m2。林分密度為6 100~9 300株/hm2。

    2 研究材料與方法

    2.1 研究材料

    2019年12月,在江西省林業(yè)科學(xué)院竹種園采集毛竹(Phyllostachysedulis)、雷竹(Ph.praecox)和黃稈烏哺雞竹(Ph.vivaxf.aureocaulis)的根際土壤樣品,挖取15~20 cm左右竹鞭根,用鑰匙將附在根上刮下的土視為根際土壤(剝落分離法)[13],分別標(biāo)記為毛竹(MR)、雷竹(LR)、黃稈烏哺雞竹(JR),以附近非竹林土壤作為空白對(duì)照(YK)。采樣當(dāng)天將土樣帶回實(shí)驗(yàn)室,過2 mm篩后,置于-80 ℃冰箱保存,供檢測(cè)使用。

    2.2 土壤樣品測(cè)定

    1) DNA提取。取0.5 g土壤樣品,用試劑盒提取土壤樣品總DNA。

    2) 土壤細(xì)菌、真菌序列的PCR擴(kuò)增及測(cè)序。以各土壤樣品微生物總DNA為模板對(duì)細(xì)菌16S rRNA V3+V4區(qū)域、nifH功能區(qū)域及真菌ITS1區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。委托上海派森諾生物科技有限公司對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量分析測(cè)序。

    2.3 數(shù)據(jù)處理

    對(duì)序列按相似性≥97%水平進(jìn)行歸類操作及OTU劃分,篩選OTU的代表序列。對(duì)OTU結(jié)果應(yīng)用QIIME軟件計(jì)算土樣的Alpha多樣性,再利用R語言工具繪制群落結(jié)構(gòu)圖。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 3個(gè)竹種根際土壤微生物OTU水平

    在3個(gè)竹種根際土壤總DNA的16S rDNA V3+V4區(qū)得到656 203條有效序列,在ITS1區(qū)得到1 225 304條有效序列。

    基于相似性≥97%的水平,對(duì)樣品的細(xì)菌及真菌有效序列進(jìn)行聚類,如圖1。通過聚類,從3個(gè)竹種根際細(xì)菌中共獲得4 512個(gè)OTUs,毛竹、雷竹、黃稈烏哺雞竹根際土壤細(xì)菌OTUs數(shù)量分別為2 149、2 449、2 536個(gè),三者特有OTUs數(shù)量分別為635、1 118、815個(gè),三者共有OTUs為723個(gè)。竹種根際真菌共獲得922個(gè)OTUs,毛竹、雷竹、黃稈烏哺雞竹根際土壤真菌OTUs數(shù)量分別為409、470、421個(gè),三者特有OTUs數(shù)量分別為179、258、193個(gè),三者共有OTUs為86個(gè)??梢?,根際土壤細(xì)菌OTUs數(shù)量遠(yuǎn)高于真菌。

    注:A:細(xì)菌OUT;B:真菌OUT。圖1 竹種根際菌落OTUs分布Venn圖

    3.2 3個(gè)竹種根際土壤微生物Alpha多樣性

    毛竹、雷竹及黃稈烏哺雞竹根際土壤微生物群落多樣性指數(shù)Simpson、Shannon及群落豐富度指數(shù)ACE、Chao1見表1—表3??梢钥闯觯?個(gè)竹種根際土壤細(xì)菌、固氮菌群落的豐富度及多樣性均高于非竹林土壤;土壤真菌的豐富度高于非竹林土壤,而多樣性低于非竹林土壤。其中黃稈哺雞竹根際土壤細(xì)菌豐富度最高,雷竹根際土壤細(xì)菌多樣性最低;雷竹根際土壤真菌豐富度及多樣性均最高,毛竹根際土壤真菌豐富度及多樣性均最低;雷竹根際土壤固氮菌豐富度及多樣性均最高,毛竹根際土壤固氮菌豐富度最低,黃稈哺雞竹根際土壤固氮菌多樣性最低。

    表1 不同竹種根際土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)

    表2 不同竹種根際土壤真菌多樣性指數(shù)

    表3 不同竹種根際土壤固氮菌多樣性指數(shù)

