同種異體移植方法小鼠子宮內(nèi)膜異位癥纖維化模型的建立

常翔宇 鄧夢(mèng)琪 張艷芹 吳迪 苗勁蔚

[摘要] 目的 探討利用同種異體移植，建立子宮內(nèi)膜異位癥纖維化小鼠模型的可行性。 方法 將36只BALB/c小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、供體組，每組12只小鼠。供體組小鼠摘取子宮角，剪碎制成子宮組織懸液，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射子宮組織懸液，對(duì)照組注射等量磷酸鹽緩沖液。注入子宮組織懸液第7、14天，開腹觀察模型是否成功并進(jìn)行病理驗(yàn)證。 結(jié)果 注入子宮組織懸液第14天，實(shí)驗(yàn)組建模成功且纖維化特征明顯。 結(jié)論 同種異體移植方法能夠成功構(gòu)建鼠子宮內(nèi)膜異位癥纖維化模型。

[關(guān)鍵詞] 子宮內(nèi)膜異位癥;纖維化;移植;鼠模型

[中圖分類號(hào)] R711.71? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）09（a）-0015-04

[Abstract] Objective To explore the feasibility of using allogeneic transplantation to establish a mouse model of endometriosis. Methods Thirty-six BALB/c mice were randomly divided into experimental group， control group and donor group， with 12 mice in each groups. The uterine horn was extracted from donor group and cut into pieces to make the uterine tissue suspension. Experimental group was intraperitoneally injected with uterine tissue suspension， while control group was injected with phosphate buffer solution. On the 7th and 14th days after uterine tissue suspension injected， the success of the model was observed by laparotomy and pathological verification was conducted. Results On the 14th day after uterine tissue suspension was injected， the modeling of experimental group was successful and the fibrosis characteristics were obvious. Conclusion The allogeneic transplantation method can be used to construct mice model of endometriosis fibrosis.

[Key words] Endometriosis; Fibrosis; Transplant; Mice model

子宮內(nèi)膜異位癥（以下簡(jiǎn)稱“內(nèi)異癥”）是育齡期婦女常見的婦科疾病，10%～14%的育齡婦女有痛經(jīng)、性交困難和不孕癥等癥狀，盆腔疼痛患者和不孕癥患者的數(shù)量達(dá)到35%～50%[1-2]。目前關(guān)于內(nèi)異癥發(fā)生機(jī)制的研究，最被接受的是桑普森假說[3]，即月經(jīng)期子宮內(nèi)膜組織通過輸卵管逆行進(jìn)入盆腔，附著并侵入腔內(nèi)的組織和器官。內(nèi)異癥的病變范圍較廣，復(fù)發(fā)和侵襲能力較強(qiáng)。病理學(xué)特點(diǎn)是異位生長(zhǎng)的子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)周圍被致密的纖維化組織包繞。過度的纖維化可引起瘢痕、慢性疼痛和組織功能改變，引起痛經(jīng)、盆腔痛及不孕等臨床癥狀，因此纖維化是該病的核心病理變化。但目前尚未有文獻(xiàn)闡明內(nèi)異癥纖維化的形成機(jī)制，鑒于人類實(shí)驗(yàn)的明顯局限性和倫理考慮，目前使用內(nèi)異癥嚙齒動(dòng)物模型來研究疾病的病理生理學(xué)要素。因此，建立成熟和適合的動(dòng)物模型對(duì)于研究?jī)?nèi)異癥纖維化發(fā)病機(jī)制和治療手段十分重要。本文通過模擬經(jīng)血逆流，利用同種異體移植的方法[4]建立鼠內(nèi)異癥纖維化動(dòng)物模型。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

15～20 g BALB/c鼠36只，雌性，6～8周，購自北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SLXK（粵）2004-0011，質(zhì)量合格證明編號(hào)：SCXK（京）20160006]。小鼠飼養(yǎng)設(shè)備由國家蛋白質(zhì)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，12 h明暗交替飼養(yǎng)環(huán)境，SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)化環(huán)境飼養(yǎng)。本研究經(jīng)解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物手術(shù)臺(tái)（PT100）、脫水機(jī)（JJ-12J）、包埋機(jī)（JB-P5）、病理切片機(jī)（RM2016）均購自Harvard Apparatus公司;正置熒光顯微鏡（NIKON ECLIPSE C1）、成像系統(tǒng)（NIKON DS-U3）均購自日本NIKON公司;一抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）（ab6992，1∶1000），Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ）（ab34710，1∶2000），結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）ab6992（ab6992，1∶1000）均購自美國Abcam公司;二抗HRP標(biāo)記山羊抗兔（GB23303， 1∶500）購自武漢賽維爾生物科技有限公司;DMEM/F12培養(yǎng)液;蘇木精染液;伊紅染液;戊二醛;75%酒精;95%酒精;亞甲基藍(lán)等。

