大黃酚通過TLR4/NF-kB信號通路途徑調(diào)控小膠質(zhì)細胞炎性反應(yīng)

郭青 何前松 胡斐然

摘要：目的? 觀察大黃酚對脂多糖（LPS）激活誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞炎性反應(yīng)的影響并探討其作用機制。方法? 采用LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞活化，CCK-8檢測不同濃度大黃酚（1、10、50、100 μg/ml）對小膠質(zhì)細胞細胞活性的影響，將細胞分為空白組、LPS組、LPS+大黃酚低、中、高劑量組（1、10、50 μg/ml），一氧化氮（NO）測試盒檢測細胞上清液中NO釋放量，ELISA檢測IL-1、TNF-a、IL-4和IL-10含量，蛋白免疫印跡法檢測小膠質(zhì)細胞NF-κB及TLR4蛋白表達的情況，免疫熒光法檢測NF-κB蛋白在細胞中的位置變化。結(jié)果? 大黃酚濃度在1～50 μg/ml對小膠質(zhì)細胞活力影響不顯著，此濃度范圍內(nèi)，大黃酚呈劑量依賴性地降低IL-1、TNF-a表達水平，升高IL-4、IL-10的表達水平（P<0.05）;此外，大黃酚可抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞形態(tài)改變。與空白組比較，LPS組TLR4、NF-kB蛋白表達水平升高意義（P<0.05）;與LPS組相比較，除LPS+大黃酚低劑量組胞核中NF-κB蛋白表達水平降低不顯著外，其余各組上述蛋白水平表達均改善（P<0.05）。免疫熒光染色實驗結(jié)果顯示，與空白組相比較，LPS組細胞核中NF-κB蛋白表達上升，胞漿中NF-κB表達下降。結(jié)論? 大黃酚可以抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞炎性反應(yīng)，促進小膠質(zhì)細胞M1型向M2型的轉(zhuǎn)化，其機制可能與下調(diào)TLR4/NF-κB信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：大黃酚;脂多糖;小膠質(zhì)細胞;炎性反應(yīng)

中圖分類號：R285.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.19.016

文章編號：1006-1959（2020）19-0051-05

Abstract：Objective? To observe the effect of chrysophanol on the inflammatory response of microglia induced by lipopolysaccharide （LPS） activation and explore its mechanism.Methods? LPS was used to induce the activation of microglia. CCK-8 was used to detect the effects of different concentrations of chrysophanol （1， 10， 50， and 100 μg/ml） on the activity of microglia. The cells were divided into blank group， LPS group， LPS+chrysophanol low， medium and high dose groups （1， 10， 50 μg/ml）， nitric oxide （NO） test kit detects the release of NO in the cell supernatant， and ELISA detects IL-1， TNF-a， IL -4 and IL-10 content， Western blotting was used to detect the expression of NF-κB and TLR4 protein in microglia， and immunofluorescence was used to detect the location of NF-κB protein in the cell.Results? The concentration of chrysophanol in the range of 1-50 μg/ml has no significant effect on the viability of microglia. In this concentration range， chrysophanol dose-dependently reduces the expression level of IL-1 and TNF-a， and increases IL-4 and IL -10 expression level （P<0.05）. In addition， chrysophanol can inhibit the morphological changes of microglia induced by LPS. Compared with the blank group， the expression levels of TLR4 and NF-kB protein in the LPS group increased（P<0.05）; compared with the LPS group， except for the low-dose LPS+chrysophanol group， the expression of NF-κB protein in the nucleus except for the insignificant decrease in the level， the expression of the above-mentioned protein levels in the other groups was improved （P<0.05）. The results of immunofluorescence staining experiments showed that compared with the blank group， the expression of NF-κB protein in the nucleus of the LPS group increased， and the expression of NF-κB in the cytoplasm decreased.Conclusion? Chrysophanol can inhibit LPS-induced inflammatory response in microglia and promote the transformation of microglia from M1 type to M2 type might be related to the down-regulation of the TLR4/NF-κB signaling pathway.