    OTU水平及Alpha多樣性指數(shù)都表明根際土壤細(xì)菌群落的豐富度及多樣性都遠(yuǎn)高于真菌,不同竹種間微生物群落存在著一定的獨(dú)特性和差異性,黃稈烏哺雞竹根際土壤具有相對(duì)更豐富的細(xì)菌群落種類,雷竹根際土壤具有相對(duì)更豐富的真菌群落種類。

    3.3 3個(gè)竹種根際微生物群落組成

    3.3.1 根際細(xì)菌群落組成

    3個(gè)竹種根際土壤細(xì)菌群落在各級(jí)分類水平上組分相似,構(gòu)成比例差異不顯著,如圖2。3個(gè)竹種優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)、酸稈菌門(cidobacteria),在毛竹根際土壤中占比分別為25.5%、20.2%、23%、20.7%,在雷竹根際土壤中占比分別為34.3%、6.8%、21.4%、28.1%,在黃稈烏哺雞竹根際土壤中占比為28.7%、12.6%、11.9%、32.9%。

    圖2 3個(gè)竹種根際細(xì)菌在門(左)、綱(中)、目(右)水平上的相對(duì)豐度

    3個(gè)竹種根際土壤優(yōu)勢(shì)菌綱均為α-變形稈菌綱(Alphaproteobacteria)及酸稈菌綱(Acidobacteria),在毛竹根際土壤中占比分別為18.4%、19.5%,在雷竹根際土壤中占比分別為21.7%、19.6%,在黃稈烏哺雞竹根際土壤中占比分別為19.8%、28.4%;毛竹根際土壤優(yōu)勢(shì)菌目為根瘤菌目(Rhizobiales),占比8.2%,雷竹和黃稈烏哺雞竹根際土壤優(yōu)勢(shì)菌目為根瘤菌目和酸稈菌目(Acidobacteriales),占比分別為11.1%、10.7%和8.1%、9.1%;雷竹根際土壤優(yōu)勢(shì)菌科為黃色稈菌科(Xanthobacteraceae)。

    非竹林土壤與竹種根際土壤比較,細(xì)菌群落組分及構(gòu)成比例差異并不顯著。非竹林土壤優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門,α-變形稈菌綱,鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales),鞘脂單胞菌科(Sphingomonas)。其中非竹林土壤根瘤菌目、酸稈菌目及弗蘭克氏菌目(Frankiales)占比遠(yuǎn)低于竹種根際土壤,鞘脂單胞菌目及β-變形菌目(Betaproteobacteriales)占比高于竹種根際土壤。

    3.3.2 根際固氮菌群落組成

    在3個(gè)竹種中,毛竹和雷竹根際土壤固氮菌群落組分及構(gòu)成比例都更接近,如圖3和圖4。毛竹、雷竹及黃稈烏哺雞竹根際土壤主要構(gòu)成菌門為變形菌門、藍(lán)藻(blue-green algae)、厚壁菌門,這與劉彩霞等[14]對(duì)毛竹林固氮微生物群落研究結(jié)果一致;3個(gè)竹種的優(yōu)勢(shì)菌門均為變形菌門,占比分別為97.2%、97.5%、98.2%;在3個(gè)竹種中藍(lán)藻在雷竹根際土壤占比最高,厚壁菌門在毛竹根際土壤占比最高,而雷竹不含厚壁菌門;3個(gè)竹種的優(yōu)勢(shì)菌綱均為α-變形稈菌綱,占比分別為77.2%、86.8%、93.8%,3個(gè)竹種中δ-變形菌綱、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、芽孢稈菌綱(Bacilli)在毛竹根際土壤占比均最高,雷竹根際土壤不含芽孢稈菌綱,黃稈烏哺雞竹根際土壤不含δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria);3個(gè)竹種的優(yōu)勢(shì)菌目均為根瘤菌目,占比分別為76.8%、86%、93.6%,3個(gè)竹種中雷竹根際土壤不含芽孢稈菌目,黃稈烏哺雞竹根際土壤不含除硫單胞菌目(Desulfuromonadales)及假單胞菌目(Pseudomonadales);3竹種的優(yōu)勢(shì)菌科均為慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae),占比分別為76.4%、85.2%、89.7%;3竹種的優(yōu)勢(shì)菌屬均為慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium),占比分別為76.3%、85.2%、89.7%,黃稈烏哺雞竹相較于毛竹與雷竹無地稈菌屬(Geobacter)與假單胞菌屬(Pseudomonas),而眉藻屬(Calothrix)也遠(yuǎn)少于毛竹與雷竹。