1.3 動(dòng)物分組與模型建立

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、供體組，每組12只。供體組CO2麻醉處死，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物手術(shù)臺(tái)中解剖，剪取子宮角，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗血跡，并剪碎形成子宮組織懸液。實(shí)驗(yàn)組小鼠消毒后以下腹部腹中線臍下為穿刺點(diǎn)，注入0.5 mL子宮組織懸液[5-8]，對(duì)照組注入等量的PBS。從模型建立日起，兩組給予雌激素（苯甲酸雌二醇）30 Fg/kg，1次/3 d，腿部肌內(nèi)注射誘導(dǎo)內(nèi)異癥形成。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

定期測(cè)兩組小鼠的體重，并觀察其皮色、飲食、大小便、活動(dòng)等情況及有無生病、死亡等。第7、14天隨機(jī)選取兩組各6只小鼠進(jìn)行開腹探查。CO2麻醉處死，采用腹中線切口，大小約3 cm，打開盆腹腔，觀察異位病灶的生長(zhǎng)情況，包括位置、大小、數(shù)目及其與周圍臟器的關(guān)系、顏色、周圍血管生成情況。取異位病灶標(biāo)本，放入4%多聚甲醛中保存，石蠟包埋切片。

1.4.1 蘇木精-伊紅（HE）? 將切片放入蘇木精水溶液中染色數(shù)分鐘，酸水及氨水中分色，各數(shù)秒鐘，流水沖洗1 h后入蒸餾水片刻，70%和90%酒精中脫水各10 min，酒精伊紅染色液染色2～3 min，染色后的切片純酒精脫水，二甲苯透明，將已透明的切片滴加拿大樹膠，蓋上蓋玻片封固。待樹膠略干，觀察。

1.4.2 Masson染色? 切片依次經(jīng)自來水和蒸餾洗滌，Regaud或Weigert蘇木精液染5～10 min，充分洗滌，若組織染色過度可用鹽酸酒精分化，蒸餾水洗，Masson麗春紅酸性復(fù)紅液5～10 min，2%冰醋酸水溶液浸洗片刻;1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min，不經(jīng)水洗，直接用苯胺藍(lán)或光綠液染5 min，0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，95%酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠封固。染色后的組織鏡下可見膠原纖維、黏液、軟骨呈藍(lán)色（光綠液染色為綠色），胞漿、肌肉、纖維素、神經(jīng)膠質(zhì)呈紅色，胞核黑藍(lán)色。

1.5 免疫組化

組織抗原修復(fù)，滴加BSA孵育30 min。切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，4℃孵育過夜。玻片置于PBS（PH=7.4）中，脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50 min。加CY3試劑，加第二種一抗，加對(duì)應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗，加FITC試劑，切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）內(nèi)4℃孵育過夜。加對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，加CY5試劑自發(fā)熒光淬滅，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，封片。切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：TIANScript RT Kit qPCR試劑盒，SYBR FAST qPCR Kit Master Mix（2×） Universal（KK4602，美國KAPA Biosystems）;Trizol：invitrogen，氯仿，異丙醇等均購于北京化學(xué)試劑廠。提取樣本總RNA，取8 μL RNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。將RNA模板、引物、5×RT mix和RNase-free Water溶解并置于冰上備用。反應(yīng)管中加入20 μL反應(yīng)體系的第一部分，混勻。65℃孵育5 min，迅速冰浴2～10 min，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。輕輕吸打混勻，37℃孵育40 min。反應(yīng)結(jié)束后70℃保溫10 min。采用熒光定量PCR儀（ABI7500，美國ABI公司），2-△△ct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)異癥模型構(gòu)建的成功率及病灶組織觀察

注入子宮組織懸液第7天，實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔內(nèi)未見明顯結(jié)節(jié)形成（圖1A、B），對(duì)照組小鼠無變化（圖1C、D）;注入子宮組織懸液第14天，實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔內(nèi)可見小塊白色病灶，呈隆起小塊狀，多附著于腸壁，形成異位結(jié)節(jié)，質(zhì)軟，與周圍組織輕度粘連，但能分離（圖1E、F），對(duì)照組小鼠無變化（圖1G、H）。建模成功率為100%。

