采用“一測多評”法測定含綠原酸中藥及制劑中綠原酸類成分的含量

張秋燕 張妮 張春禮 郭文全 崔翰明

[摘要] 目的 建立含綠原酸成分的中藥及其制劑中所含的6種綠原酸“一測多評”（QAMS）的分析方法。 方法 以乙腈-0.4%磷酸為流動相梯度洗脫、柱溫為25℃、流速為1.0 mL/min、檢測波長為327 nm的高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）法，測定并計算以綠原酸為內(nèi)參物的其他5種綠原酸類成分的相對校正因子;并考察相對校正因子的耐用性，確立以綠原酸為內(nèi)參的QAMS法;分別采用已建立的QAMS分析方法和外標(biāo)法計算含綠原酸中藥（金銀花、野菊花）及其滴眼劑中綠原酸類成分的含量，利用t檢驗和相對誤差分析不同算法的含量差異，評價QAMS法的準(zhǔn)確性;并采用相對保留時間方法對6種成分色譜峰進(jìn)行準(zhǔn)確定位。 結(jié)果 建立的以綠原酸為內(nèi)參物的相對校正因子耐用性良好，采用2種方法計算10批次滴眼劑和3批次金銀花及野菊花中綠原酸類成分的含量，兩者相對誤差范圍為-3.32%～4.99%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 建立的QAMS法可同時用于金銀花、野菊花中藥材及其滴眼劑中6種綠原酸類成分的質(zhì)量評價，具有快速、準(zhǔn)確、方便等特點。

[關(guān)鍵詞] 一測多評法;相對校正因子;滴眼劑;金銀花;野菊花

[中圖分類號] R284.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）09（a）-0010-05

[Abstract] Objective To establish the quantitative analysis of multi-components by single marker （QAMS） method for the analysis of six chlorogenic acids in traditional Chinese medicine and their preparations. Methods A high performance liquid chromatography-photodiode array detector （HPLC-DAD） method was developed with acetonitrile-0.4% phosphoric acid as mobile phase ingradient elution. The column temperature was 25℃. The flow rare was 1.0 mL/min and the detection wavelength was 327 nm. Then the relative correction factors among the other five chlorogenic acids were calculated， when the chlorogenic acid was used as internal referring substances. The ruggedness of relative correction factors was evaluated to establish the QAMS method， when the chlorogenic acid was used as internal referring substances. The content of chlorogenic acid in traditional Chinese medicine （Lonicerae Japonicae Flos and Chrysanthemi Indici Flos） and their eye drops were calculated by the established QAMS method and external standard method respectively， and the content difference of different algorithms was analyzed by t-test and relative error analysis to evaluate the accuracy of the QAMS method. The relative retention time method was used to accurately locate the chromatographic peaks of the six constituents. Results The established relative correction factor with chlorogenic acid as internal referring substances had good ruggedness. Two methods were used to calculate the content of chlorogenic acid in 10 batches of eye drops and three batches of Lonicerae Japonicae Flos and Chrysanthemi Indici Flos. The relative error range was -3.32% to 4.99%， and there was no statistically significant difference （P > 0.05）. Conclusion A rapid， accurate and convenient QAMS method for simultaneous measurement of six chlorogenic acids has been established， and this method can be used for quality analysis of six chlorogenic acids in Lonicerae Japonicae Flos， Chrysanthemi Indici Flos and their eye drops.

[Key words] Quantitative analysis of multi-components by single marker; Relative correction factor; Eye drop; Lonicerae Japonicae Flos; Chrysanthemi Indici Flos

綠原酸是金銀花等多種中藥的主要有效成分之一，具有抗氧化、抗菌、保肝、利膽、保護(hù)心血管、降糖、降壓和抗腫瘤等多種藥理活性[1-5]。綠原酸是咖啡酸和奎尼酸的縮合物，結(jié)構(gòu)中存在酯鍵、不飽和雙鍵和多元酚，隨溫度、酸堿（pH）值和光照等條件的影響發(fā)生水解和分子內(nèi)酯基遷移而發(fā)生異構(gòu)化[6-11]。而從植物中發(fā)現(xiàn)的綠原酸異構(gòu)體包括綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C等[12-14]。因此單獨以綠原酸作為指標(biāo)，并不能充分地表征綠原酸類成分。

睛閱滴眼液是含金銀花、野菊花等的中藥滴眼劑，具有緩解眼睛疲勞、退赤消腫等作用，主要以綠原酸作為質(zhì)控指標(biāo)。但有研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸在生產(chǎn)及儲存時不穩(wěn)定，綠原酸類成分在溶液狀態(tài)下易發(fā)生轉(zhuǎn)化[15]。采用單一成分不能反映其產(chǎn)品整體質(zhì)量，需對綠原酸類成分進(jìn)行多成分的含量分析，便于控制藥材-制劑質(zhì)量。本文采用“一測多評”（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）法對藥材和滴眼劑制劑中的6種綠原酸類成分進(jìn)行測定和分析，以綠原酸為參照成分，建立對另外5種成分的QAMS法，根據(jù)相對校正因子實現(xiàn)多指標(biāo)質(zhì)量分析，并與外標(biāo)法測定結(jié)果進(jìn)行比較，評價該技術(shù)的可行性與適用性。

