毛花獼猴桃葉中AE的含量測定方法建立及提取純化工藝研究

王永紅 王雪瑩 彭世陸 禹奇男 李紅亮

[摘要]目的 建立毛花獼猴桃葉中2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸（AE）的檢測方法并考察提取純化工藝。方法 以AE為對照品，利用高效液相色譜（HPLC）結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD），建立AE的含量測定方法;采用單因素及正交試驗，考察最佳提取工藝;采用單因素實驗，考察最佳純化工藝。結(jié)果 建立了穩(wěn)定可行的AE含量測定方法，并測定了5個不同產(chǎn)地的獼猴桃葉中AE的含量，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地之間含量差異較大;考察得出最佳提取工藝為：用70%乙醇提取2次，第1次15倍量提取2 h，第2次10倍量提取1 h;最佳純化工藝為：將提取液濃縮至0.50 g生藥/ml，濃縮液靜置8 h后，棄去上清液，取沉淀，加入30%乙醇至濃度為0.50 g生藥/ml，充分?jǐn)嚢?，再靜置8 h，棄去上清液，取沉淀，加入適量石油醚（60-90）充分洗滌。最終得到的AE中間體平均含量為36.25%，從藥材到中間體的得率也達(dá)到55.96%。結(jié)論 本實驗建立的含量測定方法穩(wěn)定可行，可用于獼猴桃葉中AE的含量測定;優(yōu)選出的工藝操作簡單可行、重復(fù)性好，可推廣于工業(yè)化大生產(chǎn)。

[關(guān)鍵詞]毛花獼猴桃葉;2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸;含量測定;提取工藝;純化工藝

[中圖分類號] R917? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）9（a）-0018-05

[Abstract] Objective To establish the method for determination of 2α，3α，24-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid （AE） from the leaves of Actinidia eriantha Benth.， and optimize the extraction and purification process. Methods The content determination method of AE was established by high performance liquid chromatography-evaporative light-scattering detector （HPLC-ELSD） using AE as reference substance. The optimal extraction process was researched by single factor test and orthogonal test. The optimal purification process was researched by single factor test. Results The stable content determination method of AE was established， and it was found that the content of AE in Actinidia eriantha Benth. leaves from 5 different habitats was quite different. The optimal process of the extraction was as follows： extraction for 2 hours with 15-fold 70% ethanol in the first time， and extraction for 1 hour with 10-fold 70% ethanol in the second time. The optimal purification process was as follows： concentrating the extract to 0.50 g crude drug/ml， discarding the supernatant after sit for 8 hours， adding 30% ethanol into the sediment to let the concentration become 0.50 g crude drug/ml， and stirring thoroughly， discarding the supernatant after sit for 8 hours again， adding the appropriate amount of petroleum ether （60-90） into the sediment， and washing thoroughly. The average content of AE intermediate was 36.25%， and the yield from medicinal materials to intermediates also reached 55.96%. Conclusion The method established in this experiment is stable and feasible， and can be used for the determination of AE in Actinidia eriantha Benth. leaves， the optimized process is simple， stable and repeatable， which is suitable for industrial production.

[Key words] Leaves of Actinidia eriantha Benth.; 2α，3α，24-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid; Content determination; Extraction process; Purification process

毛花獼猴桃（Actinidia eriantha Benth.）為獼猴桃科獼猴桃屬植物?！吨兴幋筠o典》[1]《福建中草藥》[2]《浙江民間常用草藥》[3]記載其多個功效，如：清熱利濕、活血消腫、解毒、舒筋活血，可以治療胃癌、鼻咽癌、乳癌等。其作為浙江地區(qū)少數(shù)民族畬族特有的畬藥，在畬族中被廣泛用于腫瘤治療[4]。毛花獼猴桃含有三萜[5-7]、黃酮[8]、多糖[9]等成分，其中三萜類化合物是其抗腫瘤作用的主要活性成分之一[4，10-13]。

現(xiàn)代研究中主要是從毛花獼猴桃的根中提取得到三萜類化合物[14-15]，而從葉中提到三萜類化合物的研究卻罕有報道。但獼猴桃根的采收是一次性的，而葉的采收卻可以做到源源不斷，且兩者本就是同根同源，所含化學(xué)成分也類似，特別是三萜類化合物。毛花獼猴桃葉中同樣含有大量三萜類化合物，2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸（AE）便是其中之一，研究表明，AE具有明顯的抗腫痛活性[16-17]。AE在葉中的含量達(dá)到了1.15%，可以作為獼猴桃葉中三萜類化學(xué)物的指標(biāo)性成分。因此，從藥材資源方面考慮，可加強(qiáng)對獼猴桃葉的研究，爭取在某些研究領(lǐng)域可以取代獼猴桃根。