    圖3 3個(gè)竹種根際固氮菌在門(左)、綱(中)、目(右)水平上相對(duì)豐度

    圖4 3個(gè)竹種根際固氮菌在科(左)、屬(右)水平上相對(duì)豐度

    竹種根際土壤與非竹林土壤細(xì)菌群落比較,從綱水平上開始表現(xiàn)出較大差異,非竹林土壤α-變形稈菌綱及其下屬級(jí)別占比均遠(yuǎn)低于竹種根際土壤,而δ-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱及他們下屬級(jí)占比都高于竹種根際土壤。

    3.3.3 根際真菌群落組成

    3個(gè)竹種根際土壤真菌群落在各級(jí)分類水平上組分相似,構(gòu)成比例差異顯著,如圖5和圖6。3個(gè)竹種根際土壤主要構(gòu)成菌門為子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota),其中毛竹和雷竹根際土壤優(yōu)勢(shì)菌門均為子囊菌門,占比分別為83.8%、88.6%;黃稈烏哺雞竹根際土壤優(yōu)勢(shì)菌門為擔(dān)子菌門,占比46.8%。毛竹根際土壤優(yōu)勢(shì)菌綱為錘舌菌綱(Leotiomycetes),占比56.3%;雷竹根際土壤優(yōu)勢(shì)菌綱為散囊菌綱(Eurotiomycetes)和座囊菌綱(Dothideomycetes),占比分別為26.4%、32.1%;黃稈烏哺雞竹根際土壤優(yōu)勢(shì)菌綱為傘菌綱(Agaricomycetes),占比43.6%。毛竹根際土壤優(yōu)勢(shì)菌目為柔膜菌目(Helotiales),占比56%,雷竹根際土壤優(yōu)勢(shì)菌目為散囊菌目(Eurotiales),占比26%,黃稈烏哺雞竹根際土壤優(yōu)勢(shì)菌目為傘菌目(Agaricales),占比39.5%。毛竹根際土壤優(yōu)勢(shì)菌科為柔膜菌科(Helotiaceae),占比52.9%,是毛竹特有的菌科;雷竹根際土壤優(yōu)勢(shì)菌科為曲霉科(Aspergillaceae),占比24.1%,占比遠(yuǎn)高于毛竹及黃稈烏哺雞竹根際土壤;黃稈烏哺雞竹根際土壤優(yōu)勢(shì)菌科為鵝膏科(Amanitaceae),占比38.8%,是其特有菌科。毛竹根際土壤優(yōu)勢(shì)菌屬為Claussenomyces,占比為52.8%;雷竹根際土壤優(yōu)勢(shì)菌屬為青霉菌屬(Penicillium)、曲霉菌屬(Asperquillus),占比分別為13.5%、10.7%。

    圖5 3個(gè)竹種根際真菌在門(A)、綱(B)水平上相對(duì)豐度

    非竹林土壤與竹種根際土壤比較,從門水平上開始表現(xiàn)出較大差異,其被孢霉菌門(8.3%)及其下級(jí)分類占比都遠(yuǎn)高于竹種根際土壤;糞殼菌綱(Sordariomycetes)(28.6%)占比也遠(yuǎn)高于竹種根際土壤,而古根菌綱(Archaeorhizomycetes)及銀耳綱(Tremellomycetes)占比則低于竹種根際土壤。