Key words：Chrysophanol;Lipopolysaccharide;Microglia;Inflammatory response

腦缺血后導(dǎo)致一系列病理生理損傷事件，包括興奮性氨基酸毒性損傷、鈣調(diào)節(jié)障礙、氧化應(yīng)激、炎癥細胞浸潤和細胞凋亡，造成不可逆的神經(jīng)細胞凋亡[1]。缺血后神經(jīng)炎癥反應(yīng)已被認為是缺血性中風的病理生理學(xué)的關(guān)鍵因素。小膠質(zhì)細胞（microglia， MG）作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐巨噬細胞，其炎性活化在腦缺血損傷過程中發(fā)揮了重要作用[2]。腦缺血時損傷信號刺激小膠質(zhì)細胞和募集的巨噬細胞在急性期被激活并極化為M2表型并分泌抗炎因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子（如IL-4、IL-10、BDNF等），然后逐漸向M1表型轉(zhuǎn)變，可以產(chǎn)生炎性細胞因子和神經(jīng)毒性因子，啟動或加重神經(jīng)元損傷，導(dǎo)致神經(jīng)元變性死 亡[3，4]。越來越多證據(jù)表明[5，6]，小膠質(zhì)細胞表面表達的Toll樣受體4（TLR4）在介導(dǎo)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞激活和炎癥反應(yīng)中起重要作用，激活下游信號核因子kappa B（NF-κB）傳導(dǎo)，促進細胞因子、細胞黏附分子等多種炎性介質(zhì)轉(zhuǎn)錄。因此，選擇性抑制M1型小膠質(zhì)細胞，促進小膠質(zhì)細胞由M1損傷型向M2修復(fù)型轉(zhuǎn)化，是防治神經(jīng)炎癥以及神經(jīng)退行性疾病的有效途徑之一。大黃酚（chrysophanol，Chry）是從中藥大黃中提取的活性成分，具有廣泛的藥理特性，如抗炎、改善記憶功能、抗心肌缺血以及腦保護等藥理特性[7，8]。既往的研究表明[9]，大黃酚可通過血腦屏障并保持其生物活性，可拮抗腦缺血/再灌注損傷，抑制小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。但是在神經(jīng)炎癥的保護機制尚不明確。本研究采用LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞株活化建立炎癥模型，觀察大黃酚對小膠質(zhì)細胞活化介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的影響并探討其作用機制，為大黃酚應(yīng)用于神經(jīng)炎癥疾病的預(yù)防和治療提供初步的實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要藥品與試劑? 大黃酚（純度98%）購于源葉生物有限公司;小膠質(zhì)細胞株（Hapi）購于華拓生物公司;TLR4多克隆抗體、兔抗多克隆NF-kB p65抗體購于Bioswamp公司;兔抗GAPDH多克隆抗體購于Bioswamp公司;CCK-8檢測試劑盒購于日本索萊寶公司;NO檢測試劑盒購于南京建成公司;IL-6檢測試劑盒、TNF-α檢測試劑盒、IL-4檢測試劑盒、IL-10檢測試劑盒購于基因美公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購于日本索萊寶公司;高糖培養(yǎng)基、雙抗（青鏈霉素）、胰酶消化液、PBS緩沖液、DMSO（二甲基亞砜）購于美國HYCLONE公司。

1.2儀器? 低速離心機購于杭州奧盛儀器公司;超純水生產(chǎn)儀購于美國Scientific公司;細胞培養(yǎng)箱、多功能酶標儀購于美國Thermo Fisher Scientific公司;倒置相差顯微鏡購于日本Olympus公司;電熱恒溫水浴箱購于上海精弘設(shè)備公司;電泳儀購于美國BIO-RAD公司;高速冷凍離心機購于杭州奧盛公司;全自動化學(xué)發(fā)光分析儀購于天能公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng)? 細胞復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基把Hapi小膠質(zhì)細胞種植于培養(yǎng)瓶中，置于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）進行常規(guī)培養(yǎng)及傳代，待狀態(tài)穩(wěn)定后移至96孔培養(yǎng)板上，分組進行實驗。

1.3.2 CCK-8法檢測細胞存活率? 使用日本索萊寶公司CCK-8試劑盒進行檢測。將對數(shù)生長的Hapi小膠質(zhì)細胞均勻接種至96孔板中，培養(yǎng)24 h后，隨機分為設(shè)空白（Blank）組、LPS組（0.1 μg/ml）、LPS+大黃酚低、中、高、很高劑量組（1、10、50、100 μg/ml）。每組設(shè)置6個復(fù)孔，進行12 h干預(yù)。干預(yù)結(jié)束后，孔板內(nèi)加入10 μl的CCK-8試劑，2 h后多功能酶標儀在450 nm波長讀取OD值。處理完畢后按照CCK-8試劑盒具體說明，向每孔加入10 μl CCK-8的試劑，將培養(yǎng)板在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標儀測定在450 nm波長的吸光度。細胞存活率（%）=（實驗組OD-空白組OD） /（對照組OD-空白組OD）×100%。

1.3.3一步法檢測NO釋放量? 使用南京建成公司NO一步法試劑盒進行檢測。將Hapi小膠質(zhì)細胞以7000個/孔（100 μl）的密度接種至96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，隨機分為空白組、LPS組、LPS+大黃酚低、中、高劑量組（1、10、50 μg/ml）。每組均設(shè)置6個復(fù)孔，干進行12 h的干預(yù)。干預(yù)結(jié)束后取100 μl細胞上清檢測NO含量，按一步法試劑盒說明，取100 μl樣本加入200 μl試劑一，充分混合并加入100 μl試劑二，徹底混合，靜止10 min，在3500 r/min下離心10 min后，取160 μl上清液加入顯色劑80 μl，混勻，靜置15 min。用酶標儀測定在550 nm波長吸光度。