本實驗擬建立AE的高效液相色譜結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-ELSD）測定方法，并采用單因素及正交試驗對AE的提取工藝及純化工藝進(jìn)行系統(tǒng)性研究。

1儀器與試劑

Millipore Synergy超純水系統(tǒng)（美國密理博公司）;METTLER AE240型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）;JA2003N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;Agilent 1100高效液相色譜儀（Agilent公司）;Alltech ELSD-6000A蒸發(fā)光散射儀（美國奧泰公司）;WSK-A全自動空氣源（天津津分分析儀器有限公司）。甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

毛花獼猴桃葉藥材購于浙江、福建等地（表1），經(jīng)重慶中藥研究院羅維早研究員鑒定為獼猴桃科獼猴桃屬Actinidia eriantha Benth.的干燥葉。

AE對照品為自制，經(jīng)面積歸一化法計算，純度>98%。AE對照品制備方法：取5 kg毛花獼猴桃葉，加70%乙醇充分提取，提取液濃縮后利用硅膠柱色譜以二氯甲烷-甲醇為洗脫系統(tǒng)進(jìn)行初步分離，再利用葡聚糖凝膠色譜及重結(jié)晶得到單體，經(jīng)高分辨質(zhì)譜及核磁共振技術(shù)鑒定為2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸。

2 AE的HPLC-ELSD含量測定方法建立

2.1色譜條件及系統(tǒng)適用性實驗

色譜柱：Agilent TC-C18（2）柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相：甲醇-水（甲醇比例為0～6 min：73%～75%;6～10 min：75%;10～11 min：75%～90%;11～20 min：90%～100%;20～30 min：100%），流速：l.0 ml/min;檢測器：ELSD;柱溫：40℃，進(jìn)樣量：20 μl。在上述色譜條件下分析，AE色譜峰與相鄰的色譜峰分離度均>1.5，理論塔板數(shù)按AE計算不低于5000，色譜圖見圖1。

2.2對照品溶液的制備

精密稱取AE對照品（10.31 mg），用73%甲醇（與液相流動相的初始濃度保持一致）溶解并稀釋至25 ml量瓶中，配成0.4124 mg/ml的溶液，即得對照品溶液，冷藏備用。

2.3供試品溶液的制備

取粉碎后過3號篩的獼猴桃葉樣品約1 g，精密稱定，加入25 ml 95%乙醇超聲提取2次，每次30 min，合并提取液，減壓濃縮至干，用73%甲醇溶解并定容至50 ml容量瓶中，即得供試品溶液。

2.4線性關(guān)系

分別精密吸取AE對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml置5 ml量瓶中，用73%甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成0.082 48、0.164 96、0.247 44、0.329 92、0.412 40 mg/ml系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣20 μl測定。以AE對照品溶液質(zhì)量濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程：Y=15 465X-1245（R2=0.9999），線性范圍82.48～412.40 μg/ml。

2.5精密度試驗

2.5.1重復(fù)性考察? 取獼猴桃葉樣品適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液6份，進(jìn)樣20 μl，測定峰面積，計算含量，結(jié)果顯示，樣品中AE平均含量為1.15%，RSD為1.31%，表明重復(fù)性良好。

2.5.2不同人員精密度考察? 取獼猴桃葉樣品，由3個不同的工作人員，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液2份，進(jìn)樣20 μl，測定峰面積，計算含量，結(jié)果顯示，人員變動制備的精密度RSD為1.64%，表明不同人員制備的精密度良好。

2.5.3不同日期精密度考察? 取獼猴桃葉樣品，在不同的工作日內(nèi)，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液2份，進(jìn)樣20 μl，測定峰面積，計算含量，考察不同日期精密度，結(jié)果顯示，兩者日間精密度RSD為1.89%，表明日間精密度良好。

2.5.4不同儀器精密度考察? 取獼猴桃葉樣品，在不同的儀器（儀器型號均為Agilent 1100 HPLC儀與Alltech ELSD-6000A蒸發(fā)光散射儀）上，按“2.3”項下方法制備供試品溶液2份，進(jìn)樣20 μl，測定峰面積，計算含量，考察不同儀器的精密度，結(jié)果顯示，儀器變動的精密度RSD為1.85%，表明不同儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗

