表達(dá)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒gp90 蛋白的重組馬立克氏病病毒的構(gòu)建及生物學(xué)特性分析

許曾焜，李 凱，劉永振，高 立，劉長(zhǎng)軍，張艷萍，高玉龍，祁小樂(lè)，崔紅玉，王笑梅

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/禽免疫抑制病研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江 哈爾濱 150069）

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生?。≧eticuloendotheliosis，RE）是由RE 病毒（REV）群的反轉(zhuǎn)錄病毒引起的雞、鴨、火雞和其他禽類的一群病理綜合征，包括急性網(wǎng)狀細(xì)胞腫瘤形成、矮小綜合征和淋巴組織與其他組織慢性腫瘤[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，REV 在我國(guó)的流行與分布十分廣泛[3-5]。REV 感染后造成機(jī)體免疫抑制，影響其他疫苗的免疫效果，并致使感染雞易于繼發(fā)細(xì)菌和其它病毒感染，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[6-7]。REV 在現(xiàn)地養(yǎng)殖過(guò)程中，也常與其它禽免疫抑制性病毒以及禽腫瘤病毒（例如雞馬立克氏病病毒、雞傳染性貧血病病毒和禽白血病病毒等）發(fā)生混合感染[8-9]。多種病毒混合感染常發(fā)生協(xié)同致病作用，使得上述疫病防控難度進(jìn)一步增加。

疫苗免疫是防控動(dòng)物疫病的主要手段。然而，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)有效的商品化疫苗用于RE 的預(yù)防。REV 在感染過(guò)程中能夠整合入宿主細(xì)胞基因組中，導(dǎo)致其在雞群中垂直傳播。傳統(tǒng)全病毒弱毒活疫苗的使用將帶來(lái)一定的安全隱患，并存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)。REV 編碼的gp90 蛋白是病毒的保護(hù)性抗原，可以誘導(dǎo)機(jī)體中和抗體的產(chǎn)生[10]?；谠摬《緂p90 蛋白構(gòu)建的基因工程疫苗由于不含全病毒，因此在安全性方面優(yōu)勢(shì)突出，是研制RE 疫苗的一種理想選擇。雞馬立克氏病病毒（MDV）作為一種皰疹病毒，基因組較大且其基因組中含有多個(gè)可供外源基因插入的復(fù)制非必需區(qū)，是研制重組活載體疫苗的理想載體[11]。本研究將REV 的保護(hù)性抗原基因gp90 表達(dá)框架插入血清1 型MDV 弱毒疫苗814 株基因組的US2 基因內(nèi)部，構(gòu)建了表達(dá)REV gp90 蛋白的重組MDV，并對(duì)構(gòu)建的重組病毒r814-gp90 進(jìn)行了生物學(xué)特性的研究，為RE 重組MDV 活載體疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞和病毒 pCAGGS 由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存；pENTR1 載體、克隆有REV HLJR0901 株gp90 基因的重組質(zhì)粒pUC57-gp90、 克隆有Kan/ccdB 基因的重組粘粒p814-5US2KanccdB、克隆有血清1 型MDV 弱毒疫苗814 株基因組的5 個(gè)重組粘粒p814-1、p814-2、p814-3、p814-4、p814-5，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽免疫抑制病研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)構(gòu)建并保存。大腸桿菌EPI300 株購(gòu)自EPICENTRE 公司；雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）由9～10 月齡SPF 雞胚制備。血清1 型MDV 弱毒疫苗814 株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽免疫抑制病研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)鑒定并保存。

