管碟法測定抗生素效價影響因素與控制方法的研究進(jìn)展

任仲麗 張秀花 王靜 李秀菊 劉博

[摘要]管碟法是目前國內(nèi)外常用的抗生素微生物檢定法，方法經(jīng)典成熟，靈敏度高，能直觀地反映抗生素藥品的抗菌活性。本文通過查閱資料及實際操作經(jīng)驗總結(jié)，對管碟法測定抗生素效價的影響因素進(jìn)行分析、歸納，并提出合理有效的解決方案，旨在減少外界與人為因素引起的誤差，使測定結(jié)果與真實值更為接近，使試驗的準(zhǔn)確性得到有效提高。

[關(guān)鍵詞]管碟法;抗生素效價;影響因素;準(zhǔn)確性

[中圖分類號] R927.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）9（a）-0027-04

[Abstract] The cylinder-plate method is a commonly used method for microbiological assay of antibiotics at home and abroad. The method is classical and mature， with high sensitivity， and can directly reflect the antibacterial activity of antibiotics. This paper analyzes and summarizes the factors influencing on the assay of antibiotic microbiological by cylinder-plate method through data review and practical experience summary， and puts forward reasonable and effective solutions to reduce the errors caused by external and human factors， so that the measurement results are closer to the real value and the accuracy of the test is effectively improved.

[Key words] Cylinder-plate method; Antibiotic microbiological assay; Influence factors; Accuracy

《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP 2015）四部通則[1]1201抗生素微生物檢定法包括管碟法和比濁法，其中管碟法測定的品種共35個，是目前國內(nèi)外常用的抗生素微生物檢定法，利用抗生素溶液在含有特定試驗菌的瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)成球面形擴散，一定時間內(nèi)，試驗菌的生長與抗生素溶液的擴散達(dá)到動態(tài)平衡，瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)透明的抑菌圈[2]，抗生素濃度對數(shù)劑量與抑菌圈直徑呈直線關(guān)系，通過比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品產(chǎn)生的抑菌圈直徑大小，計算出供試品的抗生素效價[1]。

管碟法以擴散原理為基礎(chǔ)，因此與擴散作用有關(guān)的因素，如擴散系數(shù)、擴散時間、抗生素溶液的濃度等因素都影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性[3]。本文按照試驗的步驟（圖1），就影響管碟法的重要因素進(jìn)行歸納，并提出合理有效的解決方案，減少外界與人為因素引起的誤差，使測定結(jié)果與真實值更為接近，提高試驗的準(zhǔn)確性[2]。

1環(huán)境

操作室應(yīng)分兩部分：一部分為一般操作區(qū)，另一部分為半無菌操作區(qū)，其中半無菌操作區(qū)溫度應(yīng)控制在20～25℃，空氣凈化級別至少為萬級，并設(shè)有紫外線滅菌燈或其他滅菌設(shè)備。操作臺面應(yīng)定期進(jìn)行水平檢查，避免由于操作臺面不水平而造成培養(yǎng)基厚薄不均，影響后續(xù)試驗[4]。建議使用生物安全柜。

2試驗器材的準(zhǔn)備

與試驗有關(guān)的所有試驗器材都必須經(jīng)過嚴(yán)格的滅菌，移液管、滴定管、容量瓶等玻璃容器應(yīng)進(jìn)行標(biāo)定，并符合A級要求;天平應(yīng)滿足品種稱量的精度要求，進(jìn)行檢定并符合規(guī)定[2]。

2.1雙碟

建議選用同廠家、同批次產(chǎn)品。試驗時應(yīng)挑選碟底厚薄均勻，水平透明，無色斑氣泡的雙碟，避免因底面的凹凸不平造成培養(yǎng)基厚薄不均?？蓪㈦p碟放在水平臺面上，下墊一張白紙，雙碟內(nèi)加水2～3 ml，再滴加藍(lán)墨水，根據(jù)藍(lán)色深淺是否一致來判斷雙碟底面是否平整。

2.2鋼管

建議選用內(nèi)外壁及兩端平坦、光滑、管壁厚薄均勻一致的，且為同一廠家的同一最小包裝產(chǎn)品，使鋼管在培養(yǎng)基中沉降深度相同，溶液擴散均勻一致;若兩端不平坦，溶液容易側(cè)漏[5]。鋼管的清潔也是影響試驗成敗的關(guān)鍵因素，如果鋼管殘留微量抗生素或被其他殺菌劑污染，會使抑菌圈破裂，因此鋼管的清洗一定要徹底。被污染的鋼管應(yīng)用清潔液浸泡2 h后，再用蒸餾水或純化水清洗干凈，滅菌后方可使用，逐個稱量仍能使用的鋼管，按重量分套（每套鋼管重量差異不超過±50 mg）使用[6-7]。曾東方等[8]的研究采用一次性無菌塑料吸管代替牛津杯進(jìn)行簡易試驗。