1.3.4倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)? 小膠質(zhì)細胞以接種于96孔培養(yǎng)板，密度為7000 細胞/孔，100 μl培養(yǎng)基。組別設(shè)置為空白組、LPS組、LPS+大黃酚低、中、高劑量組（1、10、50 μg/ml）。每組設(shè)6個復(fù)孔?？瞻讓φ战M常規(guī)培養(yǎng)，LPS模型組加入LPS（0.1 μg/ml）的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，大黃酚預(yù)處理組用含LPS（濃度為0.1 μg/ml）進行預(yù)處理，其余處理步驟同LPS模型組。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、細胞密度及貼壁狀態(tài)的改變。

1.3.5 ELISA法檢測IL-l、TNF-a、IL-4、IL-10炎癥因子表達? 細胞分組及處理同1.3.3，處理結(jié)束后收集48孔板內(nèi)細胞上清液，采用ELISA試劑盒測定各組培養(yǎng)孔內(nèi)細胞上清液中促炎因子及抗炎因子的表達水平。

1.3.6蛋白免疫印跡方法檢測TLR4、NF-kB蛋白表達? 細胞分組及處理同1.3.3。收集處理過的細胞，沖洗（PBS3Ml、2次），在冰上用適量的細胞裂解液裂解約30 min，在裂解的上清液中定量蛋白質(zhì)（BCA法），然后調(diào)節(jié)蛋白濃度，接著煮沸，然后進行電泳，切換至PVDF膜，在室溫下封閉3 h（3%BSA），添加第一抗體后在4 ℃孵育過夜，洗滌膜，添加第二抗體（HRP標記）進行孵育，2 h后用ECL試劑顯色，并收集圖像。Bio-Rad成像儀進行成像分析，圖片灰度值采用Image Lab軟件進行分析。

1.3.7免疫熒光檢測不同濃度大黃酚對NF-κB蛋白位置的影響? 取出各組樣本（12孔板），用 PBS洗滌2次（1 ml，3 min）。常溫用1 ml 4%多聚甲醛固定約30 min，加入1 ml 0.5%Triton X-100室溫通透? ? ?20 min，PBS洗滌后加入1 ml 5%BSA，在37℃條件下封閉1 h。滴加一抗即兔抗多克隆NF-kB p65抗體（1∶200）4 ℃過夜，Alexa Fluor 594標記羊抗兔IgG（1∶100）37 ℃ 1 h，加入300 μl抗熒光淬滅封片液（含DAPI）防淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察，采集5個視野圖片。采用Image pro plus6.0軟件計算NF-κB核轉(zhuǎn)移數(shù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析? 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)使用（x±s）表示，組間比較用采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01表示統(tǒng)計學(xué)意義顯著。

2結(jié)果

2.1各組小膠質(zhì)細胞存活率? CCK法檢查結(jié)果示，與空白組比較，100 μg/ml大黃酚預(yù)處理組的細胞存活率明顯降低（P<0.05），其余各組均無明顯下降（P>0.05），見表1。

2.2 NO釋放量檢測結(jié)果? 一步法檢測各組小膠質(zhì)細胞NO釋放量，結(jié)果顯示與空白組比較，LPS組NO釋放量明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;在大黃酚預(yù)處理組，隨著大黃酚濃度的增加，NO的釋放量逐漸減少（P<0.05）。其中1 μmol/L大黃酚預(yù)處理組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.3顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學(xué)變化? 倒置相差顯微鏡下，空白對照組細胞呈靜狀態(tài)，細胞體小、纖細;與空白對照組相比較，LPS模型組細胞胞體增大，細胞表面的突起變粗或者變短，呈阿米巴樣，小膠質(zhì)細胞明顯活化;大黃酚各劑量預(yù)處理不同程度地減少活化的小膠質(zhì)細胞數(shù)量，見圖1。

2.4大黃酚對小膠質(zhì)細胞IL-l、TNF-a、IL-4和IL-10表達的干預(yù)作用? ELISA檢測結(jié)果顯示，與空白組比較，LPS刺激小膠質(zhì)細胞后可明顯上調(diào)上清液IL-l、TNF-a、IL-4和IL-10表達水平（P<0.01）;與LPS模型組相比較，大黃酚各劑量組呈劑量依賴性降低促炎因子IL-l、TNF-a水平，升高抗炎因子IL-4、IL-10的表達水平（P<0.05），見表3。