取獼猴桃葉樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液2份，于不同的時間間隔（0、4、8、12、16、20、24 h），分別精密吸取20 μl，按“2.1”項下色譜條件，注入液相色譜儀，記錄峰面積。結(jié)果表明，供試品溶液室溫下密閉保存，存放24 h，AE保留時間及峰面積RSD分別為0.49%、1.86%，表明穩(wěn)定性良好。

2.7加樣回收率試驗

取已知含量（1.15%）的獼猴桃葉樣品適量，精密稱取9份，分別加入適量AE對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計算加樣回收率，結(jié)果如表2，計算公式如下：回收率（%）=[測得量（mg）-樣品量（mg）]/加入量（mg）×100%。

2.8樣品含量測定

取5批來自不同產(chǎn)地的毛花獼猴桃葉，每批平行稱取2份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計算不同產(chǎn)地毛花獼猴桃葉中AE的含量，結(jié)果見表3。

3結(jié)果與討論

3.1提取工藝考察

3.1.1提取溶媒考察? 取已知含量（1.15%）的獼猴桃葉藥材，由于AE的極性較大，故從50%濃度的乙醇開始考察。分別選擇15倍量乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%的溶媒回流提取3次，每次2 h，測定AE得率及轉(zhuǎn)移率，具體見表4。結(jié)果顯示，AE的得率與乙醇濃度成正比，但乙醇濃度達(dá)到70%以上后AE的得率增加較小，因此從生產(chǎn)成本及安全性考慮選擇65%、70%、75%乙醇作為正交試驗所選溶劑范圍。

3.1.2浸泡時間考察? 取獼猴桃葉藥材適量，加入15倍量70%乙醇，每隔5 min觀察浸泡情況，15 min時藥材已基本浸泡完全。

3.1.3飽和溶媒吸附量考察? 取獼猴桃葉藥材5 g，精密稱定，加入20倍量70%乙醇，浸泡30 min，過濾剩余溶媒，體積差為24 ml，約為藥材的5倍量，故在正交試驗中以5倍量作為遞減值。

3.1.4正交試驗考察提取工藝? 根據(jù)“3.1.1～3.1.3”的考察結(jié)果及實際情況，確定正交試驗考察的因素為提取乙醇濃度（%，A）、提取溶媒倍量（倍，B）、提取次數(shù)（次，C）、提取時間（h，D），按L9（34）正交表設(shè)計試驗，以AE的轉(zhuǎn)移率為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳提取工藝，因素水平表見表5，正交設(shè)計試驗結(jié)果見表6，方差分析結(jié)果見表7。

正交試驗直觀分析與方差分析結(jié)果顯示，對試驗結(jié)果影響程度依次為A>C>B>D，其中因素A對提取結(jié)果有顯著影響，故最佳提取工藝為用20倍量70%乙醇提取3次，每次2 h。但是提取時間、提取次數(shù)及溶劑倍數(shù)均對提取結(jié)果沒有顯著影響，且K值都相差不多，從工業(yè)化大生產(chǎn)方面考慮為節(jié)約成本，可選擇70%乙醇提取2次，第1次15倍量提取2 h，第2次10倍量提取1 h。

3.1.5擬選與最佳? 取獼猴桃葉藥材6份，每份100 g。按擬選與最佳工藝分別平行提取3份，測定AE得率及轉(zhuǎn)移率，具體見表8。結(jié)果顯示，擬選工藝與最佳工藝相比，AE的得率及轉(zhuǎn)移率均無明顯減少，提取率都達(dá)到了85%以上。相比最佳工藝，擬選工藝更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

3.2純化工藝考察

在前期研究中發(fā)現(xiàn)由于獼猴桃葉的提取液富含大量的葉綠素類極容易被大孔樹脂吸附且難以解吸附的成分，對樹脂傷害極大，且大孔樹脂的純化效果不理想，故選擇采用溶劑沉淀法進(jìn)行純化。