2.3滴管

試驗時挑選管口光滑，口徑大小適當(dāng)，垂直滴下時液滴大小以每毫升20滴為宜。使用前在清潔液中浸泡不少于24 h，然后用蒸餾水或純化水沖洗3次，置適當(dāng)容器中，150～160℃干熱滅菌2 h備用。

3供試品、標(biāo)準(zhǔn)品、緩沖液與培養(yǎng)基的準(zhǔn)備

用于菌種傳代的培養(yǎng)基及抗生素檢定培養(yǎng)基的來源對抗生素效價測定均有影響，因此通常需進(jìn)行預(yù)試驗以確定最佳的試驗條件[9]。

3.1供試品、標(biāo)準(zhǔn)品

供試品與標(biāo)準(zhǔn)品稱量的不確定度對抗生素效價測定有一定的影響，稱量前先將標(biāo)準(zhǔn)品從冰箱中取出，使其溫度與室溫達(dá)到平衡;供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的稱量應(yīng)使用同一天平;盡量一次性稱取，建議供試品稱取量不少于50 mg，標(biāo)準(zhǔn)品稱取量不少于20 mg[10-11]。供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的溶解稀釋的不確定度對抗生素效價測定的影響較大，因此《中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》（2019年版）中“抗生素微生物檢定法”相關(guān)要求規(guī)定，玻璃容器均應(yīng)符合《常用玻璃量器檢定規(guī)程》里的A級要求，每步稀釋取量不得少于2 ml，總稀釋步驟一般不超過3步[11-12]。按ChP 2015規(guī)定，供試品水解可以采用40℃放置6 h或室溫放置16 h。中國合格評定國家認(rèn)可委員會（CNAS）《抗生素微生物檢定法測定藥品含量》能力驗證（T0426）對85家實驗室進(jìn)行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)兩種方法無顯著差異，但是供試品和標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)采用同種水解方法，并嚴(yán)格按照規(guī)定的溫度和時間放置，否則即為對標(biāo)準(zhǔn)方法的偏離[4]。

3.2緩沖液、培養(yǎng)基

配制緩沖液與培養(yǎng)基時要嚴(yán)格按照說明書的要求配制，配制緩沖液的試劑應(yīng)為分析純的化學(xué)試劑，培養(yǎng)基來源應(yīng)相對固定，嚴(yán)格按照要求的pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，由于pH值的不同可能會出現(xiàn)卵圓形抑菌圈，培養(yǎng)基酸堿度會顯著的提升或抑制抗生素的殺菌作用，堿性條件下，抗生素甚至失去殺菌作用[13-14]。姚永青等[9]研究發(fā)現(xiàn)由于國內(nèi)培養(yǎng)基質(zhì)量參差不齊，應(yīng)對培養(yǎng)基質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格控制，在用管碟法做抗生素效價測定時，應(yīng)選擇最適傳代培養(yǎng)基與檢定培養(yǎng)基作為試驗的系統(tǒng)適用性條件。

4試驗菌的制備

試驗菌株特性發(fā)生變異，也會嚴(yán)重影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，ChP 2015明確規(guī)定試驗菌應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)菌株，并規(guī)定了菌株編號和菌懸液的制備方法，保證制備菌懸液的菌株在3～5代，并采用適宜的菌種保藏技術(shù)保存菌懸液及菌種培養(yǎng)物，保證試驗菌株的生物學(xué)特征不變[15]。試驗菌株的菌齡不等，會導(dǎo)致抑菌圈的擴散系數(shù)不均勻，進(jìn)而導(dǎo)致抑菌圈的邊緣不清晰，這也是影響試驗結(jié)果的重要因素之一[14]。

菌液的復(fù)蘇也是試驗成敗的關(guān)鍵因素，要掌握好復(fù)蘇時間，過短菌種沒有蘇醒，過長菌種又進(jìn)入了休眠狀態(tài)[10]。試驗菌菌種濃度過小，抑菌圈邊緣模糊不清;濃度過大，抑菌圈太小，因此在不能掌握菌種濃度的情況下，可以先做一下預(yù)試驗[16-17]。

5試驗操作

5.1制備雙碟

加注底層培養(yǎng)基，體積控制在20 ml。底層培養(yǎng)基太少，抑菌圈過大，底層培養(yǎng)基太多，鋼管會被陶瓦蓋壓入菌層培養(yǎng)基，導(dǎo)致液體無法滲出。加注菌層培養(yǎng)基時應(yīng)將培養(yǎng)基放在水浴中保溫，細(xì)菌控制在48～50℃，芽孢控制在60℃，菌層培養(yǎng)基體積為5 ml，加注時要迅速轉(zhuǎn)動雙碟使培養(yǎng)基均勻平鋪開[2]。環(huán)境溫度對培養(yǎng)基的均勻鋪開有較大的影響，溫度太低很容易造成培養(yǎng)基沒有擴散開已凝固，應(yīng)控制在20～25℃[12]。由于管碟法的可信限率不好控制，往往需增加培養(yǎng)基數(shù)量才能獲得規(guī)定的可信限率，最好多制備幾個雙碟，一般制備10個[18]。