1 儀器與試藥

高效液相色譜（HPLC）儀（G1311A四元泵、G1329A自動進(jìn)樣器、G1315D二極管陣列檢測器）;Agilent chemstation工作站（Agilent 1200型，美國安捷倫公司）;Agela ASB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱和Agilent TC-C18保護(hù)柱;Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱;YMC ODS-H80（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱;數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DE，昆山市超聲儀器設(shè)備有限公司）;十萬分之一天平（ME 215P型，Sartorius）;超純水機(jī)（Milli-Q，Millipore）。

綠原酸（批號：110753-201817，純度為96.8%），購自中國食品藥品檢定研究院;新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C（批號分別為DST190124-015、DST190118-035、DST190113-036、DST190226-037、DST190110-038，純度分別≥99%、98%、98%、98%、99%），購自成都德思特生物技術(shù)有限公司;乙腈（HPLC級，美國Fisher）;甲醇（色譜淋洗級）、磷酸（A.R.級）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;水為超純水。

試驗用藥：金銀花（產(chǎn)地：河南）、野菊花（產(chǎn)地：安徽）購自北京豐泰金源藥業(yè)有限公司，由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院崔翰明研究員鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾和菊科植物野菊Ghrysanthemum indicum L.的干燥頭狀花序;睛閱滴眼液為中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院中藥研發(fā)中心自制（批號分別為1901151、1901152、1901153、1902251、1902252、1902253、1904261、1904262、1904263、1904264）。

2 方法與結(jié)果

2.1 實驗方法

2.1.1 色譜條件? Agela ASB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱和Agilent TC-C18保護(hù)柱，流動相為乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B），梯度洗脫0～15 min，5%～20% A;15～30 min，20%～30% A;30～40 min，30%A;柱溫為25℃，流速為1.0 mL/min，檢測波長327 nm，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果顯示，6個待測組分色譜峰分離效果良好。見圖1。

2.1.2 混合對照品溶液的配制? 取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C對照品適量，精密稱定，置于量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至10 mL，配制成濃度分別為261、311、217、209、203、216 μg/mL的混合對照品溶液，再用甲醇稀釋成系列混合對照品溶液。

2.1.3 供試液的制備? 金銀花藥材供試液：精密稱量過60目篩的金銀花粉末約0.5 g，置于具塞三角瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL并稱重，超聲提取30 min，晾涼并補重，搖勻，過濾，即可。野菊花藥材供試液：精密稱量過60目篩的野菊花粉末約1.5g ，置于具塞三角瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，并稱重，超聲提取30 min，晾涼并補重，搖勻，過濾，即可。滴眼劑供試液：精密移取滴眼劑1 mL，置于10 mL量瓶中，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即可。

2.1.4 相對校正因子的原理和計算? 在一定范圍內(nèi)（線性范圍內(nèi)）成分的量（質(zhì)量或濃度）與檢測器響應(yīng)成正比，即：W = fA（W表示成分的量，A表示響應(yīng)值，f表示相對校正因子）[16-17]。選取某一典型成分作為內(nèi)參物，建立該成分與其他成分之間的相對校正因子fk/i，fk/i = （Ai×Wk）/（Ak×Wi），其中A、W分別為色譜峰的峰面積、成分的質(zhì)量濃度（單位：μg/mL），下標(biāo)k、i分別代表內(nèi)參物及待測成分。根據(jù)公式求算以綠原酸為參照成分時，其他5種綠原酸類成分的相對校正因子（fk/i）。

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 線性關(guān)系考察? 按“2.1.1”項下色譜條件測定系列混合對照品溶液，并以對照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸處理，結(jié)果顯示，6種綠原酸成分在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見表1。

2.2.2 精密度試驗? 精密吸取混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，計算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C的日內(nèi)精密度，其RSD分別為0.22%、0.34%、0.61%、0.82%、0.78%、1.59%。精密吸取中濃度的混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 d，計算6個綠原酸類成分的日間精密度，RSD分別是0.86%、0.78%、0.60%、0.93%、0.96%、 1.79%。結(jié)果提示，儀器的精密度良好，綠原酸類成分在甲醇溶液中6 d內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗? 分別取金銀花、野菊花粉末和滴眼劑各6份，精密稱定或量取，按“2.1.3”項下制備樣品供試液，按“2.1.1”項下色譜條件測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算6個綠原酸類成分的含量，金銀花中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C含量的RSD分別為0.95%、1.07%、1.54%、2.13%、2.90%，野菊花中綠原酸成分含量的RSD依次為4.83%、3.17%、3.35%、2.87%、2.23%、2.76%;滴眼劑中綠原酸成分含量的RSD依次為0.95%、0.86%、0.85%、1.12%、0.71%、1.02%，結(jié)果提示，重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗? 取“2.2.3”項下滴眼劑供試液1份，連續(xù)6 d進(jìn)樣，記錄新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C峰面積，計算其RSD依次為1.05%、0.71%、0.52%、1.28%、1.35%、1.64%，結(jié)果顯示，滴眼劑供試液在6 d內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗? 取已知含量的睛閱滴眼液（1901152）6份，每份2 mL，分別精密加入濃度為60.0、172.6、90.3、45.0、39.0、49.0 μg/mL的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C混合對照品溶液2 mL，混勻，按“2.1.1”項下色譜條件測定，計算各成分的量，6個成分的回收率為96.18%～104.24%，RSD為0.37%～4.03%。