    4 討論和結(jié)論

    在本研究中根際土壤細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌門與此前本課題組研究的東鄉(xiāng)紅星墾殖場(chǎng)雷竹林[15]、瑞金的毛竹林[16]土壤細(xì)菌群落相一致,同樣以變形菌門、酸稈菌門、放線菌門、綠彎菌門這4個(gè)菌門為優(yōu)勢(shì)菌門,翟婉璐[17]發(fā)現(xiàn)未覆蓋雷竹林土壤細(xì)菌群落以變形菌門、綠彎菌門、酸稈菌門為優(yōu)勢(shì)菌門,這些研究表明竹子這一物種的土壤細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌門具有高度一致性。馮瑋娜等[18]研究發(fā)現(xiàn),四川牡丹根際細(xì)菌以變形菌門、厚壁菌門(Firmicutes)、酸稈菌門、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)為優(yōu)勢(shì)菌門。Lundberg等[19]發(fā)現(xiàn),在擬南芥根際土壤細(xì)菌以放線菌門、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、變形菌門、擬稈菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門、酸稈菌門為優(yōu)勢(shì)菌門。周柳婷等[20]研究發(fā)現(xiàn)連栽木麻黃根際土壤細(xì)菌以酸稈菌門、放線菌門、疣微菌門(Verrucomicrobia)、變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌門。喬清華[21]研究發(fā)現(xiàn),棉花根際細(xì)菌以中變形菌門、疣微菌門、浮霉菌門(Planctomycetes)、酸稈菌門、放線菌門、擬稈菌門為優(yōu)勢(shì)菌門。綜上可見,不同植物根際細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌門存在一定程度的差異,放線菌門、變形菌門、酸稈菌門是竹類與以上植物間共有的優(yōu)勢(shì)菌門,說明這幾個(gè)菌門可能是大多數(shù)植物的共同菌門,其中綠彎菌門是竹種較其他植物的特有優(yōu)勢(shì)菌門。

    對(duì)竹種根際土壤與非竹林土壤細(xì)菌群落比較發(fā)現(xiàn),慢生根瘤菌屬在竹種根際土壤占比顯著高于非竹林土壤,可能由于試驗(yàn)竹林成林后施肥量低,竹林生長(zhǎng)需要一定量的氮,而慢生根瘤菌屬為化能異養(yǎng)菌,可寄生植物根部固定大氣氮,有的也可以游離狀態(tài)固定氮,可為竹林供給一定量的氮,故慢生根瘤菌屬在竹種根際土壤中占比較高。在3個(gè)竹種根際土壤真菌群落中青霉菌屬、曲霉菌屬在雷竹根際土壤中占比均最高,且這2個(gè)菌屬在3個(gè)竹種根際土壤中占比都高于非竹林土壤,可能由于試驗(yàn)竹林施肥量低,而青霉菌屬、曲霉菌屬作為常見的溶磷真菌,能將土壤中植物難以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的形態(tài),供給竹種利用,故他們?cè)诟H土壤中占比高,這一研究發(fā)現(xiàn)為溶磷菌篩選提供了菌株資源,也為后期研制生物肥料提供了理論基礎(chǔ)。

    本研究運(yùn)用Illumina Hi Seq高通量技術(shù),通過分析毛竹、雷竹及黃稈烏哺雞竹根際微生物(細(xì)菌、真菌、固氮菌)群落結(jié)構(gòu),結(jié)果表明不同竹種根際土壤的微生物群落多樣性具有一定差異性。從3個(gè)竹種Alpha多樣性指數(shù)來看,雷竹根際土壤真菌及固氮菌豐富度及多樣性均最高;毛竹根際土壤真菌豐富度及多樣性均最低。從微生物群落組成來看,3個(gè)竹種根際土壤細(xì)菌群落在各級(jí)分類水平上組分相似,構(gòu)成比例差異不顯著,而非竹林土壤與竹種根際土壤比較,細(xì)菌群落組分及上構(gòu)成比例也并無顯著差異。在3個(gè)竹種中,毛竹和雷竹根際土壤固氮菌群落組分及構(gòu)成比例都更接近,非竹林土壤與竹種根際土壤比較,從綱水平上開始表現(xiàn)出較大差異。3個(gè)竹種根際土壤真菌群落在各級(jí)分類水平上組分相似,構(gòu)成比例差異顯著。綜上初步認(rèn)為,不同竹種的根際微生物群落都有其特異性,因此在生產(chǎn)上應(yīng)根據(jù)竹種的不同,選擇施用合適的高效微生物肥料,促進(jìn)竹種根際土壤優(yōu)勢(shì)菌群的形成,從而促進(jìn)竹種生長(zhǎng),此研究結(jié)果為今后研制竹種專用生物肥料提供理論基礎(chǔ)。

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