3.2.1獼猴桃葉提取液制備? 取獼猴桃葉藥材適量，加入70%乙醇提取2次，第1次15倍量提取2 h，第2次10倍量提取1 h，合并2次提取液，濃縮至無醇味。

3.2.2濃縮液濃度考察? 取適量獼猴桃葉提取液，分別濃縮至1.00、0.50、0.25、0.10 g生藥/ml，濃縮液靜置過夜后，棄去上清液，測定沉淀中AE的含量，計算轉(zhuǎn)移率，具體見表9。結(jié)果顯示，濃縮液濃度為1.00 g生藥/ml時雖然AE的含量最高，但轉(zhuǎn)移率卻很低，說明損失較大。而濃縮液濃度為0.50 g生藥/ml時AE轉(zhuǎn)移率較高且含量也較高，故選擇濃縮液濃度為0.50 g生藥/ml。

3.2.3醇沉液乙醇濃度考察? 獼猴桃葉在經(jīng)過醇提水沉后，雖然已經(jīng)將大部分水溶性雜質(zhì)去掉，但一些極性中等的雜質(zhì)如黃酮類成分還未除去，故還需再加入低濃度乙醇將這部分雜質(zhì)去掉。

取獼猴桃葉提取液，濃縮至0.50 g生藥/ml，濃縮液靜置過夜后，棄去上清液，取沉淀，分別加入20%、30%、40%、50%乙醇至濃度為0.50 g生藥/ml，充分?jǐn)嚢瑁o置8 h后，棄去上清液，測定沉淀中AE的含量及轉(zhuǎn)移率，具體見表10。結(jié)果顯示，隨著乙醇濃度的增加，AE含量也逐漸增加，但轉(zhuǎn)移率卻逐漸降低，乙醇濃度為30%時含量及轉(zhuǎn)移率都較高，故選擇醇沉液乙醇濃度為30%。

3.2.4醇沉液用量考察? 取獼猴桃葉提取液，濃縮至0.50 g生藥/ml，濃縮液靜置過夜后，棄去上清液，取沉淀，分別加入30%乙醇至濃度為1.00、0.50、0.25、0.10 g生藥/ml，充分?jǐn)嚢瑁o置8 h后，棄去上清液，測定沉淀中AE的含量及轉(zhuǎn)移率，具體見表11。結(jié)果顯示，當(dāng)加入30%乙醇至濃度為1.00 g生藥/ml時含量較低，而另外三組含量及轉(zhuǎn)移率均差別不大，為節(jié)省溶劑用量，選擇醇沉液用量為加入30%乙醇至濃度為0.50 g生藥/ml。

純化工藝進(jìn)行到這一步已將大部分雜質(zhì)去除，但一些極性很小、黏性極大的成分如葉綠素類還未除去，從而導(dǎo)致沉淀極難干燥。因此最后加入適量石油醚（60-90）充分洗滌至石油醚液顏色接近澄清，從而將這部分雜質(zhì)去掉。

3.2.5純化工藝驗證? 取3份獼猴桃葉，每份100 g，加入70%乙醇提取2次，第1次15倍量提取2 h，第2次10倍量提取1 h，合并2次提取液，濾液濃縮至0.50 g生藥/ml，濃縮液靜置8 h后，棄去上清液，取沉淀，加入30%乙醇至濃度為0.50 g生藥/ml，充分?jǐn)嚢?，再靜置8 h，棄去上清液，取沉淀，加入適量石油醚（60-90）充分洗滌，測定沉淀中AE的含量及得率，具體見表12。結(jié)果顯示，純化工藝穩(wěn)定、合理、可行，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)。最終得到的中間體AE平均含量為36.25%，從藥材到中間體的得率也達(dá)到55.96%。

4小結(jié)與展望

本實驗以AE為指標(biāo)成分，利用HPLC-ELSD建立了獼猴桃葉中AE的含量測定方法，該方法穩(wěn)定可行。利用該方法測定了5個不同產(chǎn)地的獼猴桃葉中AE的含量，結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地之間含量差異較大，含量最高的是麗水市達(dá)到了1.15%，而含量最低的是溫州永嘉縣僅為0.55%，后續(xù)應(yīng)收集更多產(chǎn)地的獼猴桃葉進(jìn)行對比研究，以此確定一個或多個最佳產(chǎn)地。

本實驗考察得到了最佳提取及純化工藝。通過提取純化得到的中間體AE平均含量為36.25%，從藥材到中間體的得率也達(dá)到55.96%。經(jīng)本實驗優(yōu)化得到的獼猴桃葉提取及純化工藝在保證得率的同時兼顧簡便、耗能低、工藝穩(wěn)定可行等優(yōu)點，更利于工業(yè)化大生產(chǎn)。且中間體中主要含三萜類成分，為后續(xù)的藥理、毒理以及制劑研究提供堅實的基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2020-04-02）