2.5大黃酚對LPS刺激的小膠質(zhì)細胞TLR4、NF-кB蛋白表達水平的影響? 與空白組比較，LPS模型組TLR4、NF-kB蛋白表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與LPS模型組相比較，除大黃酚低劑量組胞核中NF-κB蛋白表達水平表達降低不顯著外，其余各組上述蛋白水平表達均明顯改善（P<0.05）。各組TLR4、NF-κB蛋白表達的電泳圖見圖2、表4。

2.6免疫熒光檢測不同濃度大黃酚對NF-κB蛋白位置的影響? 免疫熒光染色實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與空白對照組相比較，LPS模型組細胞核中NF-κB蛋白表達明顯上升，胞漿中NF-κB表達下降，用大黃酚處理則可以抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)移，見圖3。

3討論

免疫炎性反應(yīng)作為腦部病理損傷機制中的一個重要組成部分，小膠質(zhì)細胞在腦內(nèi)炎癥反應(yīng)中起重要作用，可誘發(fā)、調(diào)控甚至放大包括中風在內(nèi)的多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)機制。小膠質(zhì)細胞被激活時，形態(tài)也可發(fā)生明顯改變，從靜息分枝狀態(tài)快速轉(zhuǎn)向阿米巴活化狀態(tài)[10]。本實驗研究結(jié)果顯示，空白對照組細胞呈靜狀態(tài)，活化后小膠質(zhì)細胞表面的突起變粗或變短，形態(tài)呈阿米巴樣改變。大黃酚濃度在1～50 μg/ml對小膠質(zhì)細胞活力影響不顯著，在此濃度范圍內(nèi)，大黃酚能夠顯著抑制小膠質(zhì)細胞形態(tài)的改變，提示大黃酚對小膠質(zhì)細胞活化具有抑制作用。

腦缺血或腦損傷后，細胞內(nèi)外離子失衡、多種可溶性炎性細胞因子表達以及興奮性氨基酸、一氧化氮和氧自由基的生成等均可導(dǎo)致小膠質(zhì)細胞激活[11]。整個活化過程呈現(xiàn)瀑布效應(yīng)：分化、增殖，免疫分子表達或表達上調(diào)，遷移至損害部位，發(fā)生形態(tài)、免疫顯性和功能改變等。小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的免疫細胞，其數(shù)量在腦細胞中占第3位（約10%）。受其環(huán)境的影響，小膠質(zhì)細胞呈現(xiàn)多種表型，并保留轉(zhuǎn)移功能以維持組織穩(wěn)態(tài)的能力[12]?；罨男∧z質(zhì)細胞有M1型和M2型兩種表型。通過LPS或IFN-γ刺激小膠質(zhì)細胞可促使其向“M1促炎亞型”轉(zhuǎn)變而募集適應(yīng)性免疫細胞促進炎癥反應(yīng)或通過IL-4/IL-13刺激小膠質(zhì)細胞可促使其向“M2型抑炎亞型”轉(zhuǎn)變而發(fā)揮抗炎和促進損傷修復(fù)功能[13]。本研究中觀察到大黃酚呈劑量依耐性地抑制小膠質(zhì)細胞NO、IL-l、TNF-a的釋放，促進IL-4、IL-10的表達。實驗結(jié)果提示大黃酚具有拮抗LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞炎癥介質(zhì)的釋放，促進小膠質(zhì)細胞M1型向M2型的轉(zhuǎn)化。

TLR4作為炎癥激活的關(guān)鍵上游門戶蛋白，是Toll樣受體家族的主要成員，廣泛表達于小膠質(zhì)細胞[14]。小膠質(zhì)細胞激活過程中涉及TLR4信號，并激活下游信號核因子kappa B（NF-κB）傳導(dǎo)，從而增加細胞因子（如TNF-α、IL-1β和IL-6）、趨化因子以及細胞黏附分子等多種炎性介質(zhì)轉(zhuǎn)錄，還產(chǎn)生一氧化氮（NO）、活性氧簇（ROS）和類花生酸類（如前列腺素E2）等，導(dǎo)致繼發(fā)性損害[15]。本研究中LPS刺激小膠質(zhì)細胞激活后，小膠質(zhì)細胞TLR4蛋白表達增加，細胞核中NF-κB蛋白表達明顯上升，胞漿中NF-κB表達下降，而大黃酚處理則可以減少LPS誘導(dǎo)的TLR4蛋白表達，抑制NF-κB向由細胞質(zhì)向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位。由此可知，TLR4/NF-κB通路可能是大黃酚拮抗小膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)的機制之一。

綜上所述，本研究結(jié)果提示大黃酚可拮抗LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞炎癥介質(zhì)的釋放，促進小膠質(zhì)細胞M1型向M2型的轉(zhuǎn)化，而TLR4/NF-κB信號通路可能作為調(diào)控小膠質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)換的新靶點，為開發(fā)大黃酚作為一種新的腦血管保護藥物提供實驗依據(jù)。

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收稿日期：2020-06-21;修回日期：2020-06-30

編輯/肖婷婷