1.2 主要試劑 常規(guī)PCR 反應(yīng)酶、限制性內(nèi)切酶、連接酶購(gòu)自TaKaRa 公司；Gateway?LR ClonaseTMII Enzyme Mix 和磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒，均購(gòu)自Invitrogen公司；質(zhì)粒中提試劑盒購(gòu)自QIAGEN 公司；細(xì)胞裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自Gibco 公司；二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自BioFroxx 公司；鼠抗兔IgG-FITC、IRDye-800 標(biāo)記的羊抗兔IgG，購(gòu)自Licor 公司；gp90 單克隆抗體（MAb）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽免疫抑制病研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)制備并保存。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)REV HLJR0901 株（GQ415646）基因組序列，利用Oligo 7.0 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增gp90 基因引物gp90F：5'-GAATTCATGGACTGC CTGACCAACCTG-3'/gp90R：5'-TTTATCGATTCACTT GTGGCGGCCAGCGGT-3'。根據(jù)MDV 814 株US2 基因序列（JF742597），設(shè)計(jì)鑒定重組粘粒及重組病毒引物US2R：5'-AGACATCCAGTCTATTACCTAGTTTTAA C-3'。引物均由吉林省庫(kù)美生物公司合成。

1.4 gp90 基因重組粘粒的構(gòu)建與鑒定 以克隆有REV HLJR0901 株gp90 基因的重組質(zhì)粒pUC57-gp90為模板，利用引物gp90F/gp90R PCR 擴(kuò)增獲得gp90基因。將純化后的gp90 基因經(jīng)EcoR I/ClaI 酶切后克隆入pCAGGS 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAGGS-gp90。將該重組質(zhì)粒經(jīng)SalI/HindIII 酶切后獲得gp90 基因表達(dá)框架，將其經(jīng)SalI/HindIII 酶切后克隆入pEN?TR1 載體，獲得含有g(shù)p90 基因表達(dá)盒的重組質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后命名為pENTR1-gp90。將pEN?TR1-gp90 與重組粘粒p814-5US2KanccdB 均稀釋至300 ng/μL，按1 1的比例各取1 μL混合，加入2 μL的Gateway LR ClonaseTMII Enzyme Mix 進(jìn) 行LR 反 應(yīng)，反應(yīng)條件為：25 ℃作用1 h，加入1 μL 蛋白酶K，置37 ℃作用10 min 終止反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌EPI300 并涂布在氯霉素抗性LB 平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后，提取粘粒，PCR 鑒定構(gòu)建的重組粘粒所包含的814 株基因組的US2 基因中是否插入gp90 基因表達(dá)框架，并對(duì)PCR 產(chǎn)物測(cè)序鑒定，鑒定正確的重組粘粒命名為p814-5-gp90。

1.5 表達(dá)gp90 基因的重組MDV 的拯救 利用試劑盒提取p814-1、p814-2、p814-3、p814-4、p814-5-gp90 5 個(gè)重組粘粒，通過(guò)磷酸鈣法將5 個(gè)粘粒共轉(zhuǎn)染次代CEF 細(xì)胞，4 d～5 d 后，觀察轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是否出現(xiàn)MDV 特異性蝕斑病變。出現(xiàn)蝕斑后在CEF 中連續(xù)傳20 代，收獲第5、10、15、20 代含病毒的細(xì)胞。利用試劑盒提取細(xì)胞總基因組DNA，同時(shí)設(shè)親本病毒814 株基因組DNA 對(duì)照，利用引物gp90F/US2R 經(jīng)PCR 鑒定，并測(cè)序鑒定。鑒定正確的重組病毒命名為r814-gp90。

1.6 重組MDV gp90 蛋白表達(dá)的檢測(cè) 將第20 代重組病毒r814-gp90 株與親本病毒814 株分別接種CEF，培養(yǎng)4 d～5 d 后經(jīng)顯微鏡觀察，比較病毒在感染細(xì)胞中產(chǎn)生的蝕斑，并以gp90 蛋白MAb（1 100）作為一抗，以鼠抗兔IgG-FITC（1 200）作為二抗，采用間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）鑒定gp90 蛋白的表達(dá)。同時(shí)，以gp90 蛋白MAb（1 1 000）作為一抗，以IRDye-800 標(biāo)記的羊抗兔IgG（1 10 000）作為二抗經(jīng)western blot 鑒定。以上試驗(yàn)均以親本814 株接種的CEF 作陰性對(duì)照。