5.2放置鋼管

放置鋼管要從同一高度平穩(wěn)、垂直放置，相應(yīng)劑量的鋼管對角均勻放置，且注意鋼管與鋼管，鋼管與雙碟邊緣的距離，依個人實踐經(jīng)驗，建議使用鋼管自動放置器，鋼管在瓊脂培養(yǎng)基上靜置5～10 min沉降穩(wěn)定后，再滴加抗生素溶液[12]。

5.3滴加抗生素溶液

常艷等[19]研究發(fā)現(xiàn)試驗中按照SH→TH→SL→TL的順序，先滴加標(biāo)準(zhǔn)品溶液時，測定結(jié)果偏低;按照TH→SH→TL→SL的順序，先滴加供試品溶液時，測定結(jié)果偏高;且差值（PT測定-PT真值）均隨滴加抗生素溶液時間的延長而增大;建議采用兩組試驗按兩種順序平行試驗，消除滴加抗生素溶液順序引入的系統(tǒng)誤差，并對試驗結(jié)果進(jìn)行合并計算。

滴加抗生素溶液時，滴管應(yīng)和鋼管保持適當(dāng)?shù)木嚯x，不宜離管口太高，以防溶液濺出，滴落在培養(yǎng)基表面;亦不宜過低，以防觸碰鋼管，使鋼管與培養(yǎng)基分離[14]。用滴管加樣時，管口不宜過大，管口過大液滴容易封閉鋼管，底部氣體無法移出，導(dǎo)致無圈;加樣量一定要適量，滴加量過多溢出導(dǎo)致抑菌圈不圓，量太少則抑菌圈直徑達(dá)不到18～22 mm。滴加時間不易過長，因為鋼管內(nèi)溶液擴散時間不同，會影響測量結(jié)果的準(zhǔn)確性[13]。邰順章等[20]通過利用自制玻璃滴管、1 ml卡介苗注射器、微量移液器3種加樣方法比較，發(fā)現(xiàn)采用微量移液器定量加樣，能高效的控制擴散時間和加樣量，回歸和可信限率都有明顯的提高，偏離平行略有提高。蔣惠嵐[21]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)用微量移液器加抗生素溶液時，加270 μl抗生素溶液最合適，可以獲得滿意的可信限率（≤5%），誤差更小，并可節(jié)約大量時間。常艷等[19]研究發(fā)現(xiàn)管碟法以每組10個培養(yǎng)皿計，當(dāng)點樣時間控制到10 min以內(nèi)時，測定結(jié)果與真值極為接近，可以忽略因點樣時間引入的誤差，因此建議點樣時間最多不超過10 min。

6雙碟的培養(yǎng)

滴加了抗生素溶液的雙碟要輕拿輕放，雙碟要與培養(yǎng)箱保持一定的距離且雙碟疊放不能超過3個，保證雙碟的溫度一致，使試驗菌生長速度一致，減小試驗誤差[2]。

7抑菌圈的測量

使用抑菌圈自動測量儀測量結(jié)果時，抑菌圈清晰度對測量結(jié)果影響非常大，建議試驗時根據(jù)具體的明暗程度，調(diào)節(jié)抑菌圈自動測量儀的清晰度[10]。抑菌圈自動測量儀是應(yīng)用光電轉(zhuǎn)換、光耦合裝置（CCD）掃描、模數(shù)變換（AD變換）等技術(shù)，通過測量抑菌圈直徑，折算出抗生素效價含量的儀器，測量結(jié)果由計算機直接輸出，但多數(shù)生產(chǎn)廠家并沒有給出效價測定的技術(shù)要求，因此，應(yīng)對儀器進(jìn)行檢定校準(zhǔn)的方法研究，用以評價測量系統(tǒng)的性能[22]。試驗所用的抑菌圈自動測量儀應(yīng)每年或每半年定期進(jìn)行圖像、回收率試驗誤差、重復(fù)測量的精密度等指標(biāo)校準(zhǔn)[7]。常艷等[19]研究發(fā)現(xiàn)，不能正確計算估計效價（AT）和濃度比（D）會導(dǎo)致結(jié)論由不符合規(guī)定變?yōu)榉弦?guī)定，或者相反。

8小結(jié)

管碟法是國際上通用的、經(jīng)典的抗生素效價測定方法，在各國藥典中被普遍采用，隨著高效液相色譜法（HPLC）等化學(xué)分析技術(shù)的快速發(fā)展，很多抗生素品種已使用化學(xué)分析方法測定效價，但管碟法能夠直觀、特異性地反映抗生素的抗菌活性，與臨床具有一致性，因此在各國藥典中仍占有重要的地位[9]。

本文通過對管碟法測定抗生素效價的影響因素進(jìn)行歸納，提示試驗人員在操作過程中，嚴(yán)格按照操作規(guī)范，謹(jǐn)慎小心操作，減少外界與人為因素引起的誤差，使測定結(jié)果與真實值更為接近，提高試驗的準(zhǔn)確性。

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（收稿日期：2020-03-27? 本文編輯：孟慶卿）