2.3 相對校正因子及耐用性

2.3.1 相對校正因子的計算? 根據(jù)相對校正因子計算公式，以綠原酸為內(nèi)參物，對“2.2.1”項下系列濃度對照品溶液及其所對應(yīng)的峰面積進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計算其余5種綠原酸類成分的相對校正因子。結(jié)果顯示，不同濃度間的相對校正因子RSD均<5%。見表2。

2.3.2 相對校正因子的耐用性? 采用Agilent 1200色譜儀，考察Agela ASB-C18、Agilent SB-C18、YMC ODS-H80 3種色譜柱;并采用Agilent 1200色譜儀和Agela ASB-C18色譜柱，不同流動相磷酸比例（0.35%、0.40%、0.45%）、不同波長（322、327、332 nm）、不同柱溫（20、25、30℃）、分別考察不同流速（0.95、1.00、1.05 mL/min）對相對校正因子的影響。結(jié)果顯示，各成分不同色譜條件下的相對校正因子RSD均<5%，耐用性良好。見表3。

2.4 待測組分色譜峰的定位

實驗中采用Agela ASB-C18、Agilent SB-C18、YMC ODS-H80色譜柱，并采用Agilent 1200色譜儀和Agela ASB-C18色譜柱，對不同流速（0.95、1.00、1.05 mL/min）、不同柱溫（20、25、30℃）條件下綠原酸成分出峰時間的相對保留值（以綠原酸為內(nèi)參物）進(jìn)行計算。結(jié)果顯示，以綠原酸為內(nèi)標(biāo)，在不同色譜條件下其相對保留時間RSD均<3%。

2.5 QAMS法與外標(biāo)法計算結(jié)果的比較

按照“2.1.3”項下供試液的制備方法分別制備樣品溶液，并采用“2.1.1”項下色譜條件測定，以綠原酸作為內(nèi)參物，分別計算藥材及滴眼劑中6種成分的含量，并與外標(biāo)法的計算結(jié)果進(jìn)行比較，計算相對誤差，利用相對誤差評價QAMS法的準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，建立的QAMS法所計算含量的準(zhǔn)確度與外標(biāo)法相當(dāng)，采用t檢驗對兩種方法所計算的結(jié)果進(jìn)行分析，兩者計算含量，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表4。

3 討論

本研究建立以綠原酸為內(nèi)參的QAMS分析方法，并對3批次金銀花、野菊花藥材及10批次睛閱滴眼液進(jìn)行測定和分析，金銀花藥材中均可檢出6種綠原酸類成分，但由于金銀花中異綠原酸B的濃度低于線性范圍的下限，因此并未對金銀花藥材中的異綠原酸B成分進(jìn)行計算和含量比較。比較外標(biāo)法和QAMS法的計算結(jié)果，二者所得含量的相對誤差范圍在-3.32～4.99%之間，t檢驗結(jié)果顯示兩者含量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），提示所建立的以綠原酸為內(nèi)標(biāo)的相對校正因子定量分析方法具有較高的準(zhǔn)確度，且適用于金銀花、野菊花藥材及其滴眼劑制劑。

本研究在對滴眼劑的制備及存儲過程中發(fā)現(xiàn)，綠原酸在溶液中不穩(wěn)定，易受溫度、光照和pH的影響，隨著儲存時間延長，滴眼劑中綠原酸和異綠原酸A含量降低，新綠原酸和隱綠原酸含量增加，但綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸總含量降低不明顯，這與文獻(xiàn)報道的在中性和堿性條件下綠原酸會異構(gòu)化為4-咖啡?？崴岷?-咖啡?？崴?，與異綠原酸A會異構(gòu)化為異綠原酸B和異綠原酸C是一致的[10，18-20]。因此，采用單一的綠原酸并不能很好地反映藥材和制劑的質(zhì)量，建立多成分的含量分析方法，不僅能更好地體現(xiàn)藥材及制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，同時也能較好地監(jiān)測藥材-中間體-制劑質(zhì)量和優(yōu)化生產(chǎn)工藝參數(shù)。

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（收稿日期：2020-01-07）