1.7 重組MDV 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將重組病毒r814-gp90 株和親本病毒814 株分別以100 個(gè)蝕斑形成單位（pfu）的劑量接種于48 孔板中的次代CEF，感染后每隔24 h 收集含有病毒的細(xì)胞，持續(xù)至感染后144 h。將各個(gè)時(shí)間點(diǎn)所收集的病毒接種CEF，測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)病毒的pfu，繪制生長(zhǎng)曲線，分析重組病毒r814-gp90株和親本病毒814株在CEF中的生長(zhǎng)特性。

2 結(jié) 果

2.1 重組粘粒的構(gòu)建及鑒定結(jié)果 將PCR 擴(kuò)增獲得的gp90 基因插入到pCAGGS 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAGGS-gp90。通過(guò)酶切獲得gp90 基因表達(dá)盒，并將其克隆至pENTR1 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pENTR1-gp90。通過(guò)LR反應(yīng)，將gp90基因表達(dá)盒替換至重組粘粒p814-5KanccdB 中，構(gòu)建重組粘粒p814-5-gp90。將重組粘粒p814-5-gp90 利用gp90F/US2R 經(jīng)PCR 鑒定。結(jié)果顯示，獲得的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 900 bp（圖1），測(cè)序結(jié)果顯示PCR 產(chǎn)物包含gp90 基因和gp90 基因表達(dá)盒下游polyA 序列。而陰性對(duì)照樣品（親本粘粒p814-5）無(wú)gp90 基因插入序列。以上結(jié)果表明，重組粘粒p814-5-gp90 正確構(gòu)建。

圖1 重組粘粒p814-5-gp90 的PCR 鑒定結(jié)果Fig. 1 Amplification of recombinant fosmid p814-5-gp90 by PCR

2.2 重組MDV r814-gp90 的拯救及PCR 鑒定結(jié)果將p814-1、p814-2、p814-3、p814-4、p814-5-gp90重組粘粒共轉(zhuǎn)染次代CEF，轉(zhuǎn)染后10 d 出現(xiàn)MDV 特異性蝕斑病變，初步證明經(jīng)拯救獲得了重組病毒r814-gp90。將拯救獲得的重組病毒在CEF 中連續(xù)傳20 代，提取第5、10、15、20 代r814-gp90 株基因組DNA，利用引物gp90F/US2R 經(jīng)PCR 鑒定。結(jié)果顯示，PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 900 kb（圖2），測(cè)序結(jié)果顯示插入的gp90 基因表達(dá)框架序列與預(yù)期一致；而親本疫苗814 株基因組DNA 擴(kuò)增結(jié)果為陰性。表明重組病毒r814-gp90 基因組中插入的gp90 基因序列正確，且其能夠穩(wěn)定存在。

圖2 不同代次重組病毒r814-gp90 株的PCR 鑒定結(jié)果Fig. 2 Identification of different generation recombinant virus r814-gp90 by PCR

2.3 重組MDV r814-gp90 株的gp90 蛋白表達(dá)的鑒定結(jié)果 將獲得的第20 代重組病毒r814-gp90 株與親本病毒814 株分別接種CEF，4 d～5 d 后觀察比較病毒在感染細(xì)胞中產(chǎn)生的蝕斑可見(jiàn)，r814-gp90 株在CEF 中產(chǎn)生折光性增強(qiáng)的圓形細(xì)胞，有些變圓細(xì)胞連成葡萄串樣的蝕斑形態(tài)，與親本病毒814 株無(wú)明顯差異。利用IFA 檢測(cè)目的基因gp90 的表達(dá)，結(jié)果顯示，r814-gp90 株感染的細(xì)胞可見(jiàn)綠色熒光信號(hào)，而親本病毒814 株以及沒(méi)有接毒的對(duì)照細(xì)胞均無(wú)熒光（圖3）。Western blot 結(jié)果顯示，r814-gp90 株感染的細(xì)胞中可以檢測(cè)到90 ku 的目的蛋白條帶，與預(yù)期gp90 蛋白大小相符（圖4）。以上結(jié)果表明r814-gp90 株可以在感染細(xì)胞中表達(dá)gp90 蛋白。