2.2 兩組組織病理分析結(jié)果

2.2.1 HE染色結(jié)果? 在光鏡下觀察病理切片，實(shí)驗(yàn)組異位組織中子宮內(nèi)膜樣腺體和腺上皮細(xì)胞增生活躍，散在間質(zhì)細(xì)胞，腺體邊緣大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖2。

2.2.2 Masson染色結(jié)果? 在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果， 實(shí)驗(yàn)組異位組織中可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維化明顯可見。見圖3。

2.3 兩組免疫組化結(jié)果

免疫組化檢測(cè)纖維化相關(guān)蛋白CTGF、α-SMA、Collagen Ⅰ的表達(dá)，可見實(shí)驗(yàn)組異位組織中纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)顯著。見圖4（封三）。

2.4 兩組RT-qPCR定量檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組α-SMA、Collagen Ⅰ、CTGF水平高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見圖5。

3 討論

內(nèi)異癥一般認(rèn)為是良性疾病，但患者經(jīng)常遭受慢性盆腔疼痛、性交困難、痛經(jīng)、生育能力低等痛苦。此外，大多內(nèi)異癥女性還表現(xiàn)出一種或多種合并癥，如子宮腺肌病、間質(zhì)性膀胱炎和炎癥性腸病等[9-12]。盡管婦產(chǎn)科學(xué)界對(duì)該病進(jìn)行了大量的研究，但仍然不能從根本上解釋內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制。因此，實(shí)驗(yàn)性內(nèi)異癥的各種動(dòng)物模型的建立，是對(duì)該病有更深理解的必經(jīng)過程。

內(nèi)異癥動(dòng)物模型的選擇以嚙齒、靈長(zhǎng)類為主，靈長(zhǎng)類雖然與人類病理進(jìn)程更為相似，但其價(jià)格昂貴且稀有，難以進(jìn)行大樣本量的實(shí)驗(yàn)研究，考慮到動(dòng)物倫理，故其并不能成為很好的研究對(duì)象。嚙齒類動(dòng)物因其價(jià)格低廉、飼養(yǎng)方便、來源廣泛而最常用。嚙齒類動(dòng)物繁殖能力強(qiáng)，動(dòng)情周期短而規(guī)律，但因其沒有內(nèi)膜脫落，故不能自發(fā)形成異位病灶。小鼠作為內(nèi)異癥的動(dòng)物模型有潛在的優(yōu)勢(shì)：首先，腹膜接種子宮碎片更類似于女性逆流經(jīng)血;第二，供體或受體動(dòng)物可以在誘導(dǎo)之前進(jìn)行干預(yù)而后進(jìn)行治療性研究[13-15]。在嚙齒類動(dòng)物中，裸鼠及SCID小鼠是嚴(yán)重的免疫缺陷小鼠，也是建立內(nèi)異癥模型的理想動(dòng)物[16]。但隨著時(shí)間的推移，裸鼠和SCID小鼠免疫功能會(huì)逐漸恢復(fù)[17-18]，嚴(yán)重限制了它的效用。

本實(shí)驗(yàn)選用的BALB/c鼠采用同種異體移植/腹腔注射的方法，成功建立了內(nèi)異癥動(dòng)物模型，并對(duì)形成的腹腔結(jié)節(jié)進(jìn)行檢測(cè)及病理分析，病理切片顯示纖維化特征明顯，同時(shí)對(duì)纖維化相關(guān)蛋白CTGF、α-SMA、Collagen Ⅰ進(jìn)行免疫組化及RT-qPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組α-SMA、Collagen Ⅰ、CTGF水平高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。腹腔注射方法與女性逆行性月經(jīng)理論更為契合，與裸鼠比較，該類小鼠飼養(yǎng)條件更為寬松，動(dòng)物存活率更高，一定程度上提高了建模成功率，且無需進(jìn)行手術(shù)操作。造模過程中的手術(shù)操作、縫線等異物刺激，可引起炎癥反應(yīng)，而內(nèi)異癥本身是一種慢性炎癥性疾病[19-20]，因此腹腔注射避免了這一問題。

該方法簡(jiǎn)便且成功率高，建模周期短，成功避免了手術(shù)操作等帶來的炎癥問題，且異位病灶符合內(nèi)異癥纖維化的病理特點(diǎn)，可作為研究?jī)?nèi)異癥纖維化的簡(jiǎn)便動(dòng)物模型。通過同種異體移植模型，可對(duì)供體鼠進(jìn)行基因敲除等預(yù)處理，滿足纖維化的多種機(jī)制研究，在內(nèi)異癥纖維化的研究中廣泛應(yīng)用。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? Falcone T，F(xiàn)lyckt R. Clinical Management of Endometriosis [J]. Obstet Gynecol，2018，131（3）：557-571.