圖3 重組病毒的IFA 鑒定結(jié)果Fig. 3 Identification of recombinant virus by IFA

圖4 重組病毒的western blot 鑒定結(jié)果Fig. 4 Identification of recombinant virus by western blot

2.4 重組病毒r814-gp90 株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果將重組病毒r814-gp90 株和親本病毒814 株分別以100 pfu 接種CEF，每24 h 收集細(xì)胞，利用CEF 測(cè)定病毒的PFU，并繪制病毒的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，重組病毒與親本病毒均在感染后120 h 病毒的滴度達(dá)到最高峰，分別為9.15×104pfu/mL 和9.74×104pfu/mL；各時(shí)間點(diǎn)r814-gp90 株的滴度與親本病毒無(wú)明顯差異（p>0.05）（圖5）。表明重組病毒r814-gp90 株在CEF 中的復(fù)制特性與親本病毒一致。

圖5 重組病毒在CEF 中生長(zhǎng)曲線的測(cè)定Fig. 5 Replication kinetics curie of the recombinant virus in CEF

3 討 論

REV 是感染雞、鴨、火雞和其它禽類的一種免疫抑制性和致瘤性反轉(zhuǎn)錄病毒[1-2]。目前普遍是采用類似于禽白血病的凈化策略來(lái)防控RE，然而，在當(dāng)前現(xiàn)地REV 感染陽(yáng)性率如此高的情況下進(jìn)行該病的凈化，難度非常大，而且凈化成本很高，費(fèi)時(shí)耗力。因此，研制一種安全、有效的疫苗對(duì)于RE 的防控具有非常重要的意義。

REV 不僅能夠水平傳播，還能夠通過(guò)雞胚垂直傳播，在實(shí)際生產(chǎn)中其引起的癥狀不典型，檢測(cè)較為困難，容易被忽視，防控RE 有一定難度[12]。本研究將REV 的保護(hù)性抗原基因gp90 表達(dá)框架插入血清1 型MDV 弱毒疫苗814 株基因組中，構(gòu)建了表達(dá)gp90 蛋白的重組MDV r814-gp90。對(duì)該重組病毒進(jìn)行外源蛋白表達(dá)、細(xì)胞病變以及復(fù)制特性分析顯示，r814-gp90 可以在CEF 中穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白gp90；其在CEF 中產(chǎn)生的蝕斑病變以及復(fù)制能力與親本病毒814 株無(wú)顯著性差異。以上結(jié)果表明，r814-gp90 有望作為一種重組MDV 候選活載體疫苗用于RE 的預(yù)防。

近年來(lái)的研究表明，REV 的感染在我國(guó)具有較為廣泛的地理分布。REV 除自身致病外，其還可以引起動(dòng)物機(jī)體的免疫抑制，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)其它疾病的易感性增加，甚至造成免疫失敗現(xiàn)象[12]。REV 與其它病毒經(jīng)常發(fā)生混合感染，進(jìn)一步增加了疾病的防控難度。多項(xiàng)研究顯示，REV 與MDV 的混合感染會(huì)發(fā)生協(xié)同致病作用，導(dǎo)致感染雞腫瘤的發(fā)生率升高；REV 與其它病毒的混合感染還會(huì)降低MDV 疫苗的免疫效果[9]。814 疫苗株作為一種血清1 型MDV 弱毒疫苗，具有良好的安全性和有效性，本研究采用該株病毒為載體構(gòu)建了表達(dá)REV 保護(hù)性抗原gp90 蛋白的重組MDV r814-gp90，也同樣有望用于MD 的預(yù)防。綜上所述，本研究構(gòu)建的重組MDV 和r814-gp90 有潛力作為一種候選二聯(lián)疫苗用于RE 與MD 的預(yù)防。