[2]? Angioni S. New Insights on Endometriosis [J]. Minerva Ginecol Actions，2017，69（5）：438-439.

[3]? Samspon JEA. Peritoneal endometriosis due to menstrual dissemenation of endometrial tissues into the peritoneal cavity [J]. Am J Obstet Gynecol，1927，14（4）：93-94.

[4]? Arends MJ，White ES，Whitelaw CBA. Animal and cellular models of human disease [J]. J Pathol，2016，238（2）：137-140.

[5]? Peterse D，Binda MM，O DF，et al. Of Mice and Women： A Laparoscopic Mouse Model for Endometriosis [J]. J Minim Invasive Gynecol，2018，25（4）：578-579.

[6]? Ni HJ，Zhang Z，Dai YD，et al. Establishment of endometriosis subcutaneous model in immunodeficient nude mice [J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2016，96（33）：2675-2677.

[7]? Greaves E，Cousins FL，Murray A，et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium [J]. Am J Pathol，2014，184（7）：1930-1939.

[8]? Dodds KN，Beckett EAH，Evans SF，et al. Lesion development is modulated by the natural estrous cycle and mouse strain in a minimally invasive model of endometriosis [J]. Biol Reprod，2017，97（6）：810-821.

[9]? Dara？觔 E，Ploteau S，Ballester M，et al. Pathogenesis， genetics and diagnosis of endometriosis [J]. Presse Med，2017，46（12）：1156-1165.

[10]? Struble J，Reid S，Bedaiwy MA. Adenomyosis： A clinical review of a challenging gynecologic condition [J]. J Minim Invasive Gynecol，2016，23（2）：164-185.

[11]? Tirlapur SA，Kuhrt K，Chaliha C，et al. The′evil twin syndrome′ in chronic pelvic pain：a systematic review of prevalence studies of bladder pain syndrome and endometriosis [J]. Int J Surg，2013，11（3）：233-237.

[12]? Greene AD，Lang SA，Kendziorski JA，et al. Endometriosis：where are we and where are we going？[J]. Reproduction，2016，152（3）：R63-R78.

[13]? Wei X，Shao X. Nobiletin alleviates endometriosis via down-regulating NF-κB activity in endometriosis mouse model [J]. Biosci Rep，2018，38（3）：BSR20180470.

[14]? Feng D，Menger MD，Wang H，et al. Luminal epithelium in endometrial fragments affects their vascularization，growth and morphological development into endometriosis-like lesions in mice [J]. Dis Model Mech，2014，7（2）：225-232.

[15]? Perelló M，González-Foruria I，Castillo P，et al. Oral Administration of Pentoxifylline Reduces Endometriosis-Like Lesions in a Nude Mouse Model [J]. Reprod Sci，2017，24（6）：911-918.

[16]? Wilson MR，Holladay J，Ronald LC. A Mouse Model of Endometriosis Mimicking the Natural Spread of Invasive Endometrium [J]. Hum Reprod， 2020，35（1）：58-69.

[17]? Bruner-Tran KL，Mokshagundam S，Jennifer LH，et al. Rodent Models of Experimental Endometriosis：Identifying Mechanisms of Disease and Therapeutic Targets [J]. Curr Womens Health Rev，2018，14（2）：173-188.

[18]? Porada CD，Sanada C，Kuo CJ，et al. Phenotypic Correction of Hemophilia A in Sheep by Postnatal Intraperitoneal Transplantation of FⅧ-expressing MSC [J]. Exp Hematol，2011，39（12）：1124-1135.e4.

[19]? 單婧，程雯，翟東霞，等.子宮內(nèi)膜異位癥嚙齒類動(dòng)物模型研究進(jìn)展[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2017，26（5）：498-501.

[20]? 徐妍，何玨.子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠接受米非司酮干預(yù)后炎性因子、侵襲和凋亡基因表達(dá)的評(píng)估[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2017，23（9）：1169-1174.

（收稿日期：2